蛋白激酶C參與大鼠慢性偏頭痛中樞敏化*

吳白雪 王 莎 秦光成 肖 垚 謝景梅 譚 戈 周冀英 陳力學Δ

（1重慶醫(yī)科大學附屬第一醫(yī)院實驗研究中心，重慶 400016；2重慶市神經病學重點實驗室，重慶 400016）

·論 著·

蛋白激酶C參與大鼠慢性偏頭痛中樞敏化*

吳白雪1王 莎1秦光成1肖 垚1謝景梅1譚 戈2周冀英2陳力學1Δ

（1重慶醫(yī)科大學附屬第一醫(yī)院實驗研究中心，重慶 400016；2重慶市神經病學重點實驗室，重慶 400016）

目的：本文旨在研究蛋白激酶C (PKC)是否通過中樞敏化參與慢性偏頭痛病理生理過程。方法：SD雄性大鼠隨機分為7組，假手術組(n= 11)，模型組 (n= 12)，模型+溶劑組(n= 8)，PKC抑制劑4 μg組(n= 11)，PKC抑制劑8 μg組(n= 10)，PKC激動劑100 ng組(n= 10)，PKC激動劑200 ng組(n= 11)?！把仔詼狈磸痛碳び材X膜，模擬硬腦膜痛覺感受器的反復激活，建立慢性偏頭痛大鼠模型，側腦室給予PKC抑制劑和PKC激動劑，使用von Frey test測定大鼠面部及后足的機械痛閾值，Western blot 檢測PKC、CGRP、c-Fos蛋白的表達變化。結果：“炎性湯”反復刺激硬腦膜后，大鼠面部及足底的機械痛閾值顯著降低，而三叉神經脊束尾核部位的CGRP、c-Fos及PKC蛋白表達顯著增加。使用CHE抑制PKC可以顯著增高大鼠面部及足底痛閾值，顯著降低CGRP、c-Fos的表達；而使用PMA激活PKC則降低痛閾值，顯著增高CGRP、c-Fos的表達。結論：本研究表明PKC可以調節(jié)機械痛閾值以及CGRP、c-Fos的表達變化，提示PKC參與慢性偏頭痛中樞敏化的病理生理過程。

蛋白激酶C；慢性偏頭痛；中樞敏化；三叉神經脊束尾核

偏頭痛是一種臨床常見的反復發(fā)作原發(fā)性頭痛疾病，根據其發(fā)作頻率可分為發(fā)作性偏頭痛(episodic migraine, EM)和慢性偏頭痛(chronic migraine, CM)。慢性偏頭痛在普通人群中的患病率約為 2%，給患者和社會均帶來了嚴重的經濟負擔，已經被 WHO列為四種最嚴重的慢性功能障礙性疾病之一[1]。然而目前尚無針對慢性偏頭痛的特效治療方法和根治手段，因此慢性偏頭痛的病理機制研究對于探尋新的治療方法至關重要。目前有許多研究表明中樞敏化(central sensitization)這一機制在慢性偏頭痛的發(fā)病機制中起著尤為重要的作用[2～5]。偏頭痛中樞敏化主要是由三叉神經脊束尾核(trigeminal nucleus caudalis, TNC)部位神經元的興奮性異常增高引起，從而導致皮膚痛覺過敏(hyperalgesia )和痛覺超敏(cutaneous allodynia, CA)[6,7]。蛋白激酶C (protein kinase C, PKC)是重要的細胞內信號轉導分子，廣泛分布于中樞神經系統(tǒng)[8,9]，已有研究證實在疼痛的中樞調節(jié)中，PKC可能起著關鍵性的作用，抑制PKC可以改善中樞敏化，減輕痛覺過敏[9,10]。然而關于PKC是否參與慢性偏頭痛的中樞敏化機制，目前尚無相關報道。因此，本實驗參照Melo-Carrillo報道的方法建立大鼠慢性偏頭痛模型[11]，檢測TNC部位PKC的蛋白表達量，然后給予PKC的激動劑Phorbol 12-myristate 13-acetate (PMA)和抑制劑chelerythrine chloride (CHE)，應用Von Frey test檢測面部和足底的機械痛閾值，Western blotting檢測TNC部位CGRP、c-Fos的蛋白表達水平，探討PKC在慢性偏頭痛的中樞敏化機制中的作用，以期待為慢性偏頭痛的防治提供新的靶點。

