蛋白酶菌株的篩選與鑒定

馮愛娟，葉茂，陳萍柔，鄧毛程*

(1.廣東輕工職業(yè)技術學院 食品與生物技術學院, 廣州 510300；2.廣東高校特色調(diào)味品工程技術開發(fā)中心, 廣州 510300)

蛋白酶菌株的篩選與鑒定

馮愛娟1，2，葉茂1，2，陳萍柔1，鄧毛程1，2*

(1.廣東輕工職業(yè)技術學院 食品與生物技術學院, 廣州 510300；2.廣東高校特色調(diào)味品工程技術開發(fā)中心, 廣州 510300)

從腐乳中篩選出來的菌株中，篩出幾株能產(chǎn)蛋白酶的菌株，再通過蛋白酶發(fā)酵實驗和活性測試相結合的方法，篩出了1株能高產(chǎn)蛋白酶的菌株，命名為R4菌株。常規(guī)微生物的方法鑒定目的菌株R4,PCR擴增其16S rDNA基因并進行系統(tǒng)發(fā)育分析，經(jīng)形態(tài)學和生理特性初步鑒定其為消瘦芽孢桿菌；檢測該菌株的培養(yǎng)溫度、接種量、接種時間等因素，發(fā)現(xiàn)該菌株發(fā)酵產(chǎn)酶因素的主次條件是培養(yǎng)溫度、接種量、培養(yǎng)時間；在37 ℃，pH為7.0的條件下培養(yǎng)36 h，該菌產(chǎn)量最高。

腐乳；蛋白酶；篩選；高產(chǎn)菌；鑒定

蛋白酶屬于水解酶類。在我國，調(diào)查顯示，蛋白酶是最重要的三大工業(yè)用酶之一 ，其應用已經(jīng)深入到釀造、日用化學、醫(yī)藥、食品、洗滌劑、飼料等多個行業(yè)，在國民經(jīng)濟的發(fā)展中扮演著很重要的角色。目前，產(chǎn)生蛋白酶的微生物種類繁多，如細菌、病毒等，但用于工業(yè)生產(chǎn)中，一般要求產(chǎn)酶量高，發(fā)酵周期短，產(chǎn)酶無毒無害等等。查資料知，食品生產(chǎn)用蛋白酶分為植物、動物及微生物蛋白酶，因為微生物具有資源廣泛、生長快、易于繁殖、培養(yǎng)和分離純化方法簡單等優(yōu)點，最終決定采用發(fā)酵工程技術生產(chǎn)蛋白酶，原料易得，不受環(huán)境和季節(jié)等方面的限制，很適用于蛋白酶的生產(chǎn)與培養(yǎng)。

本試驗以從腐乳中分離出的幾株產(chǎn)蛋白酶的細菌菌株作為研究對象，對能高產(chǎn)蛋白酶的菌株進行篩選，并對部分酪蛋白水解圈較大的菌株進行了發(fā)酵液酶活測定和分子鑒定與系統(tǒng)發(fā)育分析，以期獲得高產(chǎn)蛋白酶的細菌菌株及其適宜的產(chǎn)酶條件。

1 材料與方法

1.1 材料

從腐乳中培養(yǎng)篩選出產(chǎn)蛋白酶的幾株菌株，進而對這幾株菌株進行篩選，選出高產(chǎn)蛋白酶的菌株。

1.2 培養(yǎng)基

1.2.1 富集培養(yǎng)基(g/L)

葡萄糖7，酵母膏2，干酪素10，磷酸二氫鉀1.5，七水硫酸鎂0.3，pH 7.0，滅菌20 min。

1.2.2 平板分離培養(yǎng)基(g/L)

葡萄糖6，蛋白胨2，干酪素10，磷酸二氫鉀1.5，七水硫酸鎂0.3，pH 7.0，滅菌20 min。

1.2.3 保藏培養(yǎng)基(g/L)

葡萄糖2，蛋白胨4，牛肉膏2，酪蛋白1，瓊脂15，pH 7.0，滅菌20 min。

1.2.4 種子培養(yǎng)基(g/600 mL)

葡萄糖10，蛋白胨6，酵母膏3，磷酸二氫鉀1.5，七水硫酸鎂0.3，pH 7.0，滅菌20 min。

1.2.5 發(fā)酵培養(yǎng)基及發(fā)酵試驗(g/1600 mL)

