骨折修復(fù)過(guò)程中骨形態(tài)發(fā)生蛋白 2 對(duì)趨化因子 12表達(dá)的調(diào)控及其意義

康凱 白東昱 薛建利 欒彥軍 劉延雄

骨折修復(fù)過(guò)程中骨形態(tài)發(fā)生蛋白 2 對(duì)趨化因子 12表達(dá)的調(diào)控及其意義

康凱 白東昱 薛建利 欒彥軍 劉延雄

目的 探討骨形態(tài)發(fā)生蛋白 2 ( bone morphogenetic protein，BMP2 ) 對(duì)趨化因子 12 ( chemokine C-X-C motif-ligand-12，CXCL12 ) 表達(dá)調(diào)節(jié)及其在骨折修復(fù)過(guò)程中的意義。方法 構(gòu)建 BMP2 敲除鼠 BMP2cKO/+和 BMP2cKO/cKO。免疫組化分析正常小鼠、BMP2cKO/+小鼠及 BMP2cKO/cKO小鼠脛骨骨折模型中骨內(nèi)膜細(xì)胞 CXCL12的表達(dá)及其隨時(shí)間的變化。實(shí)時(shí)定量 PCR ( RT-qPCR ) 比較對(duì)照組與 BMP2cKO/+小鼠骨內(nèi)膜細(xì)胞及其分化細(xì)胞CXCL12、骨鈣蛋白、α-SMA 表達(dá)差異。結(jié)果 BMP2cKO/+和 BMP2cKO/cKO小鼠 BMP2 顯著低于對(duì)照組。小鼠骨折修復(fù)過(guò)程中骨內(nèi)膜細(xì)胞和成骨細(xì)胞 CXCL12 表達(dá)明顯升高，且表達(dá) CXCL12 細(xì)胞先增多再減少；BMP2cKO/+小鼠骨折修復(fù)過(guò)程中表達(dá) CXCL12 的骨內(nèi)膜細(xì)胞和成骨細(xì)胞逐漸增加。BMP2cKO/+小鼠分離的骨內(nèi)膜細(xì)胞CXCL12 表達(dá)顯著高于正常小鼠。在誘導(dǎo)分化的小鼠骨內(nèi)膜細(xì)胞中添加 rhBMP2，CXCL12 的表達(dá)減少，骨鈣蛋白和 α-SMA 表達(dá)顯著增加。誘導(dǎo)分化的 BMP2cKO/cKO骨內(nèi)膜細(xì)胞 CXCL12 表達(dá)顯著高于正常小鼠，而骨鈣蛋白的表達(dá)則顯著降低。CXCL12 受體拮抗劑 AMD3100 處理誘導(dǎo)分化的 BMP2cKO/cKO骨內(nèi)膜細(xì)胞，骨鈣蛋白和α-SMA 表達(dá)顯著增加。結(jié)論 骨折修復(fù)過(guò)程中，BMP2 下調(diào) CXCL12 的表達(dá)有助于成骨細(xì)胞的分化從而促進(jìn)骨折的修復(fù)。

骨形態(tài)發(fā)生蛋白 2；趨化因子 12；骨折修復(fù)；骨內(nèi)膜細(xì)胞

骨折修復(fù)是由大量細(xì)胞因子調(diào)控的復(fù)雜的骨再生過(guò)程[1]。骨形態(tài)發(fā)生蛋白 ( bone morphogenetic protein，BMP ) 在骨折修復(fù)過(guò)程中發(fā)揮重要作用。骨形態(tài)發(fā)生蛋白 2 ( BMP2 ) 是目前公認(rèn)的成骨細(xì)胞轉(zhuǎn)化因子，能誘導(dǎo)特定的骨膜祖細(xì)胞不可逆地分化為軟骨和骨細(xì)胞[2]，有利于骨折修復(fù)。趨化因子 12( chemokine C-X-C motif-ligand-12，CXCL12 )，又稱(chēng)基質(zhì)細(xì)胞衍生因子-1 ( stroma cell derived factor，SDF-1 )，它與其細(xì)胞表面受體 CXCR4 / CXCR7 結(jié)合，激活多種細(xì)胞信號(hào)通路發(fā)揮多種生理功能，尤其是能誘導(dǎo)造血干細(xì)胞和間充質(zhì)干細(xì)胞的修復(fù)、再生[3]。研究表明，BMP9 依賴(lài)的成骨分化受 CXCL12調(diào)節(jié)[4]。CXCL12 與 BMP2 在小鼠成肌細(xì)胞系 C2C12成骨分化過(guò)程中共同發(fā)揮作用[5]。但是 CXCL12 與BMP2 在體內(nèi)相互作用機(jī)制尚未闡明。由此，本研究比較 BMP2 基因敲除小鼠和對(duì)照組的骨折修復(fù)過(guò)程中，BMP2 和 CXCL12 表達(dá)細(xì)胞及其變化，探討兩者在骨折修復(fù)中的相互作用機(jī)制。

