雞血發(fā)酵工藝條件的優(yōu)化

梁肖娜+葉馨陽+韓宏嬌+吳尚+吳尚儀+康世墨+陶冬冰+岳喜慶

摘 要：以雞血為原料，利用從發(fā)酵雞血中篩選出的優(yōu)勢菌株蘇云金芽孢桿菌（Bacillus thuringiensis）、希瓦氏菌（Shewanella sp.）、青霉菌屬（Penicillium citreonigrum）和塔賓曲霉（Aspergillus tubingensis）發(fā)酵雞血液體肥料，以游離氨基酸態(tài)氮含量為評價指標，采用單因素試驗和響應面優(yōu)化試驗確定雞血發(fā)酵的最佳工藝條件。結果表明：根據所建立模型得到發(fā)酵雞血的最佳工藝條件為搖床轉速160 r/min、接種量10%、培養(yǎng)溫度32 ℃、培養(yǎng)時間5 d，在此條件下發(fā)酵雞血中的游離氨基酸態(tài)氮含量最高。

關鍵詞：雞血；發(fā)酵工藝；響應面優(yōu)化；游離氨基酸態(tài)氮

Optimization of Fermentation Conditions of Chicken Blood

LIANG Xiaona， YE Xinyang， HAN Hongjiao， WU Shang， WU Shangyi， KANG Shimo， TAO Dongbing， YUE Xiqing*

（College of Food Science， Shenyang Agricultural University， Shenyang 110866， China）

Abstract： The fermentation of chicken blood by Bacillus thuringiensis， Shewanella sp.， Penicillium citreonigrum and Aspergillus tubingensis， the dominant bacteria isolated from spontaneous fermentation of chicken blood， for producing liquid fertilizer was optimized using one-factor-at-a-time method and response surface methodology. Free amino acid nitrogen concentration was used as response variable. The optimal conditions obtained from the model developed in this study were as follows： shaking speed 160 r/min， inoculum amount 10%， culture temperature 32 ℃， and culture time 5 d. Under these conditions， the highest free amino acid nitrogen concentration was obtained.

Key words： chicken blood； fermentation process； response surface optimization； free amino acid nitrogen

DOI：10.7506/rlyj1001-8123-201710005

中圖分類號：TS201.1 文獻標志碼：A 文章編號：1001-8123（2017）10-0025-06

動物血液是肉類屠宰加工過程中的主要副產物之一，雞血約占機體質量的5%～10%，我國雞血資源豐富，但是大部分被浪費，只有極少部分被開發(fā)和利用。王文婷等[1]的研究表明，雞血中富含蛋白質、氨基酸、氮、磷、鉀等生物活性物質，利用現(xiàn)代微生物技術可以將雞血中的大分子物質降解為小分子，提高雞血的活性，同時也可以較好地將畜禽屠宰場廢棄的動物血液發(fā)酵制成營養(yǎng)豐富、成本較低的發(fā)酵食品、動物飼料和液體肥料等多種產品；此外，還可以從雞血中提取生物活性多肽等物質。

近年來，隨著人們生活水平的提高，肉制品的需求量日益增加，動物血液資源也隨之逐漸增多，但是我國對于動物血液資源，尤其是對雞血資源的研究很少，將雞血加工成食品、飼料和肥料等方面的研究更是少之又少。本研究以雞肉副產物中的雞血為原料，利用優(yōu)勢菌株發(fā)酵雞血，制成液體肥料，采用單因素試驗和響應面優(yōu)化試驗法確定適合發(fā)酵的最佳條件[2]，并對雞血液體肥料的肥效進行研究。該研究不僅有利于資源的綜合開發(fā)和利用，同時也將在一定程度上為畜禽產品的開發(fā)和利用提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

新鮮雞血（采集雞血的玻璃容器經滅菌消毒后，將雞肉屠宰場的新鮮雞血在無菌狀態(tài)下裝入玻璃容器內，期間不加入任何抗凝劑等試劑） 沈陽市偉峰肉雞加工廠。

蘇云金芽孢桿菌（Bacillus thuringiensis）、希瓦氏菌（Shewanella sp.）、青霉菌屬（Penicillium citreonigrum）、塔賓曲霉（Aspergillus tubingensis） 沈陽農業(yè)大學實驗室分離篩選。