方 法

1.實驗動物

清潔級 SD 雄性大鼠（SPF）73只（體重250～300 g），由重慶醫(yī)科大學實驗動物中心提供（實驗動物生產許可證號：SYXK（渝）2012-0001），實驗動物均置于22±2 ℃室溫，濕度50±5%以及12 h/12 h 晝夜明暗交替控光的環(huán)境中，自由攝食飲水。所有實驗SD大鼠適應性喂養(yǎng)一周后進入實驗。本研究均遵守國際疼痛學會(IASP)相關指南，盡量減少實驗動物數目，盡量降低對實驗動物的傷害，并經重慶醫(yī)科大學附屬第一醫(yī)院倫理委員會的許可。

2.慢性偏頭痛中樞敏化模型的建立

參照 Melo-Carrillo等人的報道：通過“炎性湯”(inflammatory soup, IS)反復刺激硬腦膜建立慢性偏頭痛模型[11]。腹腔注射 10%的水合氯醛（i.p.0.4 g/kg體重）麻醉后，將大鼠固定于立體定位儀（美國 Stoelting公司）上，常規(guī)備皮、消毒。頭部正中切開約 1 cm的皮膚切口，鈍性分離皮下組織，3% H2O2處理顱骨表面，臺式顱骨鉆建立一個孔徑約1 mm 的顱骨窗，避免損傷硬腦膜。在骨窗安裝微量套管，使用自凝牙托粉和自凝牙托水固定，全層縫合皮膚，術后將大鼠置于37 ℃恒溫板，待蘇醒后送回飼養(yǎng)間，每只實驗大鼠在同等條件下分籠飼養(yǎng)。術后1周后，選擇傷口未感染，恢復良好的SD大鼠進入實驗，隨機分到不同的實驗組。參照文獻報道的“炎癥湯”配方：組胺(1 mmol/L)、5-羥色胺(1 mmol/L)、緩激肽(1 mmol/L)和前列腺素E2（0.1 mmol/L）加入PBS緩沖液配制而成[11,12]。每日通過微螺旋定量推進裝置勻速緩慢泵入2 μl“炎癥湯”滴注到硬腦膜表面，重復7天；Sham 組大鼠在同樣的時間給予PBS硬腦膜滴注。

3.側腦室注射

本實驗使用的PKC抑制劑CHE (chelerythrine chloride, Abcam)及PKC激 動 劑 PMA (Phorbol 12-myristate 13-acetate, Abcam)在既往文獻[12～17]中證實對PKC有明確的抑制或激動作用，此次試驗中CHE（10 mmol/L）及PMA（100 mmol/L）溶于DMSO，經側腦室給藥，PKC抑制劑低劑量組給予CHE（4 μg/只），PKC抑制劑高劑量組給予CHE（8μg/只），PKC激動劑低劑量組給予PMA（100 ng/只），PKC激動劑高劑量組給予PMA（200 ng/只）。建模成功后（7次“炎性湯”滴注硬腦膜），麻醉好的SD 大鼠固定在立體定位儀上，常規(guī)消毒、備皮，切開皮下組織，止血鉗取出微量套管，3%H2O2處理顱骨表面，在前囟左側1.5 mm后方1 mm，顱骨鉆建立直徑約1 mm骨窗。微量注射器固定于立體定位儀上，將微量注射器的針頭從顱骨窗插入約 4 mm 到達側腦室后，勻速緩慢泵入藥物5 μl(10 min)。待藥物注射完成，留針 5 min 后拔出，用骨蠟封閉骨窗，縫合皮膚。SD大鼠置于 37 ℃恒溫板，蘇醒后送回飼養(yǎng)間。