材料與方法

一、試劑與儀器

CXCL12 抗體、骨鈣蛋白抗體、α-SMA 抗體、IgG 兔單克隆抗體、Fab 鼠單克隆抗體均購(gòu)自于上海優(yōu)寧維公司；重組小鼠 BMP2 購(gòu)于 Santa cruz 公司；AMD3100 購(gòu)于 Sigma 公司；RNA 抽提試劑盒、逆轉(zhuǎn)錄試劑盒和 SYBR GreenI 購(gòu)于 TaKaRa 公司；StemXVivo 成骨細(xì)胞培養(yǎng)液購(gòu)自于 R amp; D 公司；蛋白裂解液購(gòu)自碧云天公司。

熒光定量 PCR 儀 ( Biorad CFX96 )；IQ5 TM PCR儀；高速冷凍離心機(jī) ( eppendorf 5427R )；生物安全柜 ( ESCO )；移液器 ( eppendorf )；Biophotometer 分光光度計(jì) ( eppendorf )；Leica EG1160 全自動(dòng)石蠟包埋機(jī)；Leisa RM2135 切片機(jī)，德國(guó)西門(mén)子顯微 CT機(jī)，Olympus 顯微鏡，Biorad 凝膠成像系統(tǒng)。

二、方法

1. BMP2 敲除鼠模型的構(gòu)建：帶有 flox 標(biāo)簽的BMP2 ( BMP2flox) 小鼠由第四軍醫(yī)大學(xué)提供。C57B /L6 遺傳標(biāo)記 BMP2flox混合型小鼠雜交四代后產(chǎn)生純種 C57B / L6 BMP2flox/flox小鼠。BMP2 敲除鼠模型的構(gòu)建：BMP2flox/flox雌性小鼠與帶有 Prx1 增強(qiáng) Cre的 C57B / L6 轉(zhuǎn)基因小鼠 ( Prx1-Cre 小鼠 ) 雜交產(chǎn)生 BMP2cKO/+敲除鼠。與小鼠相比，BMP2cKO/+敲除鼠沒(méi)有明顯的表型差異，其尺寸大小，健康狀況，生育能力以及年齡基本相似。BMP2cKO/+敲除鼠與BMP2flox/flox鼠雜交產(chǎn)生 BMP2cKO/cKO敲除鼠。對(duì)照組小鼠為 Cre 陰性小鼠。本研究動(dòng)物實(shí)驗(yàn)經(jīng)我院動(dòng)物倫理委員會(huì)批準(zhǔn)實(shí)施。

2. 脛骨骨折模型：參照文獻(xiàn)，對(duì) 9～12 周C57B / L6 小鼠進(jìn)行脛骨骨折，方法如下：1% 戊巴比妥 1 ml / kg 腹腔注射，待小鼠完全麻醉后，備皮、消毒小鼠下肢，在膝關(guān)節(jié)下切開(kāi)約 0.5 cm 縱行切口，由臏腱處插入 22 G / 0.41 mm 髓內(nèi)固定針，分離脛骨中上 1 / 3 處肌肉及筋膜，使用鋸片鋸斷脛骨骨干后立即使用 0.9% 生理鹽水沖洗脛骨表面，再將髓內(nèi)固定針完全插入并對(duì)合。逐層縫合切口，制成小鼠脛骨干性骨折模型。骨折處理后 14 天顯微 CT檢查脛骨骨折情況[6]。

3. 免疫組化：分別在 3、7、10、14 和 21 天解剖小鼠獲取脛骨，取脛骨在 4% 多聚甲醛中浸泡18 h，10% 的 EDTA 溶液中脫鈣 2 周，石蠟包埋，切片 ( 3 μm )。切片脫蠟，水化，經(jīng) 0.1% 胰酶 37 ℃處理 30 min。血清封閉 60 min 后加入 CXCL12 一抗，4 ℃ 過(guò)夜，二抗在室溫下孵育 60 min，鏡檢。

4. 骨內(nèi)膜細(xì)胞分離：從脛骨和股骨的骨髓中分離骨內(nèi)膜細(xì)胞。方法如下：快速解剖脛骨和股骨，剔除所有小鼠織后，脛骨和股骨在 0.1% 膠原蛋白酶和 0.125% 的胰蛋白酶中浸泡 30 min，浸泡 5 次。MSC 培養(yǎng)液快速?zèng)_洗骨髓。余下骨分裂成碎片，在 37 ℃，0.1% 膠原蛋白酶中處理 40 min，2 次。每個(gè)骨碎片用含抗生素和 10% 血清的 DMEM 培養(yǎng)液沖洗，接種到培養(yǎng)瓶中 37 ℃ 和 5% CO2培養(yǎng)。細(xì)胞傳 3 代后繼續(xù)后續(xù)實(shí)驗(yàn)。由含 0.5×Stem Xvivo 的StemXVivo 成骨細(xì)胞培養(yǎng)液培養(yǎng)骨內(nèi)膜細(xì)胞，誘導(dǎo)其向成骨細(xì)胞分化。

