α2-巨球蛋白減輕X射線所致人骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞成骨分化障礙*

劉 仰， 孔祥波， 李 潔， 陳雪英， 溫創(chuàng)宇， 房思煉△

(中山大學(xué)附屬第六醫(yī)院 1口腔頜面外科， 2廣東省胃腸病學(xué)研究所， 廣東 廣州 510655； 3中山大學(xué)孫逸仙紀(jì)念醫(yī)院口腔科， 廣東 廣州 510120)

α2-巨球蛋白減輕X射線所致人骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞成骨分化障礙*

劉 仰1， 孔祥波3， 李 潔1， 陳雪英1， 溫創(chuàng)宇2， 房思煉1△

(中山大學(xué)附屬第六醫(yī)院1口腔頜面外科，2廣東省胃腸病學(xué)研究所， 廣東 廣州 510655；3中山大學(xué)孫逸仙紀(jì)念醫(yī)院口腔科， 廣東 廣州 510120)

目的初步探討α2-巨球蛋白(α2M)對X射線導(dǎo)致的人骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(hBMMSCs)成骨分化障礙的作用。方法體外培養(yǎng)hBMMSCs，取第4代細(xì)胞經(jīng)8 Gy X射線照射后，進(jìn)行成骨誘導(dǎo)并以0.5和1.0 g/L α2M分別作用于照射后的hBMMSCs。成骨誘導(dǎo)的第7天檢測堿性磷酸酶(ALP)活性，RT-qPCR法檢測Runt相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子2(RUNX2)的mRNA表達(dá)；成骨誘導(dǎo)的第14天采用Western blot檢測骨甘氨酸(OGN)的蛋白表達(dá)；成骨誘導(dǎo)的第21天采用茜素紅染色法檢測鈣結(jié)節(jié)的形成情況。此外，正常培養(yǎng)的hBMMSCs于8 Gy X射線照射后加入α2M作用24 h，提取細(xì)胞檢測超氧化物歧化酶(SOD)活力，Western blot檢測含錳超氧化物歧化酶 (MnSOD)的蛋白表達(dá)。結(jié)果hBMMSCs經(jīng)8 Gy X射線照射后給予0.5和1.0 g/L α2M處理，與未加入α2M的單獨(dú)照射組比較，ALP活性、RUNX2 的mRNA表達(dá)、OGN和MnSOD的蛋白表達(dá)及SOD活力均升高，鈣結(jié)節(jié)形成增多。結(jié)論α2M可明顯提高放射損傷后hBMMSCs的成骨分化能力，上調(diào)SOD活力和MnSOD的蛋白表達(dá)水平。

放射損傷； α2-巨球蛋白； 人骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞； 成骨分化

放射性頜骨壞死(osteoradionecrosis of the jaws，ORNJ)是口腔頜面-頭頸腫瘤經(jīng)放射治療后所引發(fā)的嚴(yán)重并發(fā)癥之一，其發(fā)病率約為3.93%[1]。ORNJ最終會導(dǎo)致口腔頜面部軟硬組織纖維化、竇道形成和死骨暴露等[2-3]，嚴(yán)重影響患者的生存質(zhì)量。人骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(human bone marrow mesenchymal stem cells，hBMMSCs)是骨組織放射損傷的主要靶細(xì)胞之一。研究顯示，高劑量X射線可使hBMMSCs細(xì)胞增殖率降低，并造成細(xì)胞DNA損傷和基因組的不穩(wěn)定性[4]，同時顯著降低其成骨能力[5]。在前期研究中，本課題組應(yīng)用蛋白質(zhì)組學(xué)法證實(shí)α2-巨球蛋白(α2-macroglobulin，α2M)為ORNJ患者血清中一種差異性表達(dá)蛋白，并通過ELISA法發(fā)現(xiàn)鼻咽癌放療患者血清α2M水平與放療劑量具有正相關(guān)性，這提示了血清中α2M與頜骨電離輻射損傷有著密切的關(guān)系[6-7]。α2M是血漿中含量豐富的大分子糖蛋白，也是一種廣譜的蛋白酶抑制劑，可結(jié)合多種細(xì)胞因子和生長因子，發(fā)揮各種生物功能[8]。同時，α2M具有抗輻射損傷作用[9]。本研究通過在電離輻射后向hBMMSCs培養(yǎng)基中加入不同濃度的α2M，初步探究α2M對放射受損hBMMSCs成骨分化能力的影響及作用機(jī)制，為α2M在ORNJ的診斷和治療中提供理論依據(jù)。

