5株非釀酒酵母的耐受性及發(fā)酵特性研究

劉燦珍，董書甲，姜凱凱，趙新節(jié)，孫玉霞*

（1.齊魯工業(yè)大學 生物工程學院 山東省微生物工程重點實驗室，山東 濟南 250353；2.山東省農業(yè)科學院 農產品研究所，山東 濟南 250100）

5株非釀酒酵母的耐受性及發(fā)酵特性研究

劉燦珍1，董書甲1，姜凱凱1，趙新節(jié)1，孫玉霞2*

（1.齊魯工業(yè)大學 生物工程學院 山東省微生物工程重點實驗室，山東 濟南 250353；2.山東省農業(yè)科學院 農產品研究所，山東 濟南 250100）

以陸生伊薩酵母（Issatchenkia terricola）、淺白隱球酵母（Cryptococcus albidus）、葡萄汁有孢漢遜酵母（Hanseniaspora uvarum）、美極梅奇酵母（Metschnikowia pulcherrima）、戴爾有孢圓酵母（Torulaspora delbruecki）為試材，分析了5株非釀酒酵母的生長特性、耐受性和碳源氮源同化能力及發(fā)酵速率。結果表明，戴爾有孢圓酵母的生長量較大，耐受的葡萄糖質量濃度為500 g/L、酒精體積分數為18%、SO2質量分數為420 mg/L，可同化氮源3種、碳源11種；陸生伊薩酵母的生長量較小，耐受的葡萄糖質量濃度為350 g/L、酒精體積分數為6%、SO2質量分數為120 mg/L，可同化氮源4種、碳源10種；其余3株非釀酒酵母的耐受及發(fā)酵特性優(yōu)于陸生伊薩酵母低于戴爾有孢圓酵母；陸生伊薩酵母發(fā)酵速率在第2天達到最大值，其余4株酵母均在第3天達到發(fā)酵高峰。

非釀酒酵母；耐受性；碳源、氮源同化；發(fā)酵速率

葡萄酒的釀造過程中，釀酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）對葡萄酒質量的影響極為重要，能將約4%的糖轉化為其他副產物，包括醇類、酯類、有機酸類物質等[1]。酒精發(fā)酵過程中接種的酵母種類顯著影響大部分揮發(fā)性產物的濃度[2]，不同的釀酒酵母發(fā)酵同種葡萄汁產生的揮發(fā)性產物不同[3]，而非釀酒酵母菌種如葡萄汁有孢漢遜酵母（Hanseniaspora uvarum）、星形假絲酵母（Candida stellata）、美極梅奇酵母（Metschnikowiapulcherrima）、檸檬型克勒克酵母（Kloeckera apiculata）、戴爾有孢圓酵母（Torulaspora delbrueckii）、耐熱克魯維酵母（Kluyveromyces thermotolerans）對葡萄酒的質量也有影響[4]，能分泌對葡萄酒結構、質量影響較大的多種胞外酶，如漢遜酵母（Hanseniasp.）和美極梅奇酵母（M.pulcherrima）分泌β-葡糖苷酶、檸檬型克勒克酵母（K.apiculata）分泌果膠酶[5]。戴爾有孢圓酵母是一種非釀酒酵母，AZZOLINI M等[6]研究發(fā)現，該酵母與釀酒酵母順序發(fā)酵或共發(fā)酵，對果酒的感官特性均有積極影響。同時，CHEN D等[7]研究發(fā)現戴爾有孢圓酵母有較高的生長速率和糖消耗速率。SADINENI V等[8]研究發(fā)現，非釀酒酵母與釀酒酵母混合發(fā)酵比釀酒酵母單純發(fā)酵葡萄酒有更濃郁的果香氣味，而與美極梅奇酵母共發(fā)酵比與戴爾有孢圓酵母共發(fā)酵的葡萄酒感官評價更高。PARAPOULIM等[9]研究發(fā)現，美奇酵母屬酵母與商業(yè)酵母共發(fā)酵時生成的酯類物質含量高、高級醇含量低。但是釀造環(huán)境的變化（如發(fā)酵前期糖濃度較高、SO2的添加和發(fā)酵中酒精度的增加等）對非釀酒酵母的種類和數量影響較大。