5. RNA 提取與 RT-qPCR：細(xì)胞總 RNA 提取和 RNA 逆轉(zhuǎn)錄 cDNA 按 TaKaRa RNA 提取試劑盒和逆轉(zhuǎn)錄試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)體系如下：1 μg RNA，5 μl 10′ 逆轉(zhuǎn)錄緩沖液，0.25 μl dNTP( 100 mM )，4 μl 逆轉(zhuǎn)錄引物 ( 1 mM )，0.5 μl 逆轉(zhuǎn)錄酶 ( 50 U / μl )，0.25 μl Rnase 抑制劑 ( 20 U / μl )，RNAase-free 去離子水補(bǔ)足總體積 25 μl；反應(yīng)條件為：25 ℃，10 min；37 ℃，60 min；95 ℃，5 min。實(shí)時(shí)定量 PCR 引物包括：小鼠 β-actin ( F：5’-acc cacactgtgcccatctacg-3’；R：5’-gccacgctcggtcagga tcttc-3’ )，小鼠 BMP2 ( F：5’-aagtctcctccttcatcag tatacgctcg-3’；R：5’-ccacacagagtcaaggtttaaaaggat gc-3’ )，小鼠 CXCL12 ( F：5’-agagtccgaggaacgctgc-3’；R：5’-ccctggcactgaactgga-3’ )，小鼠骨鈣蛋白( F：5’-caagtcccacacagcagctt-3’；R：5’-aaagccgag ctgccagagtt-3’ ) ，小鼠 α-SMA ( F：5’-tactgccgagcg tgagat-3’；R：5’-gcttcgtcgtattcctgttt-3’ ) 反應(yīng)體系如下：1.5 μl 逆轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物，7.5 μl SYBR Green Mixture，上下游引物各 0.3 μl，5.4 ml RNAase-free 去離子水，總體積 15 μl；反應(yīng)條件為 95 ℃，10 min；95 ℃，15 s，55 ℃，15 s，40 個(gè)循環(huán)?；虮磉_(dá)變化倍數(shù)采用 2－ΔΔCt法進(jìn)行比較，內(nèi)參為鼠源 β 肌動(dòng)蛋白。

6. Western Bloting：蛋白裂解液裂解組織或細(xì)胞，10 000 g 4 ℃離心 5 min，收集上清，BCA 蛋白定量后進(jìn)行 WB。WB 方法如下：20 μg 總蛋白上樣，12% SDS-PAGE 分離蛋白質(zhì)，濕轉(zhuǎn)恒流 250 mA，70 min 將蛋白轉(zhuǎn)至 PVDF 膜上，5% 脫脂奶粉封閉后2 h，加入一抗 4 ℃ 孵育過(guò)夜，充分洗滌后加入二抗室溫孵育 2 h，充分洗滌后顯影。

三、統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

所有數(shù)據(jù)均采用 SPSS 18.0 軟件統(tǒng)計(jì)學(xué)分析及Graphpad Prim 5.0 繪圖。數(shù)據(jù)采用表示。兩小鼠比較采用 t 檢驗(yàn)，多小鼠間比較用單因素方差分析( oneway ANOVA )。P＜0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

一、確定 BMP2cKO/+ 和 BMP2cKO/CKO 小鼠基因型

檢測(cè) BMP2cKO/+和 BMP2cKO/cKO小鼠 BMP2 表達(dá)，并比較各小鼠脛骨變化，見(jiàn)圖 1。BMP2cKO/+和BMP2cKO/cKO小鼠 BMP2 顯著低于小鼠 ( F＝45.16，P＝0.002 )。

二、骨折模型中表達(dá) CXCL12 細(xì)胞及其變化

在對(duì)照組小鼠和 BMP2cKO/+小鼠未骨折時(shí)，表達(dá)CXCL12 細(xì)胞較少，見(jiàn)圖 2a，d，g，j。對(duì)照組小鼠骨折后第 7 天和第 14 天，在骨折線的骨內(nèi)膜細(xì)胞和骨內(nèi)膜下的一些成骨細(xì)胞發(fā)現(xiàn) CXCL12 表達(dá)，見(jiàn)圖2b，c，e，f，且骨折第 14 天表達(dá) CXCL12 細(xì)胞比第7 天增多。BMP2cKO/+小鼠骨折第 7 天和第 14 天，表達(dá) CXCL12 的骨內(nèi)膜細(xì)胞和成骨細(xì)胞比對(duì)照組小鼠明顯增加，且呈無(wú)序的簇狀分布，見(jiàn)圖 2h，i，k，l。從骨折 14 天起，對(duì)照組小鼠骨折后骨內(nèi)膜細(xì)胞表達(dá) CXCL12 逐漸減少；而在 BMP2cKO/+鼠骨折后第14 天和 21 天，骨內(nèi)膜細(xì)胞和成骨細(xì)胞表達(dá) CXCL12仍較高，且無(wú)序分布，見(jiàn)圖 3。