4.機械痛閾值的測定

機械性痛閾值的測定參照Oshinsky報道的方法[18]。將實驗SD大鼠置于22 cm×22 cm×30 cm的透明籠子中適應10 min后，使用電子Von Frey痛閾儀(WoodLand Hills，CA，USA)測定大鼠面部、足底機械痛閾值。用痛閾儀的硬頭垂直輕觸大鼠面部或后爪的皮膚，大鼠頭部或后爪快速回縮，儀器自動記錄痛閾值，每個部位測 3 次，然后取平均值作為該部位的疼閾值。每次給予炎性湯前測定其基礎痛閾值，以及給予PKC激動劑和抑制劑24小時后，再次測定各組痛閾值的改變。

5.蛋白提取與蛋白水平檢測

將大鼠麻醉后斷頭取腦，取三叉神經脊束尾核(TNC)組織，加入含有PMSF (Beyotime,China)和磷酸酶抑制劑(Boster, China)的RIPA緩沖液(Beyotime, China)，充分勻漿后置于4 ℃冰箱90 min，使其充分裂解，然后，將組織液放入低溫離心機離心(4 ℃，12 000 rpm, 20 min)，取上清液，用BCA試劑盒(Beyotime, China)測定蛋白濃度。待測樣品加入SDS-PAGE蛋白上樣緩沖液(Beyotime,China)，放入100 ℃沸水使其變性 5 min，冷卻后分裝。取50 μg/孔蛋白樣品上樣，10% SDS-PAGE膠(Beyotime，China)電泳分離后，電轉(250 mA)至PDVF膜，5%脫脂奶粉室溫封閉2小時。分別加入相應一抗anti-PKC (1:1 000, Abcam)、anti-CGRP(1:2 000, abcam)和anti-c-Fos (1:500, Abcam) 4℃孵育過夜。第二日復溫2小時，TBST 漂洗 3 次，10 min/次。加入相應濃度二抗（1:5 000，北京中杉金橋生物技術有限公司，China）37 ℃孵育2小時。TBST 漂洗 3 次，10 min/次。采用ECL (Beyotime,China)試劑盒和凝膠成像系統(tǒng)(Fusion, Germany)發(fā)光成像?；叶戎到Y果使用Fusion軟件分析。

6.數據處理與統(tǒng)計分析

計量資料均以均值±標準誤(±SEM)表示，使用統(tǒng)計軟件SPSS 19.0進行統(tǒng)計學分析。兩組之間的均值比較采用獨立樣本t檢驗(independentsamples T test)，多組均值的比較采用單因素方差分析(ANOVA)，P＜ 0.05認為差異有統(tǒng)計學意義。

結 果

1.“炎性湯”反復刺激硬腦膜后，大鼠面部及足底的機械痛閾值顯著降低，而三叉神經脊束尾核部位CGRP、c-Fos及PKC的蛋白表達顯著增加

用電子Von Frey痛閾儀測定大鼠面部、足底機械痛閾值結果發(fā)現：與給藥前的面部及足底基礎痛閾值 (7.25±0.35 g；15.90±0.44 g)比較，反復硬膜滴注PBS組大鼠機械痛閾值(7.75±0.30 g；15.00±0.34 g)無 明 顯 統(tǒng) 計 學 差 異 (P＞ 0.05)；而反復硬膜滴注IS組大鼠的面部及足底痛閾值(3.09±0.20 g；5.89±0.42 g)與 PBS組 的 痛 閾 值(7.75±0.30 g；15.00±0.34 g)相比，顯著下降(P＜0.05, 見圖 1、2)。Western blot結果顯示：硬膜外滴注7次“炎性湯”后，CM組大鼠TNC部位CGRP、c-Fos的蛋白表達較Sham組均顯著增高(P＜0.05)。以上結果表明反復硬膜外滴注炎性湯可以降低大鼠機械痛閾值，導致TNC部位CGRP、c-Fos表達增高，提示該模型成功模擬了慢性偏頭痛的中樞敏化機制。此外，CM組TNC部位PKC蛋白表達水平較Sham組亦顯著增高(P＜ 0.05)，該結果表明了PKC可能在慢性偏頭痛中起著重要作用。

圖1 兩組大鼠滴注不同IS/PBS次數的面部機械痛閾值的改變情況(n=16,±SEM)*P ＜ 0.05，與 PBS 組相比Fig.1 The change of mechanical threshold in face after IS/PBS infusion in each group (n=16,±SEM)* P ＜ 0.05, compared with PBS group

圖2 兩組大鼠滴注不同IS/PBS次數的足底機械痛閾值的改變情況(n=16,±SEM)*P ＜ 0.05，與 PBS 組相比Fig.2 The change of mechanical threshold in hindpaw after IS/PBS infusion in each group (n=16,±SEM)*P ＜ 0.05, compared with PBS group.