材 料 和 方 法

1主要試劑和儀器

α2-巨球蛋白(ENZO)；成人骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞、成骨誘導(dǎo)分化培養(yǎng)基和茜素紅溶液(廣州賽業(yè)生物科技有限公司)；胎牛血清(Gibco)；堿性磷酸酶(alkaline phosphatase，ALP)和超氧化物歧化酶(supero-xide dismutase，SOD)測定試劑盒(南京建成生物工程研究所)；BCA蛋白濃度測定試劑盒(Pierce)；RNA提取試劑Trizol(Life Technologies)；反轉(zhuǎn)錄和實(shí)時熒光定量PCR試劑盒(TaKaRa)；PCR引物(上海生工生物工程股份有限公司)；抗骨甘氨酸(osteoglycin, OGN)抗體(Santa Cruz)；抗GAPDH和含錳超氧化物歧化酶(manganese supero-xide dismutase, MnSOD)抗體(Proteintech)。倒置顯微鏡(Nikon)；酶標(biāo)儀(Thermo)；實(shí)時熒光定量PCR儀(Roche)；電泳槽、轉(zhuǎn)印槽和化學(xué)發(fā)光成像系統(tǒng)(Bio-Rad);X射線輻照儀(Rad Source)。

2主要方法

2.1細(xì)胞培養(yǎng) hBMMSCs于含10%胎牛血清、1%青-鏈霉素的高糖DMEM培養(yǎng)基中， 37 ℃、5% CO2、飽和濕度條件下培養(yǎng)，每3 d換液 1 次，待細(xì)胞生長達(dá)到80%進(jìn)行傳代。取第4代細(xì)胞進(jìn)行相關(guān)實(shí)驗。

2.2細(xì)胞照射處理 hBMMSCs生長達(dá)到70%時進(jìn)行X射線照射，儀器選用中山大學(xué)醫(yī)學(xué)實(shí)驗中心Rad Source RS2000 型X射線輻照儀，工作電壓160 kV，工作電流25 mA (0.3 mm銅合金過濾片，加反射體)，劑量率1.24 Gy/min。所有樣品均在室溫下進(jìn)行照射。

2.3成骨誘導(dǎo)分化 將完全培養(yǎng)基更換為成骨誘導(dǎo)分化培養(yǎng)基(高糖DMEM+10%胎牛血清，1×105U/L青-鏈霉素，50 mg/L抗壞血酸，10 mmol/L β-甘油磷酸鈉，1 μmol/L地塞米松)繼續(xù)培養(yǎng)，每3 d換液 1 次。

2.4α2M溶液的配制 將1 mg α2M溶于0.5 mL滅菌ddH2O，配制濃度為2.0 g/L的α2M溶液，置于-20 ℃保存。

2.5實(shí)驗分組 取第4代hBMMSCs，將其隨機(jī)分成4組，分別為空白對照(blank control)組、8 Gy X射線照射(8 Gy)組、0.5 g/L α2M和1.0 g/L α2M處理的X射線照射組。Blank control組不給予處理因素，其它3組均進(jìn)行8 Gy的X射線照射，0.5 g/L α2M和1.0 g/L α2M處理的X射線照射組分別在成骨誘導(dǎo)培養(yǎng)基加入α2M至終濃度為0.5 g/L、1.0 g/L。

2.6細(xì)胞形態(tài)觀察 采用倒置顯微鏡每天觀察hBMMSCs的生長情況和形態(tài)學(xué)改變，并拍照記錄。

2.7ALP活性的檢測 hBMMSCs以每孔4×104個接種于12孔板中。成骨誘導(dǎo)第7天，采用PBS洗滌細(xì)胞2次后，每孔加入200 μL 1%的Triton X-100裂解液覆蓋細(xì)胞，4 ℃裂解過夜。細(xì)胞裂解完成后從中取30 μL裂解液，按堿性磷酸酶測定試劑盒說明書進(jìn)行操作，使用酶標(biāo)儀于520 nm波長處測定吸光度(A)值。另取10 μL裂解液采用BCA法測定各組樣品的蛋白濃度，計算每克蛋白的堿性磷酸酶活性。