三、對(duì)照組小鼠和 BMP2cKO/+ 小鼠骨內(nèi)膜細(xì)胞CXCL12 表達(dá)比較

BMP2cKO/+小鼠骨折后 14 天分離的骨內(nèi)膜細(xì)胞CXCL12 表達(dá)顯著高于對(duì)照小鼠 ( 圖 4，t＝3.513，P＝0.025 )。

四、BMP2 對(duì)骨內(nèi)膜細(xì)胞 CXCL12 表達(dá)及分化的調(diào)控

分離對(duì)照組小鼠骨內(nèi)膜細(xì)胞，添加 rhBMP2 顯著減少 CXCL12 的表達(dá) ( P＜0.05 )，同時(shí)致使成骨分化標(biāo)志物骨鈣蛋白和周細(xì)胞標(biāo)志物 α-SMA mRNA 顯著增加 ( P＜0.05 )，( 圖 5 )。

五、BMP2 依賴(lài) CXCL12 調(diào)控骨內(nèi)膜細(xì)胞分化成成骨細(xì)胞

分離對(duì)照組小鼠和 BMP2cKO/cKO小鼠骨內(nèi)膜細(xì)胞，分化第 14 天，對(duì)照組小鼠骨鈣蛋白顯著高于BMP2cKO/cKO小鼠 ( 圖 6 )。分化第 0、7、14 天，BMP2cKO/cKO小鼠細(xì)胞 CXCL12 表達(dá)顯著高于對(duì)照組小鼠 ( P＜0.05，圖 6 )。使用 CXCL12 受體拮抗劑AMD3100 處理 BMP2cKO/cKO骨內(nèi)膜細(xì)胞，BMP2cKO/cKO骨內(nèi)膜細(xì)胞骨鈣蛋白和 α-SMA 表達(dá)增加 ( P＜0.05 )，( 圖 7 )。

圖 1 BMP2cKO/+ 和 BMP2cKO/cKO 小鼠 BMP2 表達(dá)及脛骨變化 a：WB 和 RT-qPCR 檢測(cè)小鼠、BMP2cKO/+ 和 BMP2cKO/cKO 小鼠骨內(nèi)膜細(xì)胞BMP2 表達(dá)；b：小鼠、BMP2cKO/+ 和 BMP2cKO/cKO 小鼠脛骨Fig.1 BMP2 expression and tibia changes in BMP2cKO/+ and BMP2cKO/cKO mice a: BMP2 expression in endosteal cells of the controlled, BMP2cKO/+and BMP2cKO/cKO mice by western bloting and RT-qPCR; b: The tibia of the controlled, BMP2cKO/+ and BMP2cKO/cKO mice

圖 2 對(duì)照組小鼠和 BMP2cKO/+ 小鼠骨折模型中 CXCL12 表達(dá)細(xì)胞及其變化 ( 免疫組化 × 100 ) a，d：對(duì)照組小鼠未骨折；b，e：對(duì)照組小鼠骨折 7 天；c，f：對(duì)照組小鼠骨折 14 天；g，j：BMP2cKO/cKO 小鼠未骨折；h，k：BMP2cKO/cKO 小鼠骨折 7 天；i，l：BMP2cKO/cKO 小鼠骨折后 14 天表達(dá) CXCL12 細(xì)胞 ( 棕色 ) 及其變化Fig.2 Cells with CXCL12 expression changes in fracture healing model of the controlled mice and BMP2cKO/+ mice, CXCL12 expression cells( brown ) and changes in the controlled mice without fracture ( a, d ), control mice with fracture for 7 days ( b, e ); the controlled mice with fracture for 14 days ( c, f ), BMP2cKO/cKO mice without fracture ( g, j ), BMP2cKO/cKO mice with fracture for 7 days ( h, k ); BMP2cKO/cKO mice with fracture for 14 days ( i, k ) by immunohistological staining

圖 3 對(duì)照組小鼠和 BMP2cKO/+ 小鼠 CXCL12 表達(dá)隨時(shí)間變化 ( 免疫組化 × 400 ) 對(duì)照組小鼠和 BMP2cKO/+ 小鼠骨折后 7、14、21 天CXCL12 表達(dá)細(xì)胞 ( 棕色 ) 變化Fig.3 CXCL12 expression changes in the controlled and BMP2cKO/+ mice after the fracture ( CXCL12 expression changes in the controlled and BMP2cKO/+ mice after the fracture for 7, 14, 21 days by immunohistological staining )

