香菇多糖提取物體外抗IHNV的機制

任廣明，徐黎明，趙景壯，尹家勝，盧彤巖

（中國水產(chǎn)科學研究院黑龍江水產(chǎn)研究所，黑龍江 哈爾濱 150070）

香菇多糖提取物體外抗IHNV的機制

任廣明，徐黎明，趙景壯，尹家勝，盧彤巖

（中國水產(chǎn)科學研究院黑龍江水產(chǎn)研究所，黑龍江 哈爾濱 150070）

本研究以虹鱒性腺細胞（rainbowtrout gonad cell，RTG）為細胞模型，采用MTT法體外測定香菇多糖提取物的細胞毒性及其對傳染性造血器官壞死病毒（IHNV）直接滅活、預防與生物合成的影響，探討香菇多糖提取物抗IHNV的作用機制。結(jié)果顯示：香菇多糖提取物對RTG細胞沒有毒性作用。濃度為100μg/mL時，香菇多糖提取物對IHNV的直接滅活能力為52.48%，預防效果為50.38%，抑制IHNV生物合成的能力達84.41%。結(jié)果表明：香菇多糖提取物具有一定的抗IHNV作用，該作用主要與抑制IHNV在細胞內(nèi)的生物合成有關(guān)。

香菇多糖提取物；抗IHNV；抗病毒機制

傳染性造血器官壞死?。↖nfectious hematopoietic necrosis，IHN）是影響我國鮭鱒漁業(yè)發(fā)展最為致命的病毒性疾病，其病原為傳染性造血器官壞死病病毒（Infectious hematopoietic necrosis virus，IHNV）[1,2]。該病毒一旦侵入魚體，首先在魚體腎臟和脾臟造血組織增殖，進入血液循環(huán)后便在魚體各個器官中繁殖，引發(fā)鮭鱒突發(fā)性死亡[3]。近些年來，我國鮭鱒主產(chǎn)區(qū)多次暴發(fā)大規(guī)模的IHNV事件。2009年甘肅省某大型虹鱒養(yǎng)殖場稚魚突然出現(xiàn)大面積死亡，死亡率約為90%[4]。2011年青海省大部分養(yǎng)殖場暴發(fā)IHN疫情，造成的經(jīng)濟損失達47.1萬元。2013年吉林省與遼寧省部分養(yǎng)殖場虹鱒大量死亡[5,6]。2014年北京市、四川省、山東省等地陸續(xù)暴發(fā)IHN疫情。中國農(nóng)業(yè)部《獸醫(yī)公報》發(fā)布的中國水生動物疫病狀況報告顯示，2015年對10?。ㄊ校┰O置的253個監(jiān)測場點的監(jiān)測表明，陽性樣品檢出率平均為5.4%[7]?？梢?，隨著水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)的不斷發(fā)展，IHNV對冷水魚養(yǎng)殖業(yè)危害不斷擴大，嚴重威脅健康養(yǎng)殖的發(fā)展。

多糖（polysaccharide）是一種天然的生物活性成分，具有調(diào)節(jié)機體免疫力、抗病毒、抗腫瘤、抗氧化、降血糖等作用[8]。研究表明，多糖可以激活T淋巴細胞、B淋巴細胞、自然殺傷細胞等免疫細胞參與機體免疫，尤其是可以誘導干擾素的產(chǎn)生、活化補體而抵抗病毒的侵襲[9]。多糖糖鏈中含有的模擬配體結(jié)構(gòu)與病毒具有一定的相似性，能夠阻斷病毒與宿胞表面結(jié)合，加強細胞修復及細胞膜的穩(wěn)定，抑制病原體的侵入。多糖還能夠通過阻止病毒在機體內(nèi)的復制起到抗病毒的作用。目前多糖在抑制和治療肝炎病毒、帶狀皰疹病毒、Abelson病毒、流感病毒中都顯示出誘人的應用前景[10]。本研究以RTG細胞系為細胞模型，通過不同給藥方式分析香菇多糖Lentian提取物抗IHNV的能力，探索其抗IHNV機制，為香菇多糖提取物抗IHNV機制的深入研究奠定一定的理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 香菇多糖提取物