2.使用CHE抑制PKC可以顯著增高大鼠面部及足底痛閾值，而使用PMA激活PKC則降低大鼠面部及足底痛閾值

圖3 給予PKC抑制劑CHE后各組大鼠面部機械痛閾值的比較*P ＜ 0.05,與 Sham 組相比；#P ＜ 0.05,與 CM+DMSO 組相比Fig.3 The comparison of mechanical threshold in face among different groups after administration of PKC inhibitor CHE*P ＜ 0.05, compared with Sham group; #P ＜ 0.05,compared with CM+DMSO group.

圖5 給予PKC抑制劑CHE后各組大鼠足底機械痛閾值的比較*P ＜ 0.05,與 Sham組相比； #P ＜ 0.05,與 CM+DMSO 組相比Fig.5 The comparison of mechanical threshold in hindpaw among different groups after administration of PKC inhibitor CHE*P ＜ 0.05, compared with Sham group; #P ＜ 0.05, compared with CM+DMSO group.

圖4 給予PKC激動劑PMA后各組大鼠面部機械痛閾值的比較*P ＜ 0.05,與Sham 組相比； #P ＜ 0.05,與 CM+DMSO組相比Fig.4 The comparison of mechanical threshold in face among different groups after administration of PKC activator PMA*P ＜ 0.05, compared with Sham group; #P ＜ 0.05, compared with CM+DMSO group.

圖6 給予PKC激動劑PMA后各組大鼠足底機械痛閾值的比較*P ＜ 0.05,與 Sham 組相比；#P ＜ 0.05,與 CM+DMSO 組相比Fig.6 The comparison of mechanical threshold in hindpaw among different groups after administration of PKC activator PMA*P ＜ 0.05, compared with Sham group; #P ＜ 0.05, compared with CM+DMSO group.

與Sham組面部及足底機械痛閾值(8.97±0.50 g；17.02±0.82 g)比較，CM組(3.76±0.17 g；6.49±0.48 g)及 CM+DMSO 組 (3.45±0.28 g；5.05±0.48 g)機械痛閾值均顯著降低(P＜ 0.05)，而CM組與CM+DMSO組大鼠面部及足底痛閾值并無統(tǒng)計學差異(P＞ 0.05)，提示側腦室給予DMSO并不影響大鼠的機械痛閾值。給予PKC抑制劑CHE后，大鼠面部及足底機械痛閾值均顯著增高(P＜ 0.05)，但是，CHE高劑量組(6.38±0.38 g；10.36±0.75 g)與低劑量組(5.19±0.31 g；8.80±0.60 g)面部及足底機械痛閾值并無明顯統(tǒng)計學差異(P＞ 0.05, 見圖3、4)，提示CHE改善痛覺過敏不成劑量依耐性。此外，給予PKC激動劑PMA后，高、低劑量組大鼠面部機械痛閾值(2.14±0.17 g；2.03±0.13 g)均顯著降低(P＜ 0.05)，但是，PMA低劑量組(3.52±0.27 g)的大鼠足底痛閾值變化較CM組無統(tǒng)計學差異，而PMA高劑量組的足底痛閾值(3.22±0.23 g)則顯著下降(P＜ 0.05, 見圖5、6)，PMA高、低劑量組之間面部及足底機械痛閾值亦無明顯統(tǒng)計學差異，提示PMA加重面部痛覺過敏不成劑量依賴性，以及高劑量的PMA可以降低大鼠足底的痛閾值。