圖 4 比較對(duì)照組小鼠和 BMP2cKO/+ 小鼠骨內(nèi)膜細(xì)胞 CXCL12 表達(dá) [ 分離對(duì)照組小鼠和 BMP2cKO/+ 小鼠骨內(nèi)膜細(xì)胞，WB ( a ) 和 RT-qPCR( b ) 檢測(cè)兩小鼠骨內(nèi)膜細(xì)胞 CXCL12 表達(dá) ]圖 5 BMP2 對(duì)骨內(nèi)膜細(xì)胞 CXCL12 表達(dá)及分化的調(diào)節(jié) [ 比較添加 100 ng / ml rhBMP2 入分化培養(yǎng)的對(duì)照組小鼠骨內(nèi)膜細(xì)胞后 14 天，WB和 RT-qPCR 檢測(cè) CXCL12 表達(dá) ( a、b )、骨鈣蛋白表達(dá) ( a、c )、α-SMA 表達(dá) ( a、d ) ]Fig.4 Comparing CXCL12 expression in isolated endosteal cells of the controlled and BMP2cKO/+ mice. [ Endosteal cells in the controlled and BMP2cKO/+ mice were isolated, CXCL12 expression was detected by WB ( a ) and RT-qPCR ( b ) ]Fig.5 BMP2 regulated CXCL12 expression in endosteal cells [ comparison of protein expression in isolated endosteal cells of the controlled mice without and with rhBMP2 ( 100 ng / ml ) for 14 days, CXCL12 expression ( a, b ), osteocalcin expression ( a, c ) and α-SMA expression ( a, d ) ]

圖 6 BMP2cKO/cKO 小鼠骨內(nèi)膜細(xì)胞骨鈣蛋白表達(dá)下降及 CXCL12 表達(dá)升高 [ 分離對(duì)照組小鼠和 BMP2cKO/cKO 小鼠骨內(nèi)膜細(xì)胞，分化后 7、14 天，WB 和 RT-qPCR 檢測(cè)骨鈣蛋白 ( a～b )；CXCL12 表達(dá) ( c～d ) ]Fig.6 Osteocalcin expression decreased and CXCL12 expression increased in isolated endosteal cells of BMP2cKO/cKO mice [ Endosteal cells were isolated from the controlled and BMP2cKO/cKO mice, osteocalcin ( a - b ) and CXCL12 expression ( c - d ) were detected by WB and RT-qPCR after 7, 14 days’ isolation ]

圖 7 AMD3100 增加 BMP2cKO/cKO 骨內(nèi)膜細(xì)胞骨鈣蛋白和 α-SMA 表達(dá) [ 分離 BMP2cKO/cKO 骨內(nèi)膜細(xì)胞，分化后 7 天添加 400 μM AMD3100 /2 天，分化后 14 天 WB 和 RT-qPCR 檢測(cè)骨鈣蛋白 ( a～b ) 及 α-SMA 表達(dá) ( c ) ]Fig.7 AMD3100 increased osteocalcin and α-SMA expressions in isolated endosteal cells of BMP2cKO/cKO mice [ Endosteal cells were isolated from BMP2cKO/cKO mice. After 7days, 400 μM AMD3100 was added into isolated endosteal cells per 2 days, osteocalcin ( a - b ) and α-SMA expressions ( c ) were detected by WB and RT-qPCR after 14 days’ addition ]

討 論

骨折修復(fù)過(guò)程包括細(xì)胞募集、骨誘導(dǎo)、骨調(diào)控和骨傳導(dǎo)。發(fā)生骨折后，臨近及全身的成骨性干細(xì)胞募集于骨折處，骨折局部 BMP 等骨生長(zhǎng)因子分泌增多，誘導(dǎo)干細(xì)胞向成骨細(xì)胞分化，骨再生[7]。BMP2 是一種分子量為 32KDa 的糖蛋白，屬于轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子 β 超家族成員。BMP2 是目前公認(rèn)的成骨細(xì)胞轉(zhuǎn)化因子，具有較強(qiáng)的成骨能力[8]。研究發(fā)現(xiàn)，將 rhBMP2 注射至去勢(shì)大鼠體內(nèi)，可提高骨質(zhì)疏松的數(shù)量和質(zhì)量[9]；而缺少 BMP2 表達(dá)的小鼠骨折后無(wú)法啟動(dòng)骨愈合反應(yīng)[10]。BMP2 可作為一種信號(hào)肽影響未分化的、有活性的間充質(zhì)細(xì)胞的增殖、分化和細(xì)胞外基質(zhì)合成，多向調(diào)節(jié)骨量、骨器官發(fā)生和骨組織重建[11]。但目前其誘導(dǎo)間充質(zhì)細(xì)胞機(jī)制仍不明確。

