油菜素內酯對玉米葉片捕光、CO2固定及有機物運輸?shù)挠绊?/h1>
2017-11-18 02:14:03藏金萍趙艾佳趙亞林閆青地馮佳佳張海麗王鳳茹董金皋
中國農業(yè)科學 2017年21期
藏金萍，趙艾佳，趙亞林，閆青地，馮佳佳，張海麗，王鳳茹，董金皋
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油菜素內酯對玉米葉片捕光、CO2固定及有機物運輸?shù)挠绊?/p>
藏金萍1，趙艾佳2，趙亞林1，閆青地1，馮佳佳1，張海麗1，王鳳茹1，董金皋1
（1河北農業(yè)大學生命科學學院/河北省植物生理與分子病理學重點實驗室，河北保定 071001；2河北保定一中，河北保定 071000）
明確油菜素內酯（BR）對玉米光合特性的影響及作用機制，為油菜素內酯在玉米田的高效利用提供理論依據(jù)和技術參考。于玉米8葉期噴施100 nmol·L-1BR，對其葉片進行葉綠體結構、淀粉粒積累、葉綠素含量、PEPC活性、光合速率、蔗糖磷酸合成酶（SPS）和蔗糖合成酶（SS）活性的檢測與分析。油菜素內酯處理8葉期玉米15 d后，與對照相比，玉米葉片的凈光合速率提高了32.6%，同時，葉綠體中淀粉粒的積累明顯變多變大，葉綠素含量高出對照28.57%，以上結果說明BR處理可提高玉米葉片的捕光能力；PEPC是C4植物中催化PEP固定CO2的酶，本研究結果表明BR處理可提高玉米葉片中PEPC的活性，與對照相比，其活性提高了14.52%，這說明BR處理可提高玉米葉片固定CO2的能力；光合產(chǎn)物運輸是決定產(chǎn)量的重要因素，通過對玉米葉片疏導組織細胞的超微觀察，發(fā)現(xiàn)BR處理后韌皮部輸導組織的細胞內含物增加；蔗糖是光合產(chǎn)物的主要運輸形式，蔗糖合成酶（SS）和蔗糖磷酸合成酶（SPS）是蔗糖合成的關鍵酶，其活性可反映同化物向籽粒運輸能力和強度，本研究發(fā)現(xiàn)BR處理后SS和SPS的活性分別提高了28.26%和30.20%，上述結果說明BR處理可提高玉米光合產(chǎn)物的輸出能力。油菜素內酯通過提高光合色素含量來提高玉米葉片的光能利用率；通過提高PEP羧化酶活性提高玉米葉片固定CO2的能力；通過提高蔗糖合成酶和蔗糖磷酸酶活性，促進玉米葉片光作用產(chǎn)生的有機物的運輸和分配。
油菜素內酯；捕光能力；CO2固定；有機物運輸；玉米
0 引言
【研究意義】油菜素內酯（BR，Brassinosteroid）是國際上公認的六大植物激素之一，可調控株高、改良株型、促進根系生長、提高抗逆性、降低農藥殘留以及改良品質等功效。在中國大步邁入農業(yè)現(xiàn)代化進程中，更深入詮釋BR調控農作物生長發(fā)育的機制和有效利用BR具有重要的理論意義和農業(yè)實踐價值?！厩叭搜芯窟M展】在農業(yè)生產(chǎn)中，從種子萌發(fā)到收獲的過程中都有應用BR的相關報道[1-3]，即BR可以用以拌種、浸種或噴施。在中國，BR主要在經(jīng)濟作物（如棉花）上應用較多，可提高棉花的產(chǎn)量和棉纖維的質量[4]。在糧食作物上（如小麥、玉米和水稻）中BR影響作物生長發(fā)育和產(chǎn)量形成的機制研究不夠深化，但研究表明BR可調控產(chǎn)量，在水稻中轉入BR合成途徑中編碼C-22羥基化酶的基因，促進BR的合成，可增加水稻的分蘗數(shù)、每穗粒數(shù)和千粒重，從而提高水稻的產(chǎn)量[5]。而且BR可增強植物的抗逆性、降低農藥殘留[6-8]，因此，BR是具有廣闊應用前景的化控激素。光合作用是作物產(chǎn)量形成的基礎及決定性因素，同時也是碳循環(huán)及其他物質循環(huán)的最重要環(huán)節(jié)[9]。高等植物固定CO2的途徑有3條：C3途徑（卡爾文循環(huán)）、C4途徑和景天酸代謝途徑。玉米中主要是C4途徑。玉米固定CO2最初的穩(wěn)定產(chǎn)物是四碳二羧酸化合物（蘋果酸和天冬氨酸），故稱為四碳二羧酸途徑（C4-dicarboxylic acid pathway），簡稱C4途徑（C4pathway），具有C4途徑的植物稱為C4植物。C4途徑的生化過程是：空氣中的CO2進入葉肉細胞后在磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶（phosphoenol plyruvate carboxylase，PEPC）催化下，被磷酸烯醇式丙酮酸（phosphoenol plyruvate，PEP）固定在草酰乙酸（oxaloacetic acid，OAA）的C4羧基上，因此PEPC是C4植物固定CO2的關鍵酶，PEPC是胞質酶，主要分布在葉肉細胞的細胞質中[10]。作物高產(chǎn)不僅需要高的葉片光合能力，還需要光合產(chǎn)物及時的運輸分配[11]。淀粉和蔗糖是光合作用的主要產(chǎn)物，光合作用制造的三碳糖可以在葉綠體中合成淀粉，貯存起來；也可以運出葉綠體在細胞質中合成蔗糖，蔗糖是有機物運輸?shù)闹饕问?，為植物體的其他器官提供能源和原料[12]。與蔗糖代謝和積累密切相關的酶主要有蔗糖磷酸合成酶（SPS）和蔗糖合成酶（SS），與淀粉積累速率和灌漿速率呈顯著相關性[13]。高溫可降低SPS和SS合成活性，導致糖分含量降低品質變劣[14]；劉鵬等[15]對玉米籽粒發(fā)育過程中蔗糖代謝和淀粉合成相關酶活性研究發(fā)現(xiàn)，蔗糖積累的原因主要是蔗糖合成能力增加而非降解量減少?！颈狙芯壳腥朦c】油菜素內酯能顯著提高植物的光合性能，但BR對玉米調控光合性能的機理尚未有系統(tǒng)研究，本項目針對調控C4途徑同化CO2的調控因素，研究油菜素內酯調控C4途徑的生理機制，以期在生產(chǎn)上高效利用BR，提高作物的光能利用率?！緮M解決的關鍵問題】解析油菜素內酯對玉米葉片捕光能力、CO2的固定能力和光合產(chǎn)物的積累、代謝及運輸?shù)挠绊憽?/p>