3.使用CHE抑制PKC可以顯著降低CGRP、c-Fos的表達，而使用PMA激活PKC則顯著增高CGRP、c-Fos的表達

與Sham組相比，CM組TNC部位CGRP的表達顯著增高(P＜ 0.05)；給予PKC抑制劑CHE后，CGRP的表達顯著降低(P＜ 0.05)；而給予PKC激動劑PMA后，CGRP的表達顯著增高(P＜ 0.05)。此外，與Sham組比較，CM組TNC部位c-Fos的表達量亦顯著增高(P＜ 0.05)；給予PKC的抑制劑CHE后，c-Fos的表達顯著降低(P＜ 0.05)；而給予PKC的激動劑后，c-Fos的表達顯著增高 (P＜ 0.05, 見圖 7～9)。

圖7 兩組PKC蛋白表達量*P ＜ 0.05，與 Sham 組相比Fig.7 The comparison of PKC protein expression levels between two groups*P ＜ 0.05, compared with sham group.

討 論

每年大約有2%的發(fā)作性偏頭痛轉化為慢性偏頭痛[19]。慢性偏頭痛因為頻繁和嚴重的頭痛發(fā)作影響患者的學習與工作能力、生活質量, 給患者個人以及社會帶來了非常嚴重的危害。因此，治療及預防慢性偏頭痛是神經病學的一重要領域。在偏頭痛的病理過程，尤其是偏頭痛慢性化過程中，中樞敏化發(fā)揮了重要作用[5～7]。Burstein R等人1996年首次在Nature雜志上提出中樞敏化參與了偏頭痛發(fā)病過程[20]。中樞敏化主要是由于中樞神經系統(tǒng)在疼痛產生以及疼痛傳遞的過程中發(fā)生了可塑性變化，從而導致中樞神經系統(tǒng)對傷害區(qū)域內和傷害區(qū)域周圍非傷害區(qū)域的刺激反應增強（痛覺過敏，hyperalgesia），對非傷害性刺激產生疼痛異常的傷害性反應（痛覺超敏，allodynia）[21]。皮膚異常性疼痛（CA）作為偏頭痛中樞敏化的外在征象，疼痛范圍牽涉面部，還可以擴展到整個面部以及頭皮，甚至達到四肢[22～25]。在偏頭痛的動物模型中，多采用電、化學刺激敏化硬腦膜以及三叉神經血管系統(tǒng)來誘導這種中樞敏化狀態(tài)，多以 von-Frey 絲檢測面部和后足的皮膚痛閾來評價[26]。本研究發(fā)現，與對照組（PBS組）相比，慢性偏頭痛組大鼠（IS組）面部及足底的機械痛閾值都顯著降低，隨著“炎性湯”刺激硬腦膜次數增加，大鼠面部及足底痛閾值進行性下降，提示“炎性湯”反復刺激硬腦膜可以誘導皮膚異常性疼痛（CA），導致偏頭痛的中樞敏化狀態(tài)。

降鈣素基因相關肽(calcitonin gene related peptide,CGRP)是一種血管舒張肽，廣泛分布于中樞系統(tǒng)，是三叉神經微血管激活的標志物，在偏頭痛中樞敏化的疼痛感覺調控中發(fā)揮著重要的作用[27,28]。Cady等的研究表明CGRP可以促進中樞以及外周的三叉神經元以及神經膠質細胞的敏感性[29]。c-Fos是即刻早期基因的重要成員，參與偏頭痛的痛覺調控過程[7,30]。CGRP 和c-Fos在偏頭痛病理過程，尤其在慢性偏頭痛的發(fā)展和維持中起重要作用，可以作為中樞敏化和神經元激活的生物學標志[7,27～30]。本研究發(fā)現：慢性偏頭痛大鼠（7次“炎性湯”后）TNC部位觀察到CGRP和c-Fos表達的顯著增加，提示重復給予“炎性湯”刺激硬腦膜可以導致中樞敏化和神經元激活。綜上所述，在我們的研究中：給予“炎性湯”反復刺激硬腦膜可以顯著降低大鼠面部和足底痛閾值，增加中樞敏化標志CGRP 和c-Fos的表達，提示“炎性湯”反復刺激硬腦膜可以較好的模擬慢性偏頭痛中樞敏化的過程，該模型是一種可行的偏頭痛中樞敏化模型。