香菇多糖提取物由東北農(nóng)業(yè)大學資源與環(huán)境學院微生物系曲娟娟教授惠贈。香菇多糖提取物用雙蒸水配成10mg/mL母液，0.22μm微孔濾膜過濾除菌，分裝，-20℃保存。實驗時采用M199維持液稀釋至所需濃度。

1.1.2 細胞與毒株

IHNV毒株HLJ-15由黑龍江水產(chǎn)研究所水產(chǎn)病害實驗室分離保存。虹鱒性腺細胞（rainbowtrout gonad cell，RTG）由中國水產(chǎn)科學研究院長江水產(chǎn)研究所魚病害研究室曾令兵教授惠贈。

1.2 方法

1.2.1 病毒滴度測定

用M199維持液10倍系列梯度稀釋（10-1～10-9）HLJ-15病毒株，分別加入到生長良好的RTG細胞中（96孔板），每孔加入稀釋液體100μL，每個稀釋度設置6個重復孔，正常細胞（不接種病毒的細胞）為對照組。隨后置于15℃、5%的CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)7d，逐日觀察細胞病變程度（Cytopathic effect，CPE）。培養(yǎng)終止后，結(jié)晶紫染色，根據(jù)Reed-Münch 公式計算病毒半數(shù)感染量（TCID50）[11]。lgTCID50=距離比×稀釋度對數(shù)之差+高于50%病變率的稀釋度的對數(shù)。實驗重復3次。

1.2.2 香菇多糖提取物的細胞毒性測定

將不同稀釋濃度的香菇多糖提取物溶液（12.5μg/mL、25μg/mL、50μg/mL、75μg/mL、100μg/mL、125μg/mL）加入到生長狀態(tài)良好的RTG細胞中（96孔板），每孔加入100μL，每個稀釋度設6個重復，同時設正常對照組（不加入香菇多糖提取物稀釋液）和空白對照組（不接入細胞，不加入香菇多糖提取物稀釋液）。18℃下5%的CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)7d后取出培養(yǎng)板，MTT法測定細胞活性[12]。細胞存活率 =A香菇多糖組/A正常對照組×100%。

1.2.3 香菇多糖提取物抗病毒實驗

1.2.3.1 香菇多糖提取物對病毒的直接滅活作用

將不同倍比稀釋的香菇多糖提取物溶液與100TCID50病毒液等體積混合，15℃孵育2h后，分別加入到已培養(yǎng)至單層的RTG細胞（96孔板）中，每孔100μL，于15℃、5%的CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)2h后，吸棄培養(yǎng)液換用維持液。實驗同時設正常細胞組（不加入香菇多糖提取物溶液、不接病毒）、病毒對照組（不加入香菇多糖提取物溶液）與空白對照組（不接細胞、不加入香菇多糖提取物溶液、不接病毒），每組設6孔重復，15℃、5%的CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)并觀察CPE情況，當病毒對照組CPE達到75%以上時，記錄各組CPE（CPE判定標準：記錄“-”為正常細胞，“+”為 25%以上的細胞出現(xiàn) CPE，“++”為50%以上的細胞出現(xiàn)CPE?！?++”為75%以上細胞出現(xiàn)CPE），并采用MTT法測定香菇多糖提取物對病毒的直接滅活作用。此實驗重復3次。病毒抑制率 =（A香菇多糖組-A病毒組）/（A正常對照組-A病毒組）×100%。

1.2.3.2 香菇多糖提取物對病毒的預防作用

將不同倍比稀釋的香菇多糖提取物溶液分別加入到培養(yǎng)至單層的96孔板RTG細胞中，每孔接入100μL，18℃培養(yǎng)2h后吸棄上清液，PBS清洗后，每孔分別接入100μL含100TCID50病毒懸液。同時設正常細胞組、病毒對照組與空白對照組，每組設6孔重復，15℃、5%的CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)并觀察CPE情況。當病毒對照組CPE達到75%以上時，記錄各組CPE情況，用MTT法測定香菇多糖提取物對病毒的預防作用。此實驗重復3次。