1 材料與方法
1.1 試驗材料
玉米品種是鄭單958，由河南省農業(yè)科學院糧油作物研究所選育，具有高產(chǎn)、穩(wěn)產(chǎn)、多抗特性，是農業(yè)部重點推廣品種。
1.2 試驗設計
玉米的培養(yǎng)條件為28℃、12 h光照；20℃、12 h黑暗。試驗所用油菜素內酯為人工合成的24-表油菜素內酯（24-Epicastasterone，24-eBL）。采用葉面噴施的方法，在玉米8葉期葉面噴施前期預實驗選定的濃度為100 nmol·L-1的24-eBL，每株20 mL，全株均勻噴施。噴施BR后15 d，選取第8位葉片進行各項指標的觀測和分析。
1.3 測定項目及方法
1.3.1 光合速率的測定 采用的紅外線CO2分析儀法[16]和LI-6400便攜式光合測定儀（LI-COR，美國）分別測定第8位葉片的葉片凈光合速率（n）。
1.3.2 葉綠素含量的測定 葉綠素含量的測定采用的是分光光度計法[16]。
1.3.3 PEPC活性的測定 酶的提取和活性的測定采用的是分光光度計法[17-18]。取玉米葉片0.5 g，加入預冷的提取緩沖液（100 mmol·L-1Tris-HCl，5%甘油，10 mmol·L-1巰基乙醇，1 mmol·L-1EDTA，1% PVP，pH 8.2）3 mL，冰浴研磨成勻漿，4℃ （15 000×）離心20 min，用分光光度法測定上清液PEPC活性。
1.3.4 葉片超微結構觀察 按照常規(guī)的電鏡超薄切片制作及觀察方法[19]制備超薄切片，透射電子顯微鏡下觀察葉綠體超微結構及韌皮部疏導組織細胞。
1.3.5 蔗糖磷酸合成酶（SPS）和蔗糖合成酶（SS）活性測定 蔗糖磷酸合成酶（SPS）活性測定采用的是劉鵬等[15]的方法。蔗糖合成酶（SS）活性參照趙智中等[20]的方法。
2 結果
2.1 油菜素內酯處理對葉片凈光合速率的影響
光合速率是判斷光合作用強弱的一個指標，油菜素內酯處理后玉米葉片的凈光合速率為37.56mmol CO2·m-2·s-1，對照葉片凈光合速率為28.32mmol CO2·m-2·s-1，油菜素內酯處理可提高葉片凈光合速率32.6%，差異極顯著（圖1）。這說明BR處理可增強玉米葉片的光合作用。
2.2 油菜素內酯處理對玉米葉片葉綠素含量的影響
為深入闡明BR提高光合速率的生理機制，本試驗比較了BR處理對葉片葉綠素含量的影響。因為葉綠素具有接受和轉換能量的作用，在一定范圍內，葉綠素含量越多，光合作用越強。圖2顯示，BR處理15 d后葉片葉綠素含量是0.27 mg·g-1FW，對照葉片葉綠素含量為0.21 mg·g-1FW，高出對照28.57%，達顯著性差異。這說明BR能提高玉米光合色素含量，提高玉米葉片的聚光能力，提高光能利用率。
*表示方差分析差異水平為極顯著。下同
圖2 油菜素內酯處理對玉米葉片葉綠素含量的影響
2.3 油菜素內酯處理對玉米葉片光合作用中CO2固定的關鍵酶PEPC活性的影響
植物光合作用所需要的碳源，主要是空氣中的CO2，對CO2的固定能力是影響光合速率非常重要的因素，PEPC是玉米碳同化過程的關鍵酶，PEPC活性的高低直接決定了玉米葉片CO2固定能力的強弱。本研究分析了BR處理8葉期玉米15 d后玉米葉片中PEPC的活性。結果表明，BR處理后玉米葉片PEPC的活性為57.36mmol CO2·h-1·mg-1，而對照葉片PEPC的活性為49.03mmol CO2·h-1·mg-1，BR處理后PEPC的活性提高了14.52%（圖3）。因此，BR可提高玉米葉片固定CO2的能力。
2.4 油菜素內酯處理對玉米葉片葉綠體和韌皮部疏導組織細胞超微結構的影響
葉片光合作用產(chǎn)生的同化產(chǎn)物主要是通過韌皮部進行運輸，因此韌皮部組織細胞中內含物的多少在一定程度上可反應光合產(chǎn)物的運輸情況。葉片光合作用產(chǎn)生的有機物在葉綠體中形成淀粉，因此葉綠體中淀粉粒的多少也是反應光合效率的一個指標。本研究利用透射電子顯微鏡比較分析了BR處理對玉米葉片疏導組織細胞超微結構及葉綠體中淀粉粒積累的影響。結果表明，對照葉片葉肉細胞的葉綠體呈梭形緊貼于細胞壁的內側（圖4-A），葉綠體基質和基粒片層整齊有序，類囊體緊密排列而整齊（圖4-C）；BR處理后葉綠體橫軸方向增大，葉綠體基質豐富，淀粉粒積累增加（圖4-B，D）。BR處理后韌皮部輸導組織的細胞內含物增加（圖4-A，B），說明BR處理可能促進了韌皮部細胞的代謝和有機物的運輸。
圖3 油菜素內酯處理對玉米葉片PEPC酶活性的影響
A：對照玉米葉片細胞超微結構；B：BR處理15 d后玉米葉片超微結構；C：對照玉米葉片細胞葉綠體超微結構；D：BR處理15 d后玉米葉片細胞葉綠體超微結構。MC：葉肉細胞；Cl：葉綠體；PC：韌皮部細胞；SG：淀粉粒