牛肉膏、蛋白胨、瓊脂、氯化鈉、硫酸銨、甲醛、乙酰丙酮、乙酸（均為分析純） 國藥集團化學試劑有限公司。

1.2 儀器與設備

LDZX-50 KBS立式壓力蒸汽滅菌鍋 鄭州南北儀器設備有限公司；HZQ-F160全溫振蕩培養(yǎng)箱 太倉市豪成實驗儀器制造有限公司；722G可見分光光度計 上海精密科學儀器有限公司；TDL-SA離心機 上海菲恰爾分析儀器有限公司；BL-500電子天平 上海亞津電子科技有限公司。

1.3 方法

1.3.1 游離氨基酸態(tài)氮含量的測定

標準曲線的繪制：稱取0.472 0 g硫酸銨于100 mL容量瓶中，加蒸餾水溶解并定容，充分振蕩混勻后置于4 ℃冰箱中備用，該溶液含氮量為1.0 mg/mL。移取10 mL上述溶液并定容至100 mL，則該溶液含氮量為

100 μg/mL。準確吸取0、0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9、1.0 mL上述氮質量濃度為100 μg/mL的溶液，分別置于10 mL具塞比色管中，分別加入4 mL乙酸銨緩沖溶液（將40 mL乙酸和60 mL 1 mol/L乙酸鈉混合后定容至100 mL，pH 6.0）和4 mL顯色劑（將7.8 mL乙酰丙酮和15 mL 37%甲醛混合后定容至100 mL，振蕩后放置12 h），用蒸餾水定容至10 mL；混勻后劇烈振蕩1 min，100 ℃水浴加熱15 min，取出后冷卻至室溫。零管作為空白對照，測定各比色管中的溶液在400 nm波長處的吸光度，以硫酸銨質量濃度為橫坐標，對應的吸光度為縱坐標，繪制標準曲線[3]。

樣品測定：吸取待測樣品1 mL，定容至1 000 mL，充分振蕩、混勻備用。吸取上述樣品稀釋液1 mL，置于10 mL具塞比色管中，分別加入4 mL乙酸銨緩沖溶液和4 mL顯色劑，用蒸餾水定容至10 mL，混勻后劇烈振蕩1 min，100 ℃水浴加熱15 min，取出后冷卻至室溫，在400 nm波長處測定其吸光度。

1.3.2 種子液的制備

用與各菌株相適應的液體培養(yǎng)基對其進行活化，并在適宜的溫度和培養(yǎng)時間條件下進行活化培養(yǎng)；活化后將各菌株接入裝有50 mL相應液體培養(yǎng)基的三角瓶中，在160 r/min的條件下?lián)u床培養(yǎng)至對數生長期，并且反復采用離心機進行離心和無菌水重懸3 次以上，最后采用菌落計數法將菌液濃度調整到108 CFU/mL。

1.3.3 單因素試驗[4-8]

吸取2.5 mL新鮮雞血于250 mL錐形瓶中，加入22.5 mL蒸餾水，用封口膜密封，于121 ℃條件下滅菌20 min（液態(tài)雞血），在無菌條件下將4 株優(yōu)勢菌的種子液按照接種量為5%和接種比例為1∶1∶1∶1（V/V）接種到滅菌的雞血中，自然pH值條件下均勻混合，搖床培養(yǎng)，28 ℃條件下恒溫發(fā)酵5 d，測定發(fā)酵雞血中游離氨基酸態(tài)氮的含量。