2.8SOD活力的檢測 hBMMSCs以每孔4×104個接種于12孔板中。照射后繼續(xù)采用完全培養(yǎng)基培養(yǎng)24 h，PBS洗滌2次，每孔加入200 μL RIPA裂解液覆蓋細(xì)胞，細(xì)胞裂解完成后從中取40 μL裂解液，按超氧化物歧化酶測定試劑盒說明書進(jìn)行操作，使用酶標(biāo)儀于450 nm波長處測定吸光度(A)值。另取10 μL裂解液采用BCA法測定各組樣品的蛋白濃度，計算每克蛋白的超氧化物歧化酶活力。

2.9RT-qPCR檢測Runt相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子2(runt-rela-ted transcription factor-2，RUNX2)的mRNA表達(dá) hBMM-SCs以每孔4×105個接種于6孔板中，成骨誘導(dǎo)第7天，PBS洗滌細(xì)胞2次后采用Trizol提取細(xì)胞總RNA，定量后將RNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA，使用實(shí)時熒光定量PCR系統(tǒng)進(jìn)行反應(yīng)，選擇20 μL反應(yīng)體系：SYBR Green 10 μL、上、下游引物(10 μmol/L)各0.8 μL、DNA模板2 μL、dH2O 6.4 μL。反應(yīng)條件為：95 ℃ 30 s，1個循環(huán)；95 ℃ 5 s、60 ℃ 30 s，重復(fù)40個循環(huán)。每組樣品設(shè)置3個復(fù)孔。使用GAPDH進(jìn)行校正，參照2-ΔΔCt相對定量法，計算目的基因的相對表達(dá)量。所用引物序列見表1。

表1 引物序列

2.10Western blot檢測OGN和MnSOD的蛋白表達(dá) hBMMSCs以每孔4×105個接種于6孔板中，分別在成骨誘導(dǎo)的第14天和照射后完全培養(yǎng)基培養(yǎng)24 h時，采用RIPA裂解液提取細(xì)胞總蛋白，BCA法測定蛋白濃度，配平。將樣品加入制備好的SDS-PAGE凝膠中，恒壓120 V電泳約1.5 h。電泳完成后，恒流280 mA將蛋白轉(zhuǎn)移至PVDF膜上，約90 min。5%脫脂奶粉溶液封閉1 h，鼠抗人OGN、GAPDH和兔抗人MnSOD的 I 抗孵育過夜。TBST洗膜3次，山羊抗鼠、兔 II 抗孵育1 h。TBST洗膜3次后，化學(xué)發(fā)光法進(jìn)行顯影。使用ImageJ軟件對條帶灰度進(jìn)行分析，根據(jù)目的蛋白凈灰度值與GAPDH凈灰度值比值計算出目的蛋白相對表達(dá)量。

2.11茜素紅染色 hBMMSCs以每孔4×104個接種于12孔板中，成骨誘導(dǎo)第21天，吸走成骨誘導(dǎo)分化完全培養(yǎng)基，PBS洗滌2次，每孔加入1 mL 4%中性甲醛溶液，固定30 min后吸走甲醛溶液，PBS洗滌2次，每孔加入0.5 mL茜素紅染液，5 min后吸走茜素紅染液，PBS洗滌3次，置于顯微鏡下觀察成骨染色效果。

3統(tǒng)計學(xué)處理

采用SPSS 20.0統(tǒng)計軟件進(jìn)行分析，數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(mean±SD)表示，多組間采用單因素方差分析(one-way ANOVA)，組間兩兩比較采用Bonferroni校正的t檢驗，以P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

結(jié) 果

1hBMMSCs的形態(tài)學(xué)觀察和成骨誘導(dǎo)分化

hBMMSCs接種6 h后，約70%細(xì)胞可貼壁，1 d后可見貼壁細(xì)胞呈長梭型和紡錘型，培養(yǎng)3 d后可見細(xì)胞生長呈魚群狀和漩渦狀，細(xì)胞基本鋪滿培養(yǎng)瓶底，細(xì)胞生長融合至80%～90%，可進(jìn)行傳代，見圖1。hBMMSCs成骨誘導(dǎo)第3天，細(xì)胞形狀變小，由紡錘型變?yōu)榱⒎叫?成骨誘導(dǎo)第7天，細(xì)胞形態(tài)呈鋪路石樣外觀，見圖2;成骨誘導(dǎo)第21天，使用茜素紅溶液進(jìn)行染色，可見紅色鈣結(jié)節(jié)形成，見圖6A。

Figure 1. The morphology of hBMMSCs (×100).