2.5 油菜素內酯處理對玉米葉片蔗糖代謝關鍵酶活性的影響
蔗糖是光合作用產(chǎn)物的主要運輸形式，蔗糖合成酶（SS）和蔗糖磷酸合成酶（SPS）是蔗糖合成的關鍵酶，其活性可反映同化物向籽粒運輸能力和強度。本研究測量了BR處理后與對照葉片中SS和SPS的活性，結果表明對照葉片的SS和SPS的活性分別是609.43和598.05mg·min-1·g-1FW，而BR處理15 d后，玉米葉片中SS和SPS的活性分別是781.65和778.67mg·min-1·g-1FW（圖5），BR處理后SS和SPS的活性分別提高了28.26%和30.20%。
圖5 BR處理對玉米葉片SS和SPS酶活性的影響
3 討論
水稻初花期噴施BR可顯著提高水稻葉片葉綠素和淀粉含量、增強光合速率[1]。Wu等[5]研究發(fā)現(xiàn)BR能促進水稻光合同化物從源向庫的轉運。在小麥花期噴施BR可提高小麥ADPG焦磷酸酶、淀粉合成酶及淀粉分支酶的活性[21]。淀粉需通過焦磷酸化酶、淀粉合成酶、淀粉分支酶催化的連續(xù)反應生成。上述研究結果說明BR可促進籽粒中淀粉的合成及和積累。籽粒中淀粉的合成需要原料，葉片中產(chǎn)生的光合產(chǎn)物的主要運輸形式是蔗糖，蔗糖合成酶和蔗糖磷酸合成酶主要負責降解卸載到籽粒中的蔗糖，從而為淀粉合成提供原料，同時光合產(chǎn)物從葉片中輸出的快慢也直接影響光合速率[11]。本研究結果表明BR處理可顯著提高蔗糖合成酶和蔗糖磷酸合成酶活性，說明BR可促進卸載到籽粒中蔗糖的降解，為淀粉的合成提供更多的原料。結合水稻和小麥中的研究結果，可以闡明BR促進光合產(chǎn)物從源向庫轉運的生理機制為BR通過提高蔗糖合成酶和蔗糖磷酸合成酶活性，快速降解從葉片運輸?shù)阶蚜Ｖ姓崽?，保障合成淀粉的原料需求；BR處理提高了ADPG焦磷酸酶、淀粉合成酶及淀粉分支酶的活性，加快淀粉的合成，加快消耗從葉片運來的蔗糖，促進光合產(chǎn)物從源向庫轉運，防止蔗糖積累對光合效率的抑制作用。
光合速率的提高需要更多的光能和光合作用原料CO2的供給。葉綠素在光合作用中參與光能的吸收、傳遞和轉換作用，葉綠素含量提高可以提高光合效率。已有研究表明BR處理可誘導編碼葉綠素生物合成和光合酶活性的特定基因的表達[22-24]。本研究發(fā)現(xiàn)，與對照相比，BR處理會促進玉米葉片的葉綠素含量上升，這說明BR確實促進了葉綠素生物合成途徑，促進了葉綠素的合成。玉米是C4植物，C4途徑的CO2固定最初是由PEPC催化來完成的。PEPC起著“CO2泵”的作用，把外界的CO2“壓”進維管束鞘用于有機物的同化[25-26]。本研究發(fā)現(xiàn)，BR處理可提高玉米葉片PEPC的活性，因而可以增加玉米葉片捕捉CO2的能力，增加光合作用的原料，形成更多的光合產(chǎn)物。
4 結論
油菜素內酯（BR）通過提高玉米葉片葉綠素含量，提高玉米葉片增強葉片的光能吸收和轉化能力，從而提高光能利用率；通過提高PEPC的活性，提高玉米葉片捕捉固定CO2的能力，為光合作用提供更多的原料；通過提高蔗糖合成酶和磷酸蔗糖合成酶活性，快速降解光合產(chǎn)物的主要的運輸形式蔗糖，為淀粉的合成和積累提供充足的原料，最終提高玉米葉片的光合速率和效率。
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（責任編輯 楊鑫浩）
The influence of Brassinosteroid on the Light Catching, CO2Fixation and the Translocation of Organic Compounds in maize leaves
ZANG JinPing1, ZHAO AiJia2, ZHAO YaLin1, YAN QingDi1, FENG JiaJia1, ZHANG HaiLi1, WANG FengRu1, DONG JinGao1
(1Department of life science, Hebei Agricultural University/Key Laboratory of Hebei Province for Plant Physiology and Molecular Pathology, Baoding 071001, Hebei;2The No.1 High School of Baoding, Baoding 071000, Hebei)