本實驗以5株非釀酒酵母葡萄汁有孢漢遜酵母（H.uvarum）、淺白隱球酵母（C.albidus）、陸生伊薩酵母（I.terricola）、美極梅奇酵母（M.pulcherrima）、戴爾有孢圓酵母（T.delbruecki）為研究對象，測定它們的生長曲線，糖、酒精、SO2的耐受性，及碳源、氮源的同化能力和發(fā)酵速率，以期為其深入研究和合理利用奠定基礎。鑒定及研究非釀酒酵母的發(fā)酵特性，篩選性能良好的非釀酒酵母菌株并應用于葡萄酒生產具有重要意義。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

葡萄汁有孢漢遜酵母（Hanseniaspora uvarum）：篩選自河北昌黎產區(qū)赤霞珠葡萄；陸生伊薩酵母（Issatchenkia Terricola）：篩選自云南彌勒產區(qū)玫瑰蜜葡萄；戴爾有孢圓酵母（Torulaspora delbrueckii）：篩選自云南德欽產區(qū)赤霞珠葡萄；美極梅奇酵母（Metschnikowia pulcherrima）和淺白隱球酵母（Cryptococcus albidus）：篩選自新疆天山北麓產區(qū)赤霞珠葡萄；已通過26S r DNAD1D2區(qū)域序列分析及鑒定。

酵母浸出粉胨葡萄糖（yeast extract peptone dextrose，YEPD）液體培養(yǎng)基、酵母浸出粉胨葡萄糖（YEPD）固體培養(yǎng)基、氮源和碳源基礎培養(yǎng)基參照文獻[10]的配制方法。

葡萄糖、酵母浸粉、蛋白胨、瓊脂：北京奧博星生物技術有限責任公司；組氨酸、蛋氨酸、色氨酸、L-賴氨酸（均為分析純）：上海藍季生物科技有限公司；生物素、泛酸鈣、葉酸、肌糖、煙酸、對氨基苯甲酸、鹽酸吡哆醇、硫胺素、核黃素、硼酸、CuSO4、KI、MnSO4、ZnSO4、KH2PO4、K2HPO4、MgSO4、NaCl、CaCl2（均為分析純）：國藥集團化學試劑有限公司；半乳糖、D-木糖、蔗糖、乳糖、麥芽糖、纖維二糖、海藻糖、棉子糖、可溶性淀粉、赤蘚糖醇、核糖醇、D-甘露糖醇、肌醇、琥珀酸、檸檬酸（均為分析純）：索萊寶生物科技有限公司；亞硫酸（分析純）：天津市科密歐化學試劑有限公司。

1.2 儀器與設備

AMR-1000酶標儀：杭州奧盛儀器有限公司；SW-CJ-2D型超凈工作臺：上海樹立有限公司；ZQPW-70全溫振蕩培養(yǎng)箱、SPL-250生化培養(yǎng)箱：天津市萊玻特瑞儀器設備有限公司；QL-901漩渦混合器：海門市其林貝爾儀器制造有限公司；Nikon E100光學生物顯微鏡：上海澤仕光電科技有限公司、XB.K.25血球計數板：上海安信光學儀器制造有限公司。

1.3 方法

1.3.1 種子液培養(yǎng)

將保存菌種劃線于YEPD固體培養(yǎng)基，28℃培養(yǎng)24h。挑取單菌落接種新鮮YEPD液體培養(yǎng)基，28℃、150 r/min搖床培養(yǎng)24 h[10]。

1.3.2 生長曲線的繪制

將上述種子液以1.0×106個/mL接種新鮮YEPD液體培養(yǎng)基，28℃培養(yǎng)36 h，每隔2 h混勻取樣200 μL于96孔板中，以未接種的YEPD液體培養(yǎng)基為對照，測定OD600nm值，每株菌均重復3次。以時間（h）和OD600nm值繪制生長曲線。

1.3.3 菌株耐受性實驗

糖耐受性：將對數生長期的菌株分別以1.0×106個/mL接種于含有100g/L、150g/L、200g/L、250g/L、300g/L、350g/L、400 g/L、450 g/L、500 g/L葡萄糖質量濃度的YEPD液體培養(yǎng)基中，28℃靜置培養(yǎng)24 h，酶標儀測定OD600nm值，每株菌均重復3次，繪制5株非釀酒酵母的葡萄糖耐受性曲線。

酒精耐受性：將對數生長期的菌株分別以1.0×106個/mL接種于含有體積分數分別為3%、6%、9%、12%、15%、18%酒精的YEPD液體培養(yǎng)基中，28℃靜置培養(yǎng)24 h，酶標儀測定OD600nm值，每株菌均重復3次，繪制5株非釀酒酵母的酒精耐受性曲線。