其中選擇搖床轉速分別為80、120、160、200、240 r/min，研究搖床轉速對發(fā)酵雞血中游離氨基酸態(tài)氮含量的影響；選擇搖床轉速為160 r/min，接種量分別為1%、5%、10%、15%和20%，研究接種量對發(fā)酵雞血中游離氨基酸態(tài)氮含量的影響；選擇接種量為5%、搖床轉速為160 r/min，搖床培養(yǎng)溫度分別為26、28、30、32、34 ℃，研究培養(yǎng)溫度對發(fā)酵雞血中游離氨基酸態(tài)氮含量的影響；選擇接種量為5%、搖床轉速為160 r/min、培養(yǎng)溫度為28 ℃，培養(yǎng)時間分別為2、3、4、5、6 d，研究培養(yǎng)時間對發(fā)酵雞血中游離氨基酸態(tài)氮含量的影響。

1.3.4 響應面優(yōu)化試驗

選取對發(fā)酵雞血中游離氨基酸態(tài)氮含量影響最大的搖床轉速、接種量、培養(yǎng)溫度和培養(yǎng)時間4 個試驗因素，根據Box-Behnken設計原理，以游離氨基酸態(tài)氮含量為響應值，利用Design Expert 8.0.6軟件設計四因素三水平的響應面優(yōu)化試驗。

1.3.5 驗證實驗

根據響應面優(yōu)化法得到發(fā)酵雞血的最佳工藝條件后，在最佳工藝條件下進行3 次重復實驗，驗證響應面優(yōu)化法確定的實驗參數是否準確可靠。

1.4 數據處理

實驗均平行測定3 次，結果以平均值±標準差表示，采用Excel、Design Expert 8.0.6軟件對實驗數據進行分析。

2 結果與分析

2.1 游離氨基酸態(tài)氮的標準曲線

游離氨基酸態(tài)氮測定的回歸方程為y=0.007 3x+

0.006 2（R2=0.998 5），游離氨基酸態(tài)氮含量在0～100 μg/mL范圍內的線性關系良好。

2.2 單因素試驗結果

2.2.1 搖床轉速的確定

由圖1可知，搖床轉速為80 r/min時樣品的游離氨基酸態(tài)氮含量較低，隨著轉速增加，游離氨基酸態(tài)氮含量逐漸升高，當轉速達160 r/min時，其值達到最大，約為46.86 μg/mL；隨著轉速的繼續(xù)增加，游離氨基酸態(tài)氮含量逐漸降低并趨于平緩。這可能是由于隨著搖床轉速逐漸增加，發(fā)酵液的流體速率增大，溶解氧的速率也相應增加，這對于微生物生長和其產物的轉化有利[8]；但是當搖床轉速繼續(xù)增加時，發(fā)酵液中的溶解氧濃度達到上限，轉速的增加不會加大溶解氧的濃度，產物轉化也達到平衡。因此確定160 r/min為最適搖床轉速。

2.2.2 接種量的確定

由圖2可知，接種量在1%～5%之間時，樣品中游離氨基酸態(tài)氮的含量隨著接種量的增大迅速增加，接種量為5%時，游離氨基酸態(tài)氮含量達最大值，約為43 μg/mL；隨著接種量的進一步增大，游離氨基酸態(tài)氮含量開始逐漸減少，并趨于平穩(wěn)，幾乎達到恒定值。這可能是由于微生物的繁殖和生長速率與接種量有關，接種量較大時可以縮短雞血發(fā)酵的時間，但是隨著微生物的生長，菌體生長繁殖較快，菌種的含量增加，其發(fā)酵產物增多，菌體生長繁殖所需的各種養(yǎng)分供給不足，導致菌種之間的競爭乃至營養(yǎng)的缺乏，所游離出來的氨基酸又會被菌體再次利用[9-12]，因此隨著接種量的增大游離氨基酸態(tài)氮含量反而降低。最終確定5%為最適接種量。

2.2.3 培養(yǎng)溫度的確定

由圖3可知，培養(yǎng)溫度為30 ℃時有利于發(fā)酵雞血產生游離氨基酸態(tài)氮，其含量達到最大，約為39.71 μg/mL。這可能是由于溫度過低時雞血中微生物菌種的生長代謝過于緩慢，酶活力受到影響，導致產生的游離氨基酸態(tài)氮的含量較低；但是當溫度升高時也會阻礙微生物的正常生長繁殖[13-19]，因此確定30 ℃為最適發(fā)酵溫度。