蛋白激酶C（PKC）是重要的細胞內信號轉導分子，至今已發(fā)現12種亞型，它們構成了一個絲氨酸／蘇氨酸激酶超家族。PKC在介導細胞分裂、增殖、凋亡、細胞骨架蛋白的重塑、離子通道的調節(jié)及細胞分泌等方面發(fā)揮著重要作用[8,9]。既往的研究發(fā)現，在多種疼痛模型中， PKC活性顯著增高，而抑制PKC的活性后往往可以明顯減輕疼痛，提示PKC在疼痛的中樞敏化形成過程中發(fā)揮著重要作用[3,9,10]。本研究結果發(fā)現，大鼠慢性偏頭痛中樞敏化模型中，觀察到伴隨著大鼠面部及足底痛閾值的下降，TNC部位PKC的蛋白表達水平顯著增加，而使用PKC的抑制劑CHE后可以顯著改善CM大鼠痛覺過敏，進一步使用PKC激動劑PMA可以加重大鼠痛覺過敏，提示PKC同樣參與慢性偏頭痛痛覺過敏的過程。前文提到：CGRP 和c-Fos可以作為偏頭痛中樞敏化和神經元激活的生物學標志。在此次研究中發(fā)現，大鼠慢性偏頭痛中樞敏化模型中，使用PKC的抑制劑CHE后可以顯著抑制CGRP 和c-Fos的表達，而使用PKC激動劑PMA可以增加CGRP 和c-Fos的表達，提示PKC參與了慢性偏頭痛中樞敏化的病理生理過程。PKC共有12 種亞型,已有研究表明PKC γ亞基是痛覺過敏、中樞敏化關鍵的調節(jié)因子[31～33]，遺憾的是，此次研究并未細究PKC各亞型對偏頭痛中樞敏化的作用，這將是我們下一步研究的重點。

圖8 各組CGRP蛋白表達量*P ＜ 0.05，與Sham組相比； #P ＜ 0.05，與CM+DMSO組相比Fig.8 The comparison of CGRP protein expression levels among four groups*P ＜ 0.05, compared with Sham group; #P ＜ 0.05, compared with CM+DMSO group.

圖9 各組c-Fos蛋白表達量*P ＜ 0.05，與Sham組相比；#P ＜ 0.05，與CM+DMSO組相比Fig.9 The comparison of c-Fos protein expression levels among four groups*P ＜ 0.05, compared with Sham group；#P ＜ 0.05, compared with CM+DMSO group.

綜上所述，“炎性湯”反復刺激硬腦膜后，大鼠面部及足底機械痛閾值顯著降低，CGRP、c-Fos表達顯著增加，證實了該模型是一種可行的慢性偏頭痛中樞敏化模型。此外，PKC可以有效調節(jié)中樞敏化標志CGRP、c-Fos的表達變化及大鼠機械痛閾值的變化，提示PKC參與慢性偏頭痛中樞敏化的病理生理過程。我們的研究不僅為慢性偏頭痛的動物模型進行了探索證實，更為未來慢性偏頭痛的預防治療提供了可靠思路。

[1]Schwedt TJ. Chronic migraine. BMJ, 2014, 348(12):g1416.

[2]鄭穎, 張偉, 朱昱,等. 慢性偏頭痛的研究進展. 國際神經病學神經外科學雜志, 2012, 39(4):327 ～ 330.

[3]Burstein R, Jakubowski M, Rauch SD. The science of migraine. J Vestib Res, 2011, 21(6):305 ～ 314.

[4]Burstein R. Deconstructing migraine headache into peripheral and central sensitization. Pain, 2001, 89(2-3):107 ～ 110.

[5]David Dodick MD, Stephen Silberstein MD. Central Sensitization Theory of Migraine: Clinical Implications.Headache, 2006, 46 Suppl 4(Supplement s4): S182 ～S191.

[6]Aguggia M. Allodynia and migraine. Neurol Sci, 2012,33(1):9 ～ 11.