CXCL12 / CXCR4 信號(hào)軸在多種組織細(xì)胞中表達(dá)，在骨髓間充質(zhì)細(xì)胞的修復(fù)、再生和歸巢過(guò)程中發(fā)揮重要作用。研究發(fā)現(xiàn)：在小鼠成肌細(xì)胞系C2C12 成骨分化過(guò)程中，CXCL12 與 BMP2 共同發(fā)揮成骨作用[5]；阻斷 CXCL12 / CXCR4 信號(hào)軸可抑制由 BMP2 介導(dǎo)的小鼠骨髓基質(zhì)細(xì)胞的成骨分化[12]。這表明 CXCL12 與 BMP2 共同參與了在骨修復(fù)過(guò)程，但兩者的關(guān)系尚未完全闡明。本研究比較小鼠和 BMP2 基因敲除小鼠的骨折修復(fù)過(guò)程中，BMP2 和CXCL12 表達(dá)細(xì)胞及其變化。結(jié)果發(fā)現(xiàn)小鼠骨折修復(fù)過(guò)程中骨內(nèi)膜細(xì)胞和成骨細(xì)胞表達(dá) CXCL12；敲除小鼠 BMP2 導(dǎo)致動(dòng)物組織細(xì)胞 CXCL12 表達(dá)和分布發(fā)生改變。這提示骨折后 CXCL12+－BMP2+骨內(nèi)膜細(xì)胞被招募到骨損傷處，參與骨折修復(fù)過(guò)程。

CXCL12 / CXCR4 信號(hào)軸可介導(dǎo)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞趨化遷移至骨損傷區(qū)域，再使骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞分化，調(diào)控新生血管生成，促進(jìn)骨修復(fù)[13]。CXCL12是增強(qiáng)骨礦化的關(guān)鍵成骨標(biāo)記因子，它可調(diào)節(jié) BMP2信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)及氧化應(yīng)激狀態(tài)下骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞通過(guò)自噬增強(qiáng)的生存能力[14]。說(shuō)明 CXCL12 與 BMP2 密切相關(guān)。另有研究發(fā)現(xiàn)：CXCL12 / CXCR4 信號(hào)通路參與 BMP2 在誘導(dǎo)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞遷移。骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的遷移數(shù)量與 CXCL12 和 BMP2 的濃度成正比；阻斷劑 AMD3100 明顯抑制 BMP2 誘導(dǎo)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞遷移，但當(dāng)增加 BMP2 濃度達(dá)到一定量時(shí)，骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞遷移數(shù)隨著 BMP2 濃度的增加而增多。這提示 SDF-1 / CXCR4 信號(hào)通路參與BMP2 誘導(dǎo)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的遷移[15]。本研究發(fā)現(xiàn) BMP2 調(diào)控 CXCL12 的表達(dá)和分布，且該調(diào)控具有時(shí)間效應(yīng)。骨折后 BMP2 下調(diào)骨內(nèi)膜細(xì)胞 CXCL12的表達(dá)有利于骨內(nèi)膜細(xì)胞分化成成骨細(xì)胞。這提示骨內(nèi)膜細(xì)胞分化成成骨細(xì)胞依賴(lài) BMP2 下調(diào) CXCL12信號(hào)軸從而影響骨修復(fù)。這些結(jié)果表明骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞遷移和分化過(guò)程中均依賴(lài) BMP2 與 CXCL12相互調(diào)控。

綜上所述，骨折修復(fù)過(guò)程中，骨內(nèi)膜細(xì)胞通過(guò)BMP2 下調(diào) CXCL12 有助于其分化為成骨細(xì)胞。本研究深入探討了 BMP2 與 CXCL12 的關(guān)系，有序地調(diào)控 BMP2 與 CXCL12 對(duì)骨修復(fù)具有重要意義。

[1] Thomas AE, Louis CG. Fracture healing: mechanisms and interventions[J]. Nat Rev Rheumatol, 2015, 11(1):45-54.

[2] Wu MR, Chen GQ, Li YP. TGF-b and BMP signialing in osteoblast, skeletal development, and bone fromation,bomeostasis and disease[J]. Bone Res, 2016, 4:16009.

[3] Lukas P, Christina K, Christian W, et al. Diversity and interconnections in the CXCR4 chemokine receptor / ligand family:molecular perspectives[J]. Front Immunol, 2015, 6:429.

[4] Liu C, Weng Y, Yuan T, et al. CXCL12 / CXCR4 signal axis plays an important role in mediating bone morphogenetic protein 9-induced osteogenic differentiation of mesenchymal stem cells[J]. Int J Med Sci, 2013, 10(9):1181-1192.