2.2.4 培養(yǎng)時間的確定

由圖4可知，培養(yǎng)時間為2～4 d時，隨著培養(yǎng)時間的延長，游離氨基酸態(tài)氮的含量呈上升趨勢，發(fā)酵第4天時達最大值，約為49.56 μg/mL，隨后緩慢下降并趨于平緩。這可能是由于在較短時間內，雞血發(fā)酵不完全，發(fā)酵過程中產生的酶類不能夠充分分解蛋白質而產生氨基酸，在長時間的發(fā)酵過程中，發(fā)酵成熟的酶會將氨基酸降解為生物胺類物質，導致游離氨基酸態(tài)氮的含量降低[20-22]，因此確定4 d為最適培養(yǎng)時間。

2.3 響應面法優(yōu)化試驗結果

2.3.1 試驗結果及方差分析

利用Design Expert 8.0.6軟件對表2的響應值進行二次多項回歸擬合分析，預測模型值為游離氨基酸態(tài)氮含量，回歸方程為Y=33.53+1.47A+2.12B+6.85C-2.37D-3.49AB+4.68AC+3.18AD+1.41BC-6.63BD-4.24CD+8.43A2-4.92B2+2.28C2-6.16D2。

由表3可知，模型為極顯著（P<0.000 1），說明自變量之間的線性關系顯著，修正后的確定系數R2Adj=0.988 6，說明該模型可以解釋98.86%的變化，擬合程度良好；其中失擬項P>0.25，影響不顯著，說明非實驗因素對實驗結果的影響不大。綜上所述，模型的可信度較高，可以用于擬合設計發(fā)酵工藝的效果和分析。對于因素B、C、D，P<0.01說明接種量、培養(yǎng)溫度和培養(yǎng)時間對游離氨基酸態(tài)氮含量的影響極顯著；對于AB、AD、A2和C2，P<0.01說明搖床轉速和培養(yǎng)溫度具有極顯著的二次效應；影響游離氨基酸態(tài)氮含量的因素從大到小依次為培養(yǎng)溫度>培養(yǎng)時間>接種量>搖床轉速，即培養(yǎng)溫度對游離氨基酸態(tài)氮含量的影響最為顯著。

2.3.2 響應面交互作用分析

由圖5～10可知，搖床轉速和接種量曲面的變化幅度較為明顯，說明搖床轉速和接種量對游離氨基酸態(tài)氮含量的影響較為顯著，與二次回歸擬合方差的分析結果一致，同時響應面的最高點也是等高線中最小圖形的中心點；搖床轉速和培養(yǎng)溫度的曲面變化幅度不大，交互作用不明顯，與二次回歸擬合方差的分析結果一致；搖床轉速和培養(yǎng)時間的等高線相交條數較為密集，說明二者的交互作用非常顯著，對游離氨基酸態(tài)氮含量的影響較大，當轉速達160 r/min時，游離氨基酸態(tài)氮含量隨著培養(yǎng)時間的增加而顯著增加；接種量曲面的變化幅度不大，培養(yǎng)時間曲面的變化幅度較大，說明培養(yǎng)時間對游離氨基酸態(tài)氮含量的影響顯著；當溫度達到30 ℃時，游離氨基酸態(tài)氮含量隨著接種量的增大而增加，當接種量增大到一定程度時，游離氨基酸態(tài)氮含量又開始降低；溫度保持在30 ℃時，游離氨基酸態(tài)氮的含量隨著培養(yǎng)時間的延長而增加，隨后又開始逐漸降低；培養(yǎng)時間達4 d時，游離氨基酸態(tài)氮含量達到最大值。

2.4 驗證實驗結果

根據Box-Benhnken響應面優(yōu)化試驗和二次回歸方程分析結果，得出最佳發(fā)酵條件為搖床轉速158.81 r/min、

接種量10.00%、培養(yǎng)溫度32.00 ℃、培養(yǎng)時間5 d，在此最優(yōu)條件下測得的樣品中游離氨基酸態(tài)氮含量為43.25 μg/mL。