[7]Boyer N, Dallel R, Artola A,et al. General trigeminospinal central sensitization and impaired descending pain inhibitory controls contribute to migraine progression. Pain, 2014, 155(7):1196 ～ 1205.

[8]倪同尚, 武勝昔, 李云慶. 蛋白激酶C的分子生物學特征及研究進展. 解剖科學進展, 2001, 7(4):335 ～ 338.

[9]Velázquez KT, Mohammad H, Sweitzer SM. Protein kinase C in pain: Involvement of multiple isoforms.Pharmacol Res, 2007, 55(6):578 ～ 589.

[10]王遠勝, 胡興國. 蛋白激酶C與疼痛的中樞敏感化.國際麻醉學與復蘇雜志, 2002, 23(2):108 ～ 111.

[11]Melo-Carrillo A, Lopez-Avila A. A chronic animal model of migraine, induced by repeated meningeal nociception,characterized by a behavioral and pharma-cological approach. Cephalalgia, 2013, 33(13): 1096 ～ 1105.

[12]Begon S, Pickering G, Eschalier A,et al. Role of spinal NMDA receptors, protein kinase C and nitric oxide synthase in the hyperalgesia induced by magnesium de fi ciency in rats. Bri J Pharmacol, 2001, 134(6):1227 ～1236.

[13]Li SJ, Cui SY, Zhang XQ,et al. PKC in rat dorsal raphe nucleus plays a key role in sleep-wake regulation. Prog Neuro Psychopharmacol Biol Psychiatry, 2015, 63:47 ～ 53.

[14]Hsieh WK, Lin HH, Lai CC. Involvement of protein kinase C and Src tyrosine kinase in acute tolerance to ethanol inhibition of spinal NMDA-induced pressor responses in rats. Br J Pharmacol, 2009, 158(3):806 ～818.

[15]Shibasaki M, Mizuno K, Kurokawa K,et al.L-type voltage-dependent calcium channels facilitate acetylation of histone H3 through PKCγ phosphorylation in mice with methamphetamine-induced place preference. J Neurochem, 2011, 118(6):1056.

[16]Zhang Y, Gong K, Zhou W,et al. Involvement of Subtypes γ and of Protein Kinase C in Colon Pain Induced by Formalin Injection. Neurosignals, 2011,19(3):142.

[17]Coderre TJ. Contribution of protein kinase C to central sensitization and persistent pain following tissue injury.Neurosci Lett, 1992, 140(2):181 ～ 184.

[18]Oshinsky ML, Gomonchareonsiri S. Episodic Dural Stimulation in Awake Rats: A Model for Recurrent Headache. Headache, 2007, 47(7):1026 ～ 1036.

[19]Bigal ME, Serrano D, Buse D,et al. Acute migraine medications and evolution from episodic to chronic migraine: a longitudinal population-based study. Headache,2008, 48:1157 ～ 1168.

[20]Strassman AM, Raymond SA, Burstein R. Sensitization of meningeal sensory neurons and the origin of headaches. Nature, 1996, 384(6609):560 ～ 564.

[21]Woolf CJ, Salter MW. Neuronal plasticity: increasing the gain in pain. Science, 2000, 288(5472):1765 ～ 1769.

[22]Jakubowski M, Silberstein S, Ashkenazi A,et al. Can allodynic migraine patients be identi fi ed interictally using a questionnaire?. Neurology, 2005, 65(9):1419 ～ 1422.

[23]Ashkenazi A, Silberstein S, Jakubowski M,et al.Improved identi fi cation of allodynic migraine patients using a questionnaire. Cephalalgia, 2007, 27(4):325 ～329.

[24]Mathew NT, Kailasam J, Seifert T. Clinical recognition of allodynia in migraine. Neurology, 2004, 63(5):848 ～852.

[25]裴培, 劉璐, 趙洛鵬,等. 偏頭痛:中樞敏化與皮膚異常性疼痛. 中國疼痛醫(yī)學雜志, 2016, 22(2):128 ～132.

[26]Storer RJ, Supronsinchai W, Srikiatkhachorn A. Animal models of chronic migraine. Curr Pain Headache Rep,2015, 19:467.