圖1hBMMSCs細(xì)胞形態(tài)

Figure 2. The morphology of hBMMSCs on day 7 after osteogenic induction (×100).

圖2hBMMSCs成骨誘導(dǎo)第7天的細(xì)胞形態(tài)

2α2M對放射后hBMMSCs的ALP活性的影響

經(jīng)8Gy X射線照射后，hBMMSCs在成骨誘導(dǎo)第7天的ALP活性相對空白對照組顯著下降(P<0.01)；與8 Gy組比較，照射后加入0.5和1.0 g/L α2M處理后的ALP活性明顯升高(P<0.01)，見圖3。

3α2M對放射后hBMMSCs中RUNX2的mRNA水平的影響

與空白對照組比較，經(jīng)8 Gy X射線照射后，hBMMSCs在成骨誘導(dǎo)第7天的RUNX2 mRNA水平明顯降低(P<0.01)；照射后加入0.5和1.0 g/Lα2M處理，RUNX2 mRNA水平均較8 Gy組上調(diào)，其中1.0 g/L α2M 處理組上調(diào)更加明顯(P<0.01) ，見圖4。

Figure 3. The ALP activity in the hBMMSCs treated with α2M after radiation. Mean±SD.n=3.**P<0.01vsblank control group;##P<0.01vs8 Gy group.

圖3α2M對放射后hBMMSCs的ALP活性的影響

Figure 4. The mRNA level of RUNX2 in the hBMMSCs treated with α2M after radiation was detected by RT-qPCR. Mean±SD.n=3.**P<0.01vsblank control group;##P<0.01vs8 Gy group.

圖4α2M對放射后hBMMSCs中RUNX2的mRNA水平的影響

4α2M對放射后hBMMSCs中OGN蛋白表達(dá)的影響

經(jīng)8 Gy X射線照射后，hBMMSCs在成骨誘導(dǎo)第14天的OGN蛋白水平相對空白對照組顯著下降(P<0.01)；與8 Gy組比較，照射后加入0.5和1.0 g/L α2M處理的細(xì)胞OGN表達(dá)均有回升，其中1.0 g/L α2M 處理組上升更加明顯(P<0.01)，見圖5。

Figure 5. The protein expression of OGN in the hBMMSCs treated with α2M after radiation was detected by Western blot. Mean±SD.n=3.**P<0.01vsblank control group;##P<0.01vs8 Gy group.

圖5α2M對放射后hBMMSCs中OGN的蛋白表達(dá)的影響

5α2M對放射后hBMMSCs鈣結(jié)節(jié)形成的影響

成骨誘導(dǎo)的第21天，茜素紅染色結(jié)果顯示，8 Gy照射組鈣結(jié)節(jié)形成較空白對照組明顯減少，照射后加入0.5和1.0 g/L α2M，鈣結(jié)節(jié)增多，染色程度增強(qiáng)，見圖6。

Figure 6. The calcium nodules of hBMMSCs treated with α2M after radiation determined by alizarin red staining(×100). A: blank control group; B: 8 Gy group; C: 8 Gy+0.5 g/L α2M group; D: 8 Gy+1.0 g/L α2M group.

圖6茜素紅染色檢測α2M作用于放射后hBMMSCs鈣結(jié)節(jié)形成情況

6α2M對放射后hBMMSCs的SOD活力和MnSOD蛋白表達(dá)的影響

經(jīng)8 Gy X射線照射后采用完全培養(yǎng)基培養(yǎng)細(xì)胞24 h，hBMMSCs的SOD活力和MnSOD蛋白表達(dá)相對空白對照組明顯下降(P<0.01)；照射后加入0.5和1.0 g/L α2M處理，SOD活力和MnSOD蛋白水平表達(dá)均較8 Gy組升高(P<0.05)，見圖7、8。

Figure 7. The SOD activity in the hBMMSCs treated with α2M after radiation. Mean±SD.n=3.**P<0.01vsblank control group;#P<0.05vs8 Gy group.