為了驗證回歸模型的有效性和可靠性，并且考慮到實際操作，將最佳工藝條件確定為轉速160 r/min、

接種量10%、培養(yǎng)溫度32 ℃、培養(yǎng)時間5 d。在此最優(yōu)條件下重復測定3 次，最終得到樣品中的平均游離氨基酸態(tài)氮含量約為42.89 μg/mL，與預測的理論值接近，說明優(yōu)化得到的發(fā)酵雞血工藝條件具有可靠性。

3 結 論

本研究以雞血為原料，利用優(yōu)勢菌株蘇云金芽孢桿菌（Bacillus thuringiensis）、希瓦氏菌（Shewanella sp.）、

青霉菌屬（Penicillium citreonigrum）和塔賓曲霉（Aspergillus tubingensis）進行雞血的發(fā)酵工藝研究，以發(fā)酵產物中游離氨基酸態(tài)氮含量為指標，對發(fā)酵工藝中的搖床轉速、接種量、培養(yǎng)溫度和培養(yǎng)時間進行單因素試驗，并在此基礎上進行響應面優(yōu)化試驗，最終得到最佳發(fā)酵工藝條件為轉速160 r/min、接種量10%、培養(yǎng)溫度32 ℃、培養(yǎng)時間5 d，此時樣品的游離氨基酸態(tài)氮含量約為42.89 μg/mL。本研究建立的數學模型可靠、合理，不僅可以有效提高工作效率和減少工作的盲目性，而且能為雞血發(fā)酵工藝條件的研究、動物副產品的開發(fā)和

利用[23-25]提供一定的參考。

參考文獻：

[1]王文婷， 侯成立， 宋璇， 等. 動物血漿蛋白水解物功能及應用研究進展[J]. 食品科學， 2017， 38（7）： 309-314. DOI：10.7506/spkx1002-6630-201707049.

[2]張安寧， 劉連成. 響應面法優(yōu)化香菇液體發(fā)酵條件[J]. 江蘇農業(yè)科學， 2014， 42（3）： 200-203.

[3]宋敏， 羅紅宇， 劉為， 等. 下腳料制備生物菌肥的工藝優(yōu)化及養(yǎng)分測定[J]. 環(huán)境工程學報， 2016， 10（5）： 2647-2654. DOI：10.12030/j.cjee.201412173.

[4]秦鵬， 王龍， 路等學， 等. 響應面法優(yōu)化蛹蟲草菌液體發(fā)酵條件[J]. 北方園藝， 2016（8）： 138-141. DOI：10.11937/bfyy.201608038.

[5]陳文強， 喬艷明. 響應面法在香菇液體種生產工藝優(yōu)化中的應用[J]. 食品工業(yè)科技， 2015， 36（18）： 290-294； 319.

[6]胡升， 梅樂和， 姚善涇. 響應面法優(yōu)化納豆激酶液體發(fā)酵[J]. 食品與發(fā)酵工業(yè)， 2003（1）： 13-17. DOI：10.3321/j.issn：0253-990X.2003.01.004.

[7]CHATTERJEE A K， GHOSH B B. Effect of riboflavin deficiency on free amino acid nitrogen concentrations of liver， muscle and plasma[J]. Experientia， 1968， 24： 786-787.

[8]王文秀， 于佳， 李釤， 等. 不同條件對納豆菌發(fā)酵蛤蜊產物中游離氨基酸態(tài)氮含量及納豆激酶活性的影響[J]. 食品科學， 2015， 36（9）： 113-116. DOI：10.7506/spkx1002-6630-201509021.

[9]魏玉西， 殷邦忠， 劉淇， 等. 扇貝裙邊氨基酸營養(yǎng)粉的制備工藝研究[J]. 漁業(yè)科學進展， 2009， 30（3）： 112-116. DOI：10.3969/j.issn.1000-7075.2009.03.019.

[10]曾王旻. 草魚水解氨基酸液的研制[J]. 食品工業(yè)科技， 2005（7）： 128-130.