1.2.3.3 香菇多糖提取物對病毒生物合成的抑制作用

將100μL含100TCID50病毒的懸液加入到已培養(yǎng)至單層的96孔板RTG細胞中，15℃培養(yǎng)2h后吸棄病毒液，PBS清洗后，每孔分別接入100μL含有不同倍比稀釋的香菇多糖提取物溶液。同時設正常細胞組、病毒對照組與空白對照組，每組設6孔重復，15℃、5%的CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)并觀察CPE情況。當病毒對照組CPE達到75%以上時，記錄各組CPE情況，采用MTT法測定香菇多糖提取物對病毒生物合成的抑制作用。此實驗重復3次。

1.3 數(shù)據(jù)處理

數(shù)據(jù)采用平均值±標準誤表示，采用SPSS19.0軟件包中的單因素方差分析（one-way-ANOVA），樣本間行t檢驗（P＜0.05）。采用Probit回歸分析法計算香菇多糖提取物對病毒的半數(shù)抑制濃度IC50。

2 結(jié)果與分析

2.1 病毒滴度測定

據(jù) Reed-Münch法計算，HLJ-15病毒株的TCID50為10-7.5，即接種滴度為10-7.5的HLJ-15病毒懸液100μL可使50%的RTG細胞發(fā)生病變，本實驗用病毒為100TCID50。

2.2 香菇多糖提取物對細胞的毒性

由圖1可知，香菇多糖提取物濃度為12.5～125μg/mL時，RTG細胞存活率達90%以上，其對RTG細胞的增殖作用差異不顯著（P＜0.05），對RTG細胞沒有毒性作用。當香菇多糖濃度為100μg/mL時，細胞存活率達95%以上，此濃度即為香菇多糖作用于RTG細胞的最高安全濃度[13]。

圖1 香菇多糖提取物對細胞的毒性Fig.1 The cytotoxicity of Lentinan extracts to rainbow trout gonad cell（RTG）

2.3 香菇多糖提取物的抗病毒活性

2.3.1 香菇多糖提取物對IHNV的直接滅活作用

由表1可知，不同濃度的香菇多糖提取物均具有不同程度減輕細胞病變的作用，且隨著香菇多糖提取物濃度的增加，IHNV抑制率逐漸增高，表現(xiàn)出一定的量效關(guān)系。這一結(jié)果證明，香菇多糖提取物對IHNV具有直接滅活作用。當濃度為1.56μg/mL時，香菇多糖提取物對IHNV的抑制能力達到9.70%；濃度為100μg/mL時，香菇多糖提取物對IHNV的抑制能力提高至52.48%，其IC50為115.94μg/mL。

表1 香菇多糖提取物對IHNV毒的直接滅活作用Tab.1 Effect of Lentinan extracts on direct inactivation of IHNV

2.3.2 香菇多糖提取物對IHNV的預防作用

由表2可知，香菇多糖提取物具有不同程度的預防細胞發(fā)生病變的作用，隨著香菇多糖提取物濃度的升高，其預防能力逐漸提高，呈現(xiàn)出一定的量效關(guān)系。濃度為1.56μg/mL時，香菇多糖提取物保護細胞免受IHNV侵染的能力為5.54%；隨著香菇多糖提取物濃度的增大，其保護細胞免受IHNV侵染的能力升高44.84%，即在濃度為100μg/mL時，香菇多糖提取物保護細胞免受IHNV的侵染能力達到50.38%?；貧w分析可知，香菇多糖提取物的IC50為91.26μg/mL。

表2 香菇多糖提取物對IHNV的預防作用Tab.2 Effect of Lentinan extracts on prevention of IHNV

2.3.3 香菇多糖提取物對IHNV生物合成的抑制作用

由表3可知，香菇多糖提取物均具有不同程度的抑制IHNV生物合成的作用。濃度為1.56μg/mL時，香菇多糖提取物抑制IHNV生物合成的作用僅為6.10%；隨著香菇多糖提取物濃度增至6.25μg/mL時，其抑制作用升高到47.80%；當濃度為100μg/mL時，香菇多糖提取物對IHNV的生物合成抑制能力達到84.41%，香菇多糖提取物的IC50為 11.57μg/mL。

表3 香菇多糖提取物對IHNV生物合成的抑制作用Tab.3 Effect of Lentinan extracts on inhibition of IHNV biosynthesis