The objective of this study is to clear the influence and the molecular mechanism of brassinosteroid on the photosynthetic characteristics of action in maize (L.)leaves, and then to provide the theoretical basis and technical references for efficient using of brassinosteroid in maize field.We sprayed 100 nmol·L-1brassinosteroid on maize of 8 leaves period, then observed and analyzed the chloroplast structure, starch accumulation, chlorophyll content, phosphoenol plyruvate carboxylase (PEPC), photosynthetic rate, the activity of sucrose phosphate synthase (SPS) and sucrose synthase (SS) in leaves.After 15 days from brassinosteroid treatment, compared with the control treatment, the net photosynthetic rate increased by 32.6%. At the same time, the accumulation of starch grains in the chloroplast was increased significantly. Compared with the control, the chlorophyll content of the leaves treated with brassinosteroid increased by 28.57%. The above results showed that brassinosteroid treatment can improve the light-harvesting ability of maize leaves. PEPC is an enzyme that catalyzes the fixation of CO2in C4plants. The results showed that brassinosteroid treatment can improve the activity of PEPC in maize leaves, and the activity of PEPC increased by 14.52% compared with the control. This showed that brassinosteroid treatment can improve the ability of fixing CO2of maize leaves. Transportation of photosynthetic products is an important factor to determine yield. Through the ultrastructural observation of the phloem tissue cells of maize leaves, it was found that the cell inclusions in the phloem conducting tissue increased under brassinosteroid treatment. Sucrose is the main transportation form of photosynthetic products. Sucrose synthase and sucrose phosphate synthase are key enzymes in sucrose synthesis, and their activity can reflect the transport capacity and strength of photosynthetic products input to grain. In this study, the activity of sucrose synthase and sucrose phosphate synthase increased by 28.26% and 30.20%, respectively, under brassinosteroid treatment. The results showed that brassinosteroid treatment could improve the output ability of maize photosynthetic products.Brassinosteroid can raise the light energy utilization of maize blades by raising the photosynthetic pigment content, can enhance the capacity of maize leaf CO2fixation by raising the PEP carboxylase activity, and can promote the transformation and transportation of organic matter in maize leaf through raising the activity of sucrose synthase and sucrose phosphatase.