[5] Wise JK, Sumner DR, Virdi AS. Modulation of stromal cellderived factor-1 / CXC chemokine receptor 4 axis enhances rhBMP-2-induced ectopic bone formation[J]. Tissue Eng Part A,2012, 18(7-8):860-869.

[6] 溫軒, 謝楊麗, 蘇楠, 等. 小鼠脛骨穩(wěn)定性骨折模型制作及評(píng)價(jià)[J]. 第三軍醫(yī)大學(xué)學(xué)報(bào), 2013, 35(15):404-408.

[7] Yue R, Shen B, Morrison SJ. Clec11a / osteolectin is an osteogenic growth factor that promotes the maintenance of the adult skeleton[J]. Elife, 2016, 13:e18782.

[8] Lee CH, Jin MU, Jung HM, et al. Effect of dual treatment with SDF-1 and BMP-2 on ectopic and orthotopic bone formation[J].PLoS One, 2015, 10(3):e0120051.

[9] Qian C, Zhu C, Yu W, et al. Bone morphogenetic protein 2 promotes osteogenesis of bone marrow stromal cells in type 2 diabetic rats via the Wnt signaling pathway[J]. Int J Biochem Cell Biol, 2016, 80:143-153.

[10] McBride-Gagyi SH, Mckenzie JA, Buettmann EG, et al. BMP2 conditional knockout in osteoblasts and endothelial cells does not impair bone formation after injury or mechanical loading in adult mice[J]. Bone, 2015, 81:533-543.

[11] Wu Y, Zhao RC. The role of chemokines in mesenchymal stem cell homing to myocardium[J]. Stem Cell Rev, 2012, 8(1)243-250.

[12] Rogers MB, Shah TA, Shaikh NN. Turning bone morphogenetic protein 2 (BMP2) on and off in mesenchymal cells[J]. J Cell Biochem, 2015, 116(10):2127-2138.

[13] 義勇, 魏壘. 基質(zhì)細(xì)胞衍生因子-1 與骨再生修復(fù)[J]. 國(guó)際骨科學(xué)雜志, 2016, 37(3):190-194.

[14] Herberg S, Kondrikova G, Hussein KA, et al. Mesenchymal stem cell expression of stromal cell-derived factor-1β augments bone formation in a model of local regenerative therapy[J].J Orthop Res, 2015, 33(2):174-184.

[15] 楊毅, 易蕾, 葉爾扎提·哈加合曼, 等. SDF-1 / CXCR4 信號(hào)通路參與骨形態(tài)蛋白 2 在誘導(dǎo)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞遷移的作用[J]. 中國(guó)組織工程研究, 2016, 20(41):6098-6104.

關(guān)于論文的作者署名與志謝

我國(guó)著作權(quán)法公布以來(lái)，已得到社會(huì)各界的廣泛重視，作為醫(yī)學(xué)科技期刊，必須不折不扣地執(zhí)行著作權(quán)法。為此將本刊對(duì)作者署名和志謝的有關(guān)要求重申如下。

一、作者署名的意義和應(yīng)具備的條件

1. 署名的意義：( 1 ) 標(biāo)明論文的責(zé)任人，文責(zé)自負(fù)；( 2 ) 醫(yī)學(xué)論文是醫(yī)學(xué)科技成果的總結(jié)和記錄，是作者辛勤勞動(dòng)的成果和創(chuàng)造智慧的結(jié)晶，也是作者對(duì)醫(yī)學(xué)事業(yè)做出的貢獻(xiàn)，并以此獲得社會(huì)的尊重和承認(rèn)的客觀指標(biāo)，是應(yīng)得的榮譽(yù)，也是論文版權(quán)歸作者的一個(gè)聲明；( 3 ) 作者署名便于編輯、讀者與作者聯(lián)系，溝通信息，互相探討，共同提高；( 4 ) 作者姓名在文題下按序排列，其署名必須與授權(quán)書(shū)一致；( 5 ) 作者單位名稱(chēng)及郵政編碼腳注于同頁(yè)左下方。

2. 作者應(yīng)具備下列條件：( 1 ) 參與選題和設(shè)計(jì)或參與資料的分析和解釋者；( 2 ) 起草或修改論文中關(guān)鍵性理論或其它主要內(nèi)容者；( 3 ) 能對(duì)編輯部的修改意見(jiàn)進(jìn)行核修，在學(xué)術(shù)界進(jìn)行答辯，并最終同意該文發(fā)表者。以上3 條均須具備。僅參與獲得資金或收集資料者不能列為作者，僅對(duì)科研小組進(jìn)行一般管理者也不宜列為作者。其他對(duì)該研究有貢獻(xiàn)者應(yīng)列入志謝部分。對(duì)文章中的各主要結(jié)論，均必須至少有 1 位作者負(fù)責(zé)。