3 討論

IHNV屬于彈狀病毒科Rhabdoviridae諾拉彈狀病毒屬Novirhabdovirus，主要感染鮭鱒，包括虹鱒Oncorhynchus mykiss、大馬哈魚 Oncorhynchus、大西洋鮭 Salmo salar以及硬頭鮭（Steelhead，Salmon Gairdneri）等[14,15]。根據(jù)魚的種類、年齡、病毒株系以及環(huán)境條件的不同，IHN暴發(fā)可導致鮭鱒魚苗死亡率接近100%、成魚死亡率達到25%～30%[2]。中國已將IHN列為二類疫病[16]。

目前，我國尚無可用于防治IHN的有效藥物，主要以預防為主。傳統(tǒng)的抗生素類藥物防控IHN的效果甚微，且其在魚體殘留等問題，已經(jīng)被許多國家禁止使用[17]。由于致病毒株存在變異、受環(huán)境條件以及生物安全性等因素的制約，限制商品化疫苗的引入及其應用。多糖為天然活性物質(zhì)，來源廣泛，提取成本低，具有增強機體免疫能力、抗病毒、抗炎癥、抑菌等生理功能。它能夠參與生命現(xiàn)象中如細胞分裂、細胞識別、細胞間物質(zhì)運輸?shù)戎匾^程[18]。針對多糖抗病毒的特點，研究學者已開展大量的科學研究。目前，多糖對肝炎病毒、帶狀皰疹病毒、Abelson病毒、流感病毒等都展現(xiàn)出良好的抑制效果[10]。

目前，多糖抗病毒主要應用于動物病毒、植物病毒的研究，在水產(chǎn)動物病毒防治的研究還鮮有報道。本研究以RTG細胞系為細胞模型研究香菇多糖提取物對IHNV所致細胞病變的抑制作用。結(jié)果表明：香菇多糖提取物對IHNV具有直接的滅活作用、預防作用及抑制病毒生物合成的作用，其中抑制病毒生物合成的作用更為顯著?？梢?，香菇多糖提取物抑制IHNV的作用機制可能存在多種途徑，抑制IHNV在細胞內(nèi)生物合成是香菇多糖提取物抗IHNV活性的重要途徑之一。這與已報道的鈍頂螺旋藻Spirulina platensis多糖[19]抑制單純皰疹病毒，板藍根Isatis Root多糖[20]抗豬繁殖與呼吸綜合征病毒的作用機制較為相似。已有研究發(fā)現(xiàn)，多糖能夠通過刺激巨噬細胞、T淋巴細胞等免疫細胞，阻止病毒在機體內(nèi)復制而起到抗病毒的目的[10]。

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Anti-IHNV Mechanism of Lentinan Extracts in vitro

REN Guang-ming,XU Li-ming,ZHAO Jing-zhuang,YIN Jia-sheng,LU Tong-yan
（Heilongjiang River Fisheries Research Institute,Chinese Academy of Fishery Sciences,Harbin 150070,China）

Anti-IHNV（Infectious hematopoietic necrosis virus）activity and antiviral mechanism of Lentinan extracts in vitro were investigated,cytotoxicity as an indicator,based on the cytopathic effect and MTT assay using rainbow trout gonad cell（RTG）lines to evaluate the role of Lentinan extracts in direct inactivation,prevention and the biosynthesis inhibition of IHNV.The results showed that the Lentinan extracts had little cytotoxicity to RTG cells,with direct inactivation rate of 52.84%,prevention rate of 50.38%and IHNV inhibition of 84.41%at mushroom extract concentration of 100 μg/mL.It is inferred that Lentinan extracts has the prominent anti-IHNV activity,and its antiviral mechanism might be primarily involved in the inhibition of intracellular IHNV biosynthesis.

Lentinan extracts;anti-IHNV;antiviral mechanism

S943

A

1005-3832（2017）05-0013-05

2017-04-18

中央級公益性科研院所基本科研業(yè)務費專項資金項目（HSY201514，2016HY-ZD0504）.

任廣明（1984-），女，博士研究生，從事水產(chǎn)養(yǎng)殖方向研究.E-mail:gmr25@126.com

盧彤巖，研究員，從事水產(chǎn)病害研究.E-mail:lutongyan@hotmail.com