圖7α2M對放射后hBMMSCs的SOD活力的影響

Figure 8. The protein expression of MnSOD in the hBMMSCs treated with α2M after radiation was detected by Western blot. Mean±SD.n=3.**P<0.01vsblank control group;#P<0.05vs8 Gy group.

圖8α2M對放射后hBMMSCs的MnSOD蛋白表達(dá)的影響

討 論

骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞是一類具有多向分化潛能的前體細(xì)胞，在不同條件的刺激誘導(dǎo)下可向成骨細(xì)胞、脂肪細(xì)胞和軟骨細(xì)胞等不同成體細(xì)胞分化[10]。骨骼是一種不斷自我更新和重建的組織，骨組織的更新和形成過程中包括有hBMMSCs定向分化為成骨祖細(xì)胞以及逐漸向成熟的成骨細(xì)胞分化，成骨細(xì)胞在重塑過程中起著重要作用。有研究表明，在骨重建過程中如果骨形成與骨吸收的平衡被打破，如受到外界放射線的輻射，則會導(dǎo)致骨缺損[11]。α2M作為血漿中重要的大分子糖蛋白，具有多種生物學(xué)功能，可參與骨組織代謝[8]。另外，α2M具有重要的抗輻射保護(hù)作用[12]。

本研究以hBMMSCs為模型，進(jìn)行高劑量X射線照射后分別將0.5 g/L和1.0 g/L的α2M作用于hBMMSCs，檢測α2M對hBMMSCs放射損傷后成骨分化能力的影響。ALP是骨形成的早期標(biāo)志物，也是細(xì)胞骨化必需的酶之一，其活性可以反映細(xì)胞成骨分化的程度[13-14]。RUNX2是調(diào)控成骨分化早期階段的重要轉(zhuǎn)錄因子，可以促進(jìn)骨組織的形成和重建[15-16]。OGN是骨組織中的一種分泌蛋白，在抑制破骨細(xì)胞和誘導(dǎo)異位骨形成中起著重要作用，亦稱為骨誘導(dǎo)因子，能與TFGβ1或TGFβ2結(jié)合后誘導(dǎo)骨生成[17-18]。鈣結(jié)節(jié)是成骨細(xì)胞經(jīng)過較長時間誘導(dǎo)形成的礦化產(chǎn)物，代表成骨分化的最后階段[19]。因此，本研究對hBMMSCs成骨分化能力采用上述4項指標(biāo)進(jìn)行綜合評價。

在本實(shí)驗中，hBMMSCs經(jīng)8 Gy X射線照射后進(jìn)行成骨分化誘導(dǎo)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)細(xì)胞ALP活性、RUNX2的mRNA水平和OGN的蛋白水平均顯著降低，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義，鈣結(jié)節(jié)形成減少，這提示放射線對hBMMSCs的成骨分化能力具有抑制作用，這與Wang等[5]對BMMSCs應(yīng)用放射線照射后的研究結(jié)果一致，均表明放射損傷的hBMMSCs成骨潛能顯著降低，提示可能在干細(xì)胞水平發(fā)生了成骨損傷。照射后在成骨誘導(dǎo)分化培養(yǎng)基中分別加入0.5和1.0 g/L的α2M后繼續(xù)成骨誘導(dǎo)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)與未加入α2M的單獨(dú)照射組相比，hBMMSCs的ALP活性增加、RUNX2的mRNA水平、OGN的蛋白水平均有上調(diào)，同時鈣結(jié)節(jié)增多，染色程度增強(qiáng)。這表明α2M能緩解X射線對hBMMSCs的損傷，提高其受損的成骨分化能力，充分說明α2M對hBMMSCs在放射損傷條件下的成骨分化能力具有明顯保護(hù)作用。