brassinosteroid; light-harvesting ability; CO2fixation; organic matter transport; maize
2017-03-20；接受日期：2017-06-19
河北省自然科學基金（C2017204060）、國家重點研發(fā)計劃-東北春玉米區(qū)主要病蟲草害的綠色防控技術（2016YFD0300704）、國家玉米產(chǎn)業(yè)技術體系專項（CARS-02-25）
藏金萍，E-mail：zangjp@hebau.edu.cn。趙艾佳，E-mail：873742820@qq.com。藏金萍和趙艾佳為同等貢獻作者。通信作者王鳳茹，E-mail：wfr15931945160@126.com。通信作者董金皋，E-mail：dongjingao@126.com
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藏金萍，趙艾佳，趙亞林，閆青地，馮佳佳，張海麗，王鳳茹，董金皋
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油菜素內酯對玉米葉片捕光、CO2固定及有機物運輸?shù)挠绊?/p>
藏金萍1，趙艾佳2，趙亞林1，閆青地1，馮佳佳1，張海麗1，王鳳茹1，董金皋1
（1河北農業(yè)大學生命科學學院/河北省植物生理與分子病理學重點實驗室，河北保定 071001；2河北保定一中，河北保定 071000）
明確油菜素內酯（BR）對玉米光合特性的影響及作用機制，為油菜素內酯在玉米田的高效利用提供理論依據(jù)和技術參考。于玉米8葉期噴施100 nmol·L-1BR，對其葉片進行葉綠體結構、淀粉粒積累、葉綠素含量、PEPC活性、光合速率、蔗糖磷酸合成酶（SPS）和蔗糖合成酶（SS）活性的檢測與分析。油菜素內酯處理8葉期玉米15 d后，與對照相比，玉米葉片的凈光合速率提高了32.6%，同時，葉綠體中淀粉粒的積累明顯變多變大，葉綠素含量高出對照28.57%，以上結果說明BR處理可提高玉米葉片的捕光能力；PEPC是C4植物中催化PEP固定CO2的酶，本研究結果表明BR處理可提高玉米葉片中PEPC的活性，與對照相比，其活性提高了14.52%，這說明BR處理可提高玉米葉片固定CO2的能力；光合產(chǎn)物運輸是決定產(chǎn)量的重要因素，通過對玉米葉片疏導組織細胞的超微觀察，發(fā)現(xiàn)BR處理后韌皮部輸導組織的細胞內含物增加；蔗糖是光合產(chǎn)物的主要運輸形式，蔗糖合成酶（SS）和蔗糖磷酸合成酶（SPS）是蔗糖合成的關鍵酶，其活性可反映同化物向籽粒運輸能力和強度，本研究發(fā)現(xiàn)BR處理后SS和SPS的活性分別提高了28.26%和30.20%，上述結果說明BR處理可提高玉米光合產(chǎn)物的輸出能力。油菜素內酯通過提高光合色素含量來提高玉米葉片的光能利用率；通過提高PEP羧化酶活性提高玉米葉片固定CO2的能力；通過提高蔗糖合成酶和蔗糖磷酸酶活性，促進玉米葉片光作用產(chǎn)生的有機物的運輸和分配。
油菜素內酯；捕光能力；CO2固定；有機物運輸；玉米
0 引言
【研究意義】油菜素內酯（BR，Brassinosteroid）是國際上公認的六大植物激素之一，可調控株高、改良株型、促進根系生長、提高抗逆性、降低農藥殘留以及改良品質等功效。在中國大步邁入農業(yè)現(xiàn)代化進程中，更深入詮釋BR調控農作物生長發(fā)育的機制和有效利用BR具有重要的理論意義和農業(yè)實踐價值?！厩叭搜芯窟M展】在農業(yè)生產(chǎn)中，從種子萌發(fā)到收獲的過程中都有應用BR的相關報道[1-3]，即BR可以用以拌種、浸種或噴施。在中國，BR主要在經(jīng)濟作物（如棉花）上應用較多，可提高棉花的產(chǎn)量和棉纖維的質量[4]。在糧食作物上（如小麥、玉米和水稻）中BR影響作物生長發(fā)育和產(chǎn)量形成的機制研究不夠深化，但研究表明BR可調控產(chǎn)量，在水稻中轉入BR合成途徑中編碼C-22羥基化酶的基因，促進BR的合成，可增加水稻的分蘗數(shù)、每穗粒數(shù)和千粒重，從而提高水稻的產(chǎn)量[5]。而且BR可增強植物的抗逆性、降低農藥殘留[6-8]，因此，BR是具有廣闊應用前景的化控激素。光合作用是作物產(chǎn)量形成的基礎及決定性因素，同時也是碳循環(huán)及其他物質循環(huán)的最重要環(huán)節(jié)[9]。高等植物固定CO2的途徑有3條：C3途徑（卡爾文循環(huán)）、C4途徑和景天酸代謝途徑。玉米中主要是C4途徑。玉米固定CO2最初的穩(wěn)定產(chǎn)物是四碳二羧酸化合物（蘋果酸和天冬氨酸），故稱為四碳二羧酸途徑（C4-dicarboxylic acid pathway），簡稱C4途徑（C4pathway），具有C4途徑的植物稱為C4植物。C4途徑的生化過程是：空氣中的CO2進入葉肉細胞后在磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶（phosphoenol plyruvate carboxylase，PEPC）催化下，被磷酸烯醇式丙酮酸（phosphoenol plyruvate，PEP）固定在草酰乙酸（oxaloacetic acid，OAA）的C4羧基上，因此PEPC是C4植物固定CO2的關鍵酶，PEPC是胞質酶，主要分布在葉肉細胞的細胞質中[10]。作物高產(chǎn)不僅需要高的葉片光合能力，還需要光合產(chǎn)物及時的運輸分配[11]。淀粉和蔗糖是光合作用的主要產(chǎn)物，光合作用制造的三碳糖可以在葉綠體中合成淀粉，貯存起來；也可以運出葉綠體在細胞質中合成蔗糖，蔗糖是有機物運輸?shù)闹饕问?