SO2耐受性：將對數生長期的菌株分別以1.0×106個/mL接種于含有60mg/L、120mg/L、180mg/L、240mg/L、300mg/L、360mg/L、420mg/LSO2（SO2以H2SO3形式添加）質量濃度的YEPD液體培養(yǎng)基中，28℃靜置培養(yǎng)24h，酶標儀測定OD600nm值，每株菌均重復3次[11]，繪制5株非釀酒酵母的SO2耐受性曲線。

1.3.4 同化能力實驗

同化氮源實驗：將對數生長期的菌株分別以1.0×106個/mL接種含有硫酸銨、天冬門素、硝酸鉀、亞硝酸鈉、L-賴氨酸的氮源底物濃度為2～5mmol/L的碳源基礎培養(yǎng)基中。另外硝酸鉀加入量為0.078%，并調節(jié)pH值為6.5。25℃培養(yǎng)7 d，每株菌均重復3次，以不加氮源的碳源基礎培養(yǎng)基作對照。

同化碳源實驗：將對數生長期的菌株分別以1.0×106個/mL接種含有半乳糖、D-木糖、蔗糖、乳糖、麥芽糖、纖維二糖、海藻糖、棉子糖、可溶性淀粉、赤蘚糖醇、核糖醇、D-甘露糖醇、肌醇、琥珀酸、檸檬酸的碳源底物濃度為50 mmol/L的氮源基礎培養(yǎng)基中，25℃培養(yǎng)21 d，每株菌均重復3次，以不加氮源的基礎碳源培養(yǎng)基作對照[10]。

結果觀察：在漩渦振蕩器上混勻后，通過畫有3/4 mm寬黑線的白色紙張，對光觀察，若完全看不到黑線記為“+++”，看到模糊的黑線記為“++”，看到臨界黑線記為“+”，完全看到黑線記為“-”。

1.3.5 發(fā)酵速率測定

將對數生長期的菌株分別以1.0×106個/mL接種YEPD液體培養(yǎng)基，25℃，靜置培養(yǎng)，每天稱質量并計算凈質量，即為CO2的失質量，凈質量穩(wěn)定時停止稱質量。以時間（d）和CO2失質量（g/d）繪制發(fā)酵速率曲線[12]。

2 結果與分析

2.1 非釀酒酵母的生長曲線

5株非釀酒酵母的生長情況結果見圖1。由圖1可知，除陸生伊薩酵母經歷8 h的延滯期進入對數生長期外，其余4株非釀酒酵母均經歷約6 h的延滯期后，進入對數生長期，且穩(wěn)定期持續(xù)時間不同。其中葡萄汁有孢漢遜酵母與戴爾有孢圓酵母對數生長期持續(xù)時間較短，在14 h左右進入穩(wěn)定期，前者穩(wěn)定期持續(xù)時間最長約15 h，均在28 h進入衰亡期。淺白隱球酵母與美極梅奇酵母在對數生長期的長勢基本一致，進入穩(wěn)定期的時間較晚約17 h左右，其中前者穩(wěn)定期持續(xù)時間較長約13 h。陸生伊薩酵母進入穩(wěn)定期時間最晚約22 h左右，且持續(xù)時間也最短，經歷穩(wěn)定期后很快進入衰亡期。

圖1 非釀酒酵母在YEPD液體培養(yǎng)基中的生長曲線Fig.1 Growth curves of non-Saccharomycesstrains in YEPD liquid medium

2.2 非釀酒酵母菌株的耐受性

2.2.1 非釀酒酵母葡萄糖耐受性

5株實驗菌株的糖耐受性情況結果見圖2。由圖2可知，陸生伊薩酵母生長量最低，且在葡萄糖質量濃度為350 g/L時菌體完全不生長。其他4株非釀酒酵母的生長量隨糖質量濃度的增加有波動，但OD600nm值較高均＞0.3，在葡萄糖質量濃度為400 g/L時生長情況較好，在500 g/L時不生長。石明楊等[13-14]對篩選的戴爾有孢圓酵母進行實驗時發(fā)現，該菌能耐受300 g/L的糖范圍，在糖質量濃度為500 g/L時生長完全受到抑制；與本研究結果一致[10-12]。