DOI：10.3969/j.issn.1002-0306.2005.07.049.

[11]BUTTS C A， MOUGHAN P J， SMITH W C. Protein nitrogen， peptide nitrogen and free amino acid nitrogen in endogenous digesta nitrogen at the terminal ileum of the rat[J]. Journal of the Science of Food and Agriculture， 2010， 59： 291-298.

[12]DHAR A， GHOSAL B， BANERJEE P K. Changes in free amino acid nitrogen concentration and transaminases in lead treated rats[J]. International Journal for Vitamin and Nutrition Research， 1980， 50： 416-421.

[13]KUMAR G V， AGARWAL S， ASIF M， et al. Application of response surface methodology to optimize the adsorption performance of a magnetic graphene oxide nanocomposite adsorbent for removal of methadone from the environment[J]. Journal of Colloid and Interface Science， 2017， 497： 193-200. DOI：10.1016/j.jcis.2017.03.006.

[14]SILK D B， FAIRCLOUGH P D， CLARK M L， et al. Use of a peptide rather than free amino acid nitrogen source in chemically defined “elemental” diets[J]. Journal of Parenteral and Enteral Nutrition， 1980， 4（6）： 548-553. DOI：10.1177/0148607180004006548.

[15]COURI D， ABDELRAHMAN M S. Effect of chlorine dioxide and metabolites on glutathione dependent system in rat， mouse and chicken blood[J]. Journal of Environment Pathology， Toxicology and Oncology， 1979， 3（1/2）： 451-460.

[16]楊葆春， 靳義超， 李全， 等. 動物血液資源的開發(fā)利用研究進展[J]. 青海畜牧獸醫(yī)雜志， 2011， 41（5）： 44-46. DOI：10.3969/j.issn.1003-7950.2011.05.030.

[17]GREENBERG J A， DIMENNA M， HANELT B， et al. Analysis of post-blood meal flight distances in mosquitoes utilizing zoo animal blood meals[J]. Journal of Vector Ecology， 2012， 37： 83-89.

[18]VUDATHALA D， CUMMINGS M， MURPHY L. Analysis of multiple anticoagulant rodenticides in animal blood and liver tissue using principles of QuEChERS method[J]. Journal of Analytical Toxicology， 2010， 34： 273-279.

[19]MISSOTTEN J A M， GORIS J， MICHIELS J， et al. Screening of isolated lactic acid bacteria as potential beneficial strains for fermented liquid pig feed production[J]. Animal Feed Science and Technology， 2009， 150： 122-138.

[20]陳畑， 彭婷婷， 王堯， 等. 響應面法優(yōu)化從絲狀真菌中制取殼聚糖的研究[J]. 廣州化工， 2014， 42（20）： 80-82. DOI：10.3969/j.issn.1001-9677.2014.20.027.

[21]竹文坤， 牟濤， 段濤， 等. 響應面法優(yōu)化微生物誘導碳酸鈣沉積培養(yǎng)基[J]. 化工進展， 2014， 33（6）： 1533-1538. DOI：10.3969/j.issn.1000-6613.2014.06.029.

[22]LI Q， FU C. Application of response surface methodology for extraction optimization of germinant pumpkin seeds protein[J]. Food Chemistry， 2005， 92： 701-706.

[23]SANTANNA M R V， ALEXANDR N， BRUCE A， et al. Chicken blood provides a suitable meal for the sand fly Lutzomyia longipalpis and does not inhibit Leishmania development in the gut[J]. Parasites and Vectors， 2010， 3（1）： 1-11. DOI：10.1186/1756-3305-3-3.

[24]劉仲敏， 何伯安， 曹友聲， 等. 豬、牛血固態(tài)發(fā)酵生產蛋白質飼料的研究[J]. 微生物學通報， 1995（6）： 351-354.

[25]魯云風， 楊柯金， 梁子安， 等. 響應面分析法優(yōu)化菌株B10發(fā)酵牛血條件的研究[J]. 飼料廣角， 2010（21）： 29-31； 40. DOI：10.3969/j.issn.1002-8358.2010.21.009.