，為植物體的其他器官提供能源和原料[12]。與蔗糖代謝和積累密切相關的酶主要有蔗糖磷酸合成酶（SPS）和蔗糖合成酶（SS），與淀粉積累速率和灌漿速率呈顯著相關性[13]。高溫可降低SPS和SS合成活性，導致糖分含量降低品質變劣[14]；劉鵬等[15]對玉米籽粒發(fā)育過程中蔗糖代謝和淀粉合成相關酶活性研究發(fā)現(xiàn)，蔗糖積累的原因主要是蔗糖合成能力增加而非降解量減少?！颈狙芯壳腥朦c】油菜素內酯能顯著提高植物的光合性能，但BR對玉米調控光合性能的機理尚未有系統(tǒng)研究，本項目針對調控C4途徑同化CO2的調控因素，研究油菜素內酯調控C4途徑的生理機制，以期在生產(chǎn)上高效利用BR，提高作物的光能利用率?！緮M解決的關鍵問題】解析油菜素內酯對玉米葉片捕光能力、CO2的固定能力和光合產(chǎn)物的積累、代謝及運輸?shù)挠绊憽?/p>
1 材料與方法
1.1 試驗材料
玉米品種是鄭單958，由河南省農業(yè)科學院糧油作物研究所選育，具有高產(chǎn)、穩(wěn)產(chǎn)、多抗特性，是農業(yè)部重點推廣品種。
1.2 試驗設計
玉米的培養(yǎng)條件為28℃、12 h光照；20℃、12 h黑暗。試驗所用油菜素內酯為人工合成的24-表油菜素內酯（24-Epicastasterone，24-eBL）。采用葉面噴施的方法，在玉米8葉期葉面噴施前期預實驗選定的濃度為100 nmol·L-1的24-eBL，每株20 mL，全株均勻噴施。噴施BR后15 d，選取第8位葉片進行各項指標的觀測和分析。
1.3 測定項目及方法
1.3.1 光合速率的測定 采用的紅外線CO2分析儀法[16]和LI-6400便攜式光合測定儀（LI-COR，美國）分別測定第8位葉片的葉片凈光合速率（n）。
1.3.2 葉綠素含量的測定 葉綠素含量的測定采用的是分光光度計法[16]。
1.3.3 PEPC活性的測定 酶的提取和活性的測定采用的是分光光度計法[17-18]。取玉米葉片0.5 g，加入預冷的提取緩沖液（100 mmol·L-1Tris-HCl，5%甘油，10 mmol·L-1巰基乙醇，1 mmol·L-1EDTA，1% PVP，pH 8.2）3 mL，冰浴研磨成勻漿，4℃ （15 000×）離心20 min，用分光光度法測定上清液PEPC活性。
1.3.4 葉片超微結構觀察 按照常規(guī)的電鏡超薄切片制作及觀察方法[19]制備超薄切片，透射電子顯微鏡下觀察葉綠體超微結構及韌皮部疏導組織細胞。
1.3.5 蔗糖磷酸合成酶（SPS）和蔗糖合成酶（SS）活性測定 蔗糖磷酸合成酶（SPS）活性測定采用的是劉鵬等[15]的方法。蔗糖合成酶（SS）活性參照趙智中等[20]的方法。
2 結果
2.1 油菜素內酯處理對葉片凈光合速率的影響
光合速率是判斷光合作用強弱的一個指標，油菜素內酯處理后玉米葉片的凈光合速率為37.56mmol CO2·m-2·s-1，對照葉片凈光合速率為28.32mmol CO2·m-2·s-1，油菜素內酯處理可提高葉片凈光合速率32.6%，差異極顯著（圖1）。這說明BR處理可增強玉米葉片的光合作用。
2.2 油菜素內酯處理對玉米葉片葉綠素含量的影響
為深入闡明BR提高光合速率的生理機制，本試驗比較了BR處理對葉片葉綠素含量的影響。因為葉綠素具有接受和轉換能量的作用，在一定范圍內，葉綠素含量越多，光合作用越強。圖2顯示，BR處理15 d后葉片葉綠素含量是0.27 mg·g-1FW，對照葉片葉綠素含量為0.21 mg·g-1FW，高出對照28.57%，達顯著性差異。這說明BR能提高玉米光合色素含量，提高玉米葉片的聚光能力，提高光能利用率。
*表示方差分析差異水平為極顯著。下同
圖2 油菜素內酯處理對玉米葉片葉綠素含量的影響
2.3 油菜素內酯處理對玉米葉片光合作用中CO2固定的關鍵酶PEPC活性的影響
植物光合作用所需要的碳源，主要是空氣中的CO2，對CO2的固定能力是影響光合速率非常重要的因素，PEPC是玉米碳同化過程的關鍵酶，PEPC活性的高低直接決定了玉米葉片CO2固定能力的強弱。本研究分析了BR處理8葉期玉米15 d后玉米葉片中PEPC的活性。結果表明，BR處理后玉米葉片PEPC的活性為57.36mmol CO2·h-1·mg-1，而對照葉片PEPC的活性為49.03mmol CO2·h-1·mg-1，BR處理后PEPC的活性提高了14.52%（圖3）。因此，BR可提高玉米葉片固定CO2的能力。
2.4 油菜素內酯處理對玉米葉片葉綠體和韌皮部疏導組織細胞超微結構的影響
葉片光合作用產(chǎn)生的同化產(chǎn)物主要是通過韌皮部進行運輸，因此韌皮部組織細胞中內含物的多少在一定程度上可反應光合產(chǎn)物的運輸情況。葉片光合作用產(chǎn)生的有機物在葉綠體中形成淀粉，因此葉綠體中淀粉粒的多少也是反應光合效率的一個指標。本研究利用透射電子顯微鏡比較分析了BR處理對玉米葉片疏導組織細胞超微結構及葉綠體中淀粉粒積累的影響。結果表明，對照葉片葉肉細胞的葉綠體呈梭形緊貼于細胞壁的內側（圖4-A），葉綠體基質和基粒片層整齊有序，類囊體緊密排列而整齊（圖4-C）；BR處理后葉綠體橫軸方向增大，葉綠體基質豐富，淀粉粒積累增加（圖4-B，D）。BR處理后韌皮部輸導組織的細胞內含物增加（圖4-A，B），說明BR處理可能促進了韌皮部細胞的代謝和有機物的運輸。
圖3 油菜素內酯處理對玉米葉片PEPC酶活性的影響
A：對照玉米葉片細胞超微結構；B：BR處理15 d后玉米葉片超微結構；C：對照玉米葉片細胞葉綠體超微結構；D：BR處理15 d后玉米葉片細胞葉綠體超微結構。MC：葉肉細胞；Cl：葉綠體；PC：韌皮部細胞；SG：淀粉粒