Hou 等[20]通過免疫熒光檢測發(fā)現(xiàn)，hBMMSCs經(jīng)6 Gy X射線照射后，細(xì)胞內(nèi)的活性氧簇(reactive oxygen species，ROS)水平升高，進(jìn)一步證實(shí)電離輻射提高ROS水平，造成細(xì)胞的DNA損傷，從而破壞干細(xì)胞的多向分化潛能。SOD是一種重要的清除體內(nèi)自由基的抗氧化酶，被稱作機(jī)體抗氧化的第一道防線，具有明顯的抗炎癥、抗感染和抑制脂質(zhì)過氧化反應(yīng)的效應(yīng)[21-22]。在本實(shí)驗中，hBMMSCs經(jīng)8 Gy X射線照射后加入α2M，24 h后測得SOD活力和MnSOD蛋白水平表達(dá)明顯升高，提示α2M可以通過降低射線照射hBMMSCs后引起的氧化應(yīng)激，從而起到抗輻射損傷的作用，也是本實(shí)驗α2M提高放射損傷的hBMMSCs成骨分化能力的機(jī)理之一。

綜上所述，本研究初步驗證了應(yīng)用α2M能減輕骨組織放射損傷的可能性，我們將開展更系統(tǒng)的實(shí)驗并深入探討其具體作用機(jī)制，為α2M在ORNJ預(yù)防和治療中的應(yīng)用提供理論依據(jù)。

[1] Wang TH, Liu CJ, Chao TF, et al. Risk factors for and the role of dental extractions in osteoradionecrosis of the jaws: a national-based cohort study[J]. Head Neck, 2017, 39(7):1313-1321.

[2] Nadella KR, Kodali RM, Guttikonda LK, et al. Osteoradionecrosis of the jaws: clinico-therapeutic management: a literature review and update[J]. J Maxillofac Oral Surg, 2015,14(4):891-901.

[3] Dhanda J, Pasquier D, Newman L, et al. Current concepts in osteoradionecrosis after head and neck radiotherapy[J]. Clin Oncol, 2016, 28(7):459-466.

[4] 周妮娜， 張利英， 劉永琦， 等. 不同X線劑量照射對骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的增殖及DNA損傷的影響[J]. 醫(yī)學(xué)研究生學(xué)報, 2016, 29(9):923-927.

[5] Wang Y, Zhu G, Wang J, et al. Irradiation alters the differentiation potential of bone marrow mesenchymal stem cells[J]. Mol Med Rep, 2016, 13(1):213-223.

[6] Fang S, Chen W, Wang S, et al. Proteomic analysis of serum in patients with osteoradionecrosis of the jaws[J]. Int Dent J, 2012, 62(Suppl 1):24.

[7] Fang S, Kong X, Chen W, et al. Identification of differential proteins that related to bone metabolism in the serum of ORNJ patients[J]. Int Dent J, 2012, 62(Suppl 1):25.

[8] Rehman AA, Ahsan H, Khan FH. α2-macroglobulin: a physiological guardian[J]. J Cell Physiol, 2013, 228(8):1665-1675.

[9] Chen X, Kong X, Zhang Z, et al. Alpha-2-macroglobulin as a radioprotective agent: a review[J]. Chin J Cancer Res, 2014, 26(5):611-621.

[10] Moroni L, Fornasari PM. Human mesenchymal stem cells: a bank perspective on the isolation, characterization and potential of alternative sources for the regeneration of musculoskeletal tissues[J]. J Cell Physiol, 2013, 228(4):680-687.

[11] Wissing MD. Chemotherapy- and irradiation-induced bone loss in adults with solid tumors[J]. Curr Osteoporos Rep, 2015, 13(3):140-145.

[12] Mirjana M, Goran P, Nevena G, et al. The rat acute-phase protein α2-macroglobulin plays acentral role in amifostine-mediated radioprotection[J]. J Radiol Prot, 2010, 30(3):567-583.

[13] Millán JL. The role of phosphatases in the initiation of skeletal mineralization[J]. Calcif Tissue Int, 2013, 93(4):299-306.

[14] Halling Linder C, Enander K, Magnusson P. Glycation contributes to interaction between human bone alkaline phosphatase and collagen type I[J]. Calcif Tissue Int, 2016, 98(3):284-293.

[15] Henriquez B, Hepp M, Merino P, et al. C/EBPβ binds the P1 promoter of theRunx2 gene and up-regulatesRunx2 transcription in osteoblastic cells[J]. J Cell Physiol, 2011, 226(11):3043-3052..