2.2.2 非釀酒酵母酒精耐受性

5株實驗菌株的酒精耐受性結果見圖3。由圖3可知，菌株生長量隨酒精體積分數增加而呈現下降的趨勢。陸生伊薩酵母在酒精體積分數為6%時生長量為0，生長完全受到抑制；淺白隱球酵母與葡萄汁有孢漢遜酵母在在酒精體積分數為6%時的生長量驟然下降，在酒精體積分數為18%時生長完全受到抑制；戴爾有孢圓酵母隨酒精體積分數的增加，生長量呈下降趨勢，在酒精體積分數為18%時生長完全受到抑制，耐受性能較好。其中陸生伊薩酵母的酒精耐受度與王汝瑱[15]篩選出的陸生伊薩酵母BS-12能耐受酒精度＜10%vol的研究結果存在相似性。

2.2.3 非釀酒酵母SO2耐受性

圖4 非釀酒酵母對SO2的耐受性Fig.4 Tolerance of non-Saccharomycesstrains to SO2

5株實驗菌株的SO2耐受性結果見圖4。由圖4可知，除陸生伊薩酵母外，其他4株非釀酒酵母對SO2的耐受趨勢基本一致，隨著SO2質量濃度的增加菌株生長量呈現的趨勢為先增長后下降，在低于350 mg/L的范圍內生長很好，趙靜靜[16]研究發(fā)現，葡萄汁有孢漢遜酵母最高耐受SO2的質量分數為100 mg/L，這與本研究存在差異。陸生伊薩酵母最高耐受的SO2質量分數為120mg/L，美極梅奇酵母能耐受SO2質量濃度為420 mg/L。

2.3 非釀酒酵母對氮源和碳源的同化特性

2.3.1 氮源同化特性

表1 5株非釀酒酵母對氮源同化現象Table 1 Assimilation of nitrogen sources of 5 non-Saccharomyces strains

由表1可知，天冬氨酸、硫酸銨、L-賴氨酸是所有菌株均能利用的氮源，亞硝酸鈉是所有菌株均不能利用的氮源，只有陸生伊薩酵母能利用硝酸鉀?？赡艿脑蚴牵簛喯跛猁}在pH＜6時形成亞硝酸，對酵母細胞產生毒性，而使酵母不能利用亞硝酸鹽。由此可知，陸生伊薩酵母的氮源同化能力最強，能夠利用4種不同氮源，葡萄汁有孢漢遜酵母的氮源同化能力次之，可完全利用硫酸銨、天冬氨酸、L-賴氨酸3種不同氮源。淺白隱球酵母與戴爾有孢圓酵母的氮源同化能力一致，均能完全利用2種氮源。美極梅奇酵母的氮源同化能力稍差，能同化3種氮源，但只能完全利用天冬氨酸1種氮源。

2.3.2 碳源同化特性

表2 5株非釀酒酵母對碳源同化現象Table 2 Assimilation of carbon sources of 5 non-Saccharomyceststrains

由表2可知，5株非釀酒酵母除乳糖、可溶性淀粉、肌醇、檸檬酸外4種碳源外，均能同化其余11種碳源。由此可看出非釀酒酵母不能利用多糖，這是由于微生物優(yōu)先利用簡單的營養(yǎng)物質，因此多糖是最難利用的碳源。而糖類、醇類、酸類共存的情況下，酵母優(yōu)先利用消耗能量最少的物質，這可能是酵母不能利用肌醇及檸檬酸的原因。其中從纖維二糖、核糖醇2種碳源的利用情況來看，出現了陸生伊薩酵母、淺白隱球酵母、葡萄有孢漢遜酵母3株菌株初期不能利用的碳源，而后期卻能利用的現象以及對D-木糖、海藻糖、棉子糖、赤蘚糖醇、D-甘露糖醇、琥珀酸同化能力逐漸增強的現象。這2種現象的原因可能是由于幾株非釀酒酵母對上述8種碳源的適應性不同，而導致最終的同化能力有差異。美極梅奇酵母與戴爾有孢圓酵母對不同碳源的同化力最強，基本能完全同化11種碳源；陸生伊薩酵母的碳源同化能力最差，僅能完全同化蔗糖、海藻糖2種碳源；其余2株非釀酒酵母同化能力次之，分別完全同化4種、6種碳源。