2.5 油菜素內酯處理對玉米葉片蔗糖代謝關鍵酶活性的影響
蔗糖是光合作用產(chǎn)物的主要運輸形式，蔗糖合成酶（SS）和蔗糖磷酸合成酶（SPS）是蔗糖合成的關鍵酶，其活性可反映同化物向籽粒運輸能力和強度。本研究測量了BR處理后與對照葉片中SS和SPS的活性，結果表明對照葉片的SS和SPS的活性分別是609.43和598.05mg·min-1·g-1FW，而BR處理15 d后，玉米葉片中SS和SPS的活性分別是781.65和778.67mg·min-1·g-1FW（圖5），BR處理后SS和SPS的活性分別提高了28.26%和30.20%。
圖5 BR處理對玉米葉片SS和SPS酶活性的影響
3 討論
水稻初花期噴施BR可顯著提高水稻葉片葉綠素和淀粉含量、增強光合速率[1]。Wu等[5]研究發(fā)現(xiàn)BR能促進水稻光合同化物從源向庫的轉運。在小麥花期噴施BR可提高小麥ADPG焦磷酸酶、淀粉合成酶及淀粉分支酶的活性[21]。淀粉需通過焦磷酸化酶、淀粉合成酶、淀粉分支酶催化的連續(xù)反應生成。上述研究結果說明BR可促進籽粒中淀粉的合成及和積累。籽粒中淀粉的合成需要原料，葉片中產(chǎn)生的光合產(chǎn)物的主要運輸形式是蔗糖，蔗糖合成酶和蔗糖磷酸合成酶主要負責降解卸載到籽粒中的蔗糖，從而為淀粉合成提供原料，同時光合產(chǎn)物從葉片中輸出的快慢也直接影響光合速率[11]。本研究結果表明BR處理可顯著提高蔗糖合成酶和蔗糖磷酸合成酶活性，說明BR可促進卸載到籽粒中蔗糖的降解，為淀粉的合成提供更多的原料。結合水稻和小麥中的研究結果，可以闡明BR促進光合產(chǎn)物從源向庫轉運的生理機制為BR通過提高蔗糖合成酶和蔗糖磷酸合成酶活性，快速降解從葉片運輸?shù)阶蚜Ｖ姓崽?，保障合成淀粉的原料需求；BR處理提高了ADPG焦磷酸酶、淀粉合成酶及淀粉分支酶的活性，加快淀粉的合成，加快消耗從葉片運來的蔗糖，促進光合產(chǎn)物從源向庫轉運，防止蔗糖積累對光合效率的抑制作用。
光合速率的提高需要更多的光能和光合作用原料CO2的供給。葉綠素在光合作用中參與光能的吸收、傳遞和轉換作用，葉綠素含量提高可以提高光合效率。已有研究表明BR處理可誘導編碼葉綠素生物合成和光合酶活性的特定基因的表達[22-24]。本研究發(fā)現(xiàn)，與對照相比，BR處理會促進玉米葉片的葉綠素含量上升，這說明BR確實促進了葉綠素生物合成途徑，促進了葉綠素的合成。玉米是C4植物，C4途徑的CO2固定最初是由PEPC催化來完成的。PEPC起著“CO2泵”的作用，把外界的CO2“壓”進維管束鞘用于有機物的同化[25-26]。本研究發(fā)現(xiàn)，BR處理可提高玉米葉片PEPC的活性，因而可以增加玉米葉片捕捉CO2的能力，增加光合作用的原料，形成更多的光合產(chǎn)物。
4 結論
油菜素內酯（BR）通過提高玉米葉片葉綠素含量，提高玉米葉片增強葉片的光能吸收和轉化能力，從而提高光能利用率；通過提高PEPC的活性，提高玉米葉片捕捉固定CO2的能力，為光合作用提供更多的原料；通過提高蔗糖合成酶和磷酸蔗糖合成酶活性，快速降解光合產(chǎn)物的主要的運輸形式蔗糖，為淀粉的合成和積累提供充足的原料，最終提高玉米葉片的光合速率和效率。
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（責任編輯 楊鑫浩）
The influence of Brassinosteroid on the Light Catching, CO2Fixation and the Translocation of Organic Compounds in maize leaves
ZANG JinPing1, ZHAO AiJia2, ZHAO YaLin1, YAN QingDi1, FENG JiaJia1, ZHANG HaiLi1, WANG FengRu1, DONG JinGao1
(1Department of life science, Hebei Agricultural University/Key Laboratory of Hebei Province for Plant Physiology and Molecular Pathology, Baoding 071001, Hebei;2The No.1 High School of Baoding, Baoding 071000, Hebei)
The objective of this study is to clear the influence and the molecular mechanism of brassinosteroid on the photosynthetic characteristics of action in maize (L.)leaves, and then to provide the theoretical basis and technical references for efficient using of brassinosteroid in maize field.We sprayed 100 nmol·L-1brassinosteroid on maize of 8 leaves period, then observed and analyzed the chloroplast structure, starch accumulation, chlorophyll content, phosphoenol plyruvate carboxylase (PEPC), photosynthetic rate, the activity of sucrose phosphate