3. 幾項(xiàng)具體規(guī)定：( 1 ) 通訊作者應(yīng)在投稿時(shí)確定。通訊作者只列 1 位，由投稿者決定；( 2 ) 第一作者與通訊作者為同一人時(shí)，不必標(biāo)注為通訊作者；( 3 ) 在論文首頁(yè)以腳注的形式標(biāo)注通訊作者姓名與 Email；( 4 ) 外籍作者，應(yīng)附本人親筆簽名同意在本刊發(fā)表的函件；( 5 ) 集體署名的論文于文題下列署名單位，于文末列整理者姓名；( 6 ) 集體署名的文章須將對(duì)該文負(fù)責(zé)的關(guān)鍵人物列為通訊作者；( 7 ) 多中心研究的論文，其各單位的第一作者，均為該文的并列第一作者。

二、志謝

在文后志謝是表示感謝并記錄在案的意思。對(duì)給予過(guò)實(shí)質(zhì)性幫助而又不能列為作者的單位或個(gè)人應(yīng)在文后給予志謝。但必須征得被志謝人的書(shū)面同意。志謝應(yīng)避免以下傾向：

被志謝者包括：( 1 ) 對(duì)研究提供資助的單位、個(gè)人和合作單位；( 2 ) 協(xié)助完成研究工作和提供便利條件的組織和個(gè)人；( 3 ) 出于某種考慮，將應(yīng)被志謝人放在作者的位置上，混淆了作者和被志謝者的權(quán)利和義務(wù)；( 4 ) 名人、知名專(zhuān)家包裝自己的論文，抬高論文的身份，將未曾參與工作的，也未閱讀過(guò)該論文的知名專(zhuān)家寫(xiě)在志謝中；( 5 )協(xié)助診斷和提出重要建議的人；( 6 ) 予轉(zhuǎn)載和引用權(quán)的資料、圖片、文獻(xiàn)、研究思想和設(shè)想的所有者；( 7 ) 作出貢獻(xiàn)又不能成為作者的人，如提供技術(shù)幫助和給予財(cái)力、物力支持的人，闡明其支援的性質(zhì)；( 8 ) 其他需志謝者。

Regulation mechanism of BMP2 on CXCL12 expression in fracture repair and its clinical significance

KANG Kai, BAI Dong-yu, XUE Jian-li, LUAN Yan-jun, LIU Yan-xiong. Department of Orthopedics, Hospital of Yanan University, Yanan, Shaanxi, 716000, China

Objective To investigate regulation mechanism of bone morphogenic protein 2 ( BMP2 ) on chemokine C-X-C motif-ligand-12 ( CXCL12 ) expression in the fracture repair and its clinical significance. Methods Knockout mice of BMP2 ( BMP2cKO/+and BMP2cKO/cKO) were constructed. Immunohistochemistry methods were used to analyze the cells with CXCL12 expression and the timely changes in the controlled, BMP2cKO/+and BMP2cKO/cKOmice bone fracture repair models. Real time-qPCR was used to compare the expression changes of CXCL12,osteocalcin and α-SMA gene in endosteal cells and differential endosteal cells isolated from the controlled, BMP2cKO/+and BMP2cKO/cKOmice. Results The expression of BMP2 was significantly lower in BMP2cKO/+and BMP2cKO/cKOmice than the controlled mice. CXCL12 was expressed in the endosteal cells and some osteocytes during mice fracture repair, and the cells with CXCL12 expression increased at the beginning and then decreased. The endosteal cells and osteocytes which expressed CXCL12 increased gradually in BMP2cKO/+mice. CXCL12 expression in endosteal cells isolated from BMP2cKO/+mice was higher than that cells from the controlled mice. In isolated endosteal cells, rhBMP2,while inducing osteoblastic differentiation, stimulated expression of osteocalcin and α-SMA that was coupled with a decrease of CXCL12 expression significantly. In isolated BMP2cKO/cKOendosteal cells, high CXCL12 expression and low osteocalcin expression were observed. In isolated BMP2cKO/cKOendosteal cells with AMD3100 ( an antagonist of CXCL12 receptor ) treatment, osteocalcin and α-SMA expression increased. Conclusions In fracture repair process,BMP2 leads to the downregulation of CXCL12 expression that would facilitate endosteal cells differentiating into osteoblasts and promote fracture healing.

Bone morphogenic protein 2; Chemokine C-X-C motif-ligand-12; Fraction repair; Endosteal cells

10.3969/j.issn.2095-252X.2017.11.009

R683

716000 陜西，延安大學(xué)附屬醫(yī)院骨科

2017-03-10 )

( 本文編輯：李慧文 )