[16] Qin X, Jiang Q, Matsuo Y, et al. Cbfb regulates bone development by stabilizing runx family proteins[J]. J Bone Miner Res, 2015, 30(4):706-714.

[17] Tagliaferri C, Wittrant Y, Davicco MJ, et al. Muscle and bone, two interconnected tissue[J]. Ageing Res Rev, 2015, 21:55-70.

[18] Tanaka K, Matsumoto E, Higashimaki Y, et al. Role of osteoglycin in the linkage between muscle and bone[J]. J Biol Chem, 2012, 287(15):11616-11628.

[19] Gregory CA, Gunn WG, Peister A, et al. An Alizarin red-based assay of mineralization by adherent cells in culture: comparison with cetylpyridinium chloride extraction[J]. Anal Biochem, 2004, 329(1):77-84.

[20] Hou J, Han ZP, Jing YY, et al. Autophagy prevents irradiation injury and maintains stemness through decreasing ROS generation in mesenchymal stem cells[J]. Cell Death Dis, 2013,10(4):e844.

[21] Weekley CM, Kenkel I, Lippert R, et al. Cellular fates of manganese(II) pentaazamacrocyclic superoxide dismutase (SOD) mimetics: fluorescently labeled MnSOD mimetics, X-ray absorption spectroscopy, and X-ray fluorescence microscopy studies[J]. Inorg Chem, 2017, 56(11):6076-6093.

[22] M Fetherolf M, Boyd SD, Winkler DD, et al. Oxygen-dependent activation of Cu, Zn-superoxide dismutase-1[J]. Metallomics, 2017, 9(8):1047-1059.

(責(zé)任編輯： 林白霜， 余小慧)

α2-macroglobulin alleviates X-ray induced obstacle on osteogenic differentiation of human bone marrow mesenchymal stem cells

LIU Yang1, KONG Xiang-bo3, LI Jie1, CHEN Xue-ying1, WEN Chuang-yu2, FANG Si-lian1

(1DepartmentofOralandMaxillofacialSurgery,2GuangdongInstituteofGastroenterology,TheSixthAffiliatedHospitalofSunYat-senUniversity,Guangzhou510655,China;3DepartmentofStomatology,SunYat-senMemorialHospital,SunYat-senUniversity,Guangzhou510120,China.E-mail:fangsilian@126.com)

AIM: To evaluate the effect of α2-macroglobulin (α2M) against X-ray induced obstacle on osteogenic differentiation of human bone marrow mesenchymal stem cells (hBMMSCs).METHODShBMMSCs were culturedinvitro. The 4th generation of hBMMSCs was irradiated with 8 Gy X-ray, then induced osteogenic differentiation and treated with different concentrations of α2M (0.5 and 1.0 g/L). The alkaline phosphatase (ALP) activity and the mRNA expression of runt-related transcription factor-2 (RUNX2) were detected on day 7 after osteogenic induction. The protein expression of osteoglycin (OGN) was evaluated by Western blot on day 14 after osteogenic induction. The formation of calcium nodules was detected by alizarin red staining on day 21 after osteogenic induction. The activity of superoxide dismutase (SOD) and the protein expression of MnSOD of irradiated hBMMSCs with 8 Gy X-ray were determined at 24 h after α2M treatment.RESULTSCompared with 8 Gy X-ray group, the activity of ALP, the mRNA expression of RUNX2, the protein expression of OGN and MnSOD, as well as SOD activity were higher than those in the hBMMSCs treated with α2M at 0.5 and 1.0 g/L after 8 Gy X-ray irradiation, and the calcium nodules were also increased.CONCLUSIONα2M significantly improves the osteogenic differentiation ability, the SOD activity and MnSOD protein expression of hBMMSCs after radiation injury.

Radiation injury; α2-macroglobulin; Human bone marrow mesenchymal stem cells; Osteogenic differentiation

1000- 4718(2017)11- 2032- 06

2017- 07- 14

2017- 09- 28

廣東省自然科學(xué)基金資助項目(No. 2015A030313064)；廣東省科技計劃(No. 2014A020212127)

△通訊作者 Tel: 020-38254035；E-mail: fangsilian@126.com

R818; R363

A

10.3969/j.issn.1000- 4718.2017.11.018