synthase (SPS) and sucrose synthase (SS) in leaves.After 15 days from brassinosteroid treatment, compared with the control treatment, the net photosynthetic rate increased by 32.6%. At the same time, the accumulation of starch grains in the chloroplast was increased significantly. Compared with the control, the chlorophyll content of the leaves treated with brassinosteroid increased by 28.57%. The above results showed that brassinosteroid treatment can improve the light-harvesting ability of maize leaves. PEPC is an enzyme that catalyzes the fixation of CO2in C4plants. The results showed that brassinosteroid treatment can improve the activity of PEPC in maize leaves, and the activity of PEPC increased by 14.52% compared with the control. This showed that brassinosteroid treatment can improve the ability of fixing CO2of maize leaves. Transportation of photosynthetic products is an important factor to determine yield. Through the ultrastructural observation of the phloem tissue cells of maize leaves, it was found that the cell inclusions in the phloem conducting tissue increased under brassinosteroid treatment. Sucrose is the main transportation form of photosynthetic products. Sucrose synthase and sucrose phosphate synthase are key enzymes in sucrose synthesis, and their activity can reflect the transport capacity and strength of photosynthetic products input to grain. In this study, the activity of sucrose synthase and sucrose phosphate synthase increased by 28.26% and 30.20%, respectively, under brassinosteroid treatment. The results showed that brassinosteroid treatment could improve the output ability of maize photosynthetic products.Brassinosteroid can raise the light energy utilization of maize blades by raising the photosynthetic pigment content, can enhance the capacity of maize leaf CO2fixation by raising the PEP carboxylase activity, and can promote the transformation and transportation of organic matter in maize leaf through raising the activity of sucrose synthase and sucrose phosphatase.
brassinosteroid; light-harvesting ability; CO2fixation; organic matter transport; maize
2017-03-20；接受日期：2017-06-19
河北省自然科學基金（C2017204060）、國家重點研發(fā)計劃-東北春玉米區(qū)主要病蟲草害的綠色防控技術（2016YFD0300704）、國家玉米產(chǎn)業(yè)技術體系專項（CARS-02-25）
藏金萍，E-mail：zangjp@hebau.edu.cn。趙艾佳，E-mail：873742820@qq.com。藏金萍和趙艾佳為同等貢獻作者。通信作者王鳳茹，E-mail：wfr15931945160@126.com。通信作者董金皋，E-mail：dongjingao@126.com
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