[27]譚亮, 樊光輝. 偏頭痛發(fā)病機制的研究進展. 中國臨床神經外科雜志, 2012, 29(9):14 ～ 15.

[28]Durham PL. Diverse Physiological Roles of Calcitonin Gene-Related Peptide in Migraine Pathology: Modulation of Neuronal-Glial-Immune Cells to Promote Peripheral and Central Sensitization. Curr Pain Headache Rep, 2016,20(8):1 ～ 9.

[29]Cady RJ, Glenn JR, Smith KM,et al. Calcitonin gene related peptide promotes cellular changes in trigeminal neurons and glia implicated in peripheral and central sensitization. Mol Pain, 2011, 7(1): 94.

[30]Mitsikostas DD, Rio MSD. Receptor systems med-iating c-fos, expression within trigeminal nucleus caudalis in animal models of migraine. Brain Res Brain Res Rev,2001, 35(1):20 ～ 35.

[31]Xie HY, Fei X, Yue L,et al. Increases in PKC gamma expression in trigeminal spinal nucleus is associated with orofacial thermal hyperalgesia in streptozotocin-induced diabetic mice. J Chem Neuroanat, 2015, 63:13 ～ 19.

[32]Hughes AS, Averill S, King VR,et al. Neurochemical characterization of neuronal populations expressing protein kinase C gamma isoform in the spinal cord and gracile nucleus of the rat. Neuroscience, 2008, 153(2):507 ～ 517.

[33]Malmberg AB, Chen C, Tonegawa S,et al. Preserved acute pain and reduced neuropathic pain in mice lacking PKCgamma. Science, 1997, 278(5336):279 ～ 283.

PKC CONTRIBUTES TO CENTRAL SENSITIZATION IN A RAT MODEL OF CHRONIC MIGRIANE*

WU Bai-Xue1, WANG Sha1, QIN Guang-Cheng1, XIAO Yao1, XIE Jing-Mei1, TAN Ge2, ZHOU Ji-Ying2,CHEN Li-Xue1Δ
(1Laboratory Research Center, The First Af fi liated Hospital of Chongqing Medical University, Chongqing 400016, China;2Chongqing Key Laboratory of Neurology, Chongqing 400016, China)

Objective: The purpose of this paper is to investigate whether PKC participates in central sensitization in chronic migraine pathophysiological process. Methods: Sprague-Dawley rats were randomly divided into 7 groups: Sham group (n=11), CM group (n=12), CM+DMSO group (n=8), CM+CHE4 μg group (n=11), CM+CHE 8 μg group (n=10), CM+PMA100 ng group (n=10), CM+PMA 200 ng group(n=11). We repeatedly infused inflammatory soup (IS) on the intact dura in awake rats to model the recurrent dural nociceptor activation assumed to occur in patients with chronic migraine (CM). PKC blocker chelerythrine chloride (CHE) and PKC activator Phorbol 12-myristate 13-acetate (PMA) were administrated to investigate the role of PKC in central sensitization induced by in fl ammatory soup. Then we used von Frey test to detect the change of pain threshold. Western blotting was performed to detect the expression of PKC,CGRP and c-Fos in trigeminal nucleus caudalis (TNC). Results: Repeated infusion of IS decreased pain threshold in the face and hindpaw region, and up-regulated the expression of PKC, CGRP and c-Fos in TNC.Furthermore, inhibition of PKC by CHE relieved the allodynia, and reduced the expression of CGRP and c-Fos. Activation of PKC by PMA aggravated the allodynia, and increased the expression of CGRP and c-Fos.Conclusion: Inhibition and activation of PKC could regulate the pain threshold and the expression of CGRP and c-Fos. These data indicate that PKC might play a prominent part in central sensitization of CM model.

PKC; Chronic migraine; Central sensitization; Trigeminal nucleus caudalis

10.3969/j.issn.1006-9852.2017.05.004

國家自然科學基金（No. 81671093, No. 81500957）；重慶市渝中區(qū)科技計劃項目（YCSTC，2016BE02）

△通訊作者 chenlixue@hospital.cqmu.edu.cn