2.4 非釀酒酵母的發(fā)酵速率

發(fā)酵速率曲線反應了菌株對培養(yǎng)基的適應性及發(fā)酵強度的動態(tài)變化，5株非釀酒酵母的發(fā)酵速率曲線見圖5。由圖5可知，陸生伊薩酵母在發(fā)酵第2天發(fā)酵速率達到最大，隨后開始下降，在第5天后呈下降趨勢并緩慢達到穩(wěn)定狀態(tài)，但CO2的失質量最小，發(fā)酵力最小。可能是由于該菌株穩(wěn)定期持續(xù)時間較短直接進入衰亡期所致。其余4株實驗菌株均在發(fā)酵第3天達到最大發(fā)酵速率，但CO2的失質量不同，葡萄有孢漢遜酵母與戴爾有孢圓酵母的CO2失質量最大達到0.13 g/d，發(fā)酵能力較強，這表明對模擬培養(yǎng)基的適應能力強，發(fā)酵強度大；其余2株非釀酒酵母發(fā)酵能力次之。

圖5 非釀酒酵母發(fā)酵速率曲線Fig.5 Ferment ation rate curves of 5 non-Saccharomycesstrains

3 結論

對5株非釀酒酵母的生長特性、耐受性、同化特性、發(fā)酵速率的實驗結果表明：在生長特性方面，葡萄汁有孢漢遜酵母、戴爾有孢酵母的延滯期最短而穩(wěn)定期維持時間最長，菌體量也始終保持在較高水平，生長能力最好；美極梅奇酵母、淺白隱球酵母較前2種非釀酒酵母的延滯期長，但菌量水平、穩(wěn)定期維持時間均較好；而陸生伊薩酵母的在五株非釀酒酵母菌中延滯期最長而穩(wěn)定期時間最短，因此其生長能力最弱。在耐受性方面，戴爾有孢圓酵母酵母在不同濃度的糖、酒精、SO2耐受性均較強；陸生伊薩酵母與美極梅奇酵母的耐受性較差，其余2株非釀酒酵母的耐受性次之；在同化碳源氮源的能力方面，陸生伊薩酵母的氮源同化能力最強，其余4種非釀酒酵母的同化能力基本一致；美極梅奇酵母與戴爾有孢圓酵母的碳源同化能力較好；陸生伊薩酵母的碳源同化能力最差。在發(fā)酵速率方面，葡萄汁有孢漢遜酵母與戴爾有孢圓酵母發(fā)酵強度較好；陸生伊薩酵母的發(fā)酵強度最差；其余2株非釀酒酵母的發(fā)酵強度次之。

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Tolerance and fermentation characteristics of 5 non-Saccharomyces

LIU Canzhen1,DONG Shujia1,JIANG Kaikai1,ZHAO Xinjie1,SUN Yuxia2*
(1.Shandong Province Key Laboratory of Microbial Engineering,College of Biotechnology,Qilu University of Technology,Jinan 250353,China;2.Institute of Agricultural Products,Shandong Academy of Agricultural Sciences,Jinan 250100,China)

Using theIssatchenkia terricola,Cryptococcus albidus,Hanseniaspora uvarum,Metschnikowia pulcherrimaandTorulaspora delbrueckias experimental materials,the growth characteristics,tolerance,carbon source assimilation capacity and fermentation rate of 5 non-Saccharomyceswere analyzed.The results showed that the growth ofT.delbrueckiwas the largest,and was able to tolerate 500 g/L glucose,18%alcohol,420 mg/L SO2and could assimilate 3 kinds of nitrogen sources and 11 kinds of carbon sources.The growth ofI.terricolawas able to tolerate 350 g/L glucose,6%alcohol,120 mg/L SO2,and could assimilate 4 kinds of nitrogen sources and 10 kinds of carbon sources.The tolerance and fermentation characteristics of other 3 strains of non-Saccharomyceswere higher than that ofI.terricoland lower than that ofT.delbruecki.The fermentation rate ofI.terricol reached the maximum in the second day,and the other 4 strains reached the peak of fermentation on the third day.

non-Saccharomyces;tolerance;carbon and nitrogen source assimilation;fermentation rate

TS261.1

0254-5071（2017）10-0042-05

10.11882/j.issn.0254-5071.2017.10.010

2017-08-03

山東省現代農業(yè)產業(yè)技術體系果品創(chuàng)新團隊（SDAIT-06-14）；山東省重點研發(fā)計劃項目（2015GNC113010）；泰山學者工程專項；山東省微生物工程重點實驗室開放課題資助項目

劉燦珍（1991-），女，碩士研究生，研究方向為菌種選育及代謝調控。

*通訊作者：孫玉霞（1973-），女，副研究員，碩士，研究方向為釀酒技術和酒類風味物質。