葡萄糖15，可溶性淀粉30，蛋白胨15，磷酸二氫鉀3.2，七水硫酸鎂0.8，pH 7.0，滅菌20 min。

1.3 儀器與設備

手提式高壓滅菌鍋 合肥華泰醫(yī)療設備有限公司；電熱恒溫培養(yǎng)箱 上海精宏實驗設備有限公司；pH計 上海三倍儀表廠；恒溫鼓風干燥箱 上海博迅實業(yè)有限公司；恒溫培養(yǎng)搖床 上海福馬實驗設備有限公司。

1.4 試驗方法

1.4.1 篩選路線

樣品采集→樣品處理→初篩(平板分離)→復篩(搖床發(fā)酵產(chǎn)酶)→酶活力測定→高產(chǎn)菌株的鑒定凍干包藏。

1.4.2 樣品處理

先稱5 g腐乳經(jīng)過一定處理，用經(jīng)過高溫滅菌的無菌水浸泡腐乳，常溫過夜，離心浸取液，用移液管吸取上清液，40 ℃下水浴10 min,將上清液進行適當梯度稀釋，接種在富集平板培養(yǎng)液上，35 ℃下培養(yǎng)24 h，放入搖床中140 r/min培養(yǎng)。

1.4.3 初篩(平板分離)

培養(yǎng)液進行10-1～10-n分別稀釋，在無菌室的超凈臺上，分別將菌種用涂布棒涂布或用接種環(huán)劃線于上述2種分離培養(yǎng)基平板上，放置38 ℃培養(yǎng)，挑取菌種透明圈顏色、形態(tài)各不相同的較大單個菌落，分別將所挑選的菌落在無菌室里劃線分離純化；若平板上的菌株長得過多過密，則需在平板培養(yǎng)基上繼續(xù)挑選生長較好的菌落，繼續(xù)平板分離，再接著劃線分離，反復進行這樣的篩選分離，純化，直到得到更純的菌株,并進行斜面保藏。斜面保藏：先在38 ℃的培養(yǎng)箱里培養(yǎng)48 h，再放進冰箱里保藏菌種，防止其過快老化，以保證測酶活率的準確性。最后取出分離平板，選擇生長良好、有明顯水解圈的單菌落。

1.4.4 復篩(搖床發(fā)酵產(chǎn)酶)

配制發(fā)酵培養(yǎng)基，121 ℃熱壓滅菌20 min。分別裝入250 mL的三角瓶中，裝量為120 mL。接入由初篩得到的有稍大水解圈的菌株，37 ℃，140 r/min旋轉搖床培養(yǎng)48 h。發(fā)酵液經(jīng)12000 r/min離心10 min，得到上清液。用0.5 cm直徑打孔器在早已滅菌的酪蛋白平板上均勻打孔，取上清液 80 μL加入孔中，在38 ℃恒溫培養(yǎng)24 h，根據(jù)水解圈和菌落直徑的比值(R/r)，篩選出能產(chǎn)生較大水解圈的菌株。

篩選出的菌株接入發(fā)酵培養(yǎng)基,140 r/min,20 ℃振蕩培養(yǎng)36 h。再將發(fā)酵培養(yǎng)液以質(zhì)量分數(shù)2%接種于發(fā)酵培養(yǎng)基,28 ℃,140 r/min振蕩培養(yǎng)48 h進行酶活力測定。

1.4.5 酶活力測定

采用Folin-酚顯色法測定堿性蛋白酶酶活，一定條件下每1 min水解酪蛋白產(chǎn)生1 μg酪氨酸定義為1個酶活力單位(u/mL)。

1.4.6 高產(chǎn)蛋白酶菌株的鑒定

用肉眼觀察平板上單個菌落的顏色的差異、大小的不同、形狀的區(qū)別等特征，用筆記本記錄下來；再根據(jù)革蘭氏染色法，用顯微鏡觀察菌株的形態(tài)，按照文獻[1]對菌株進行初步鑒定。按照文獻[2-4]進行菌株生理生化鑒定，通過孫玉梅等[5]的方法擴增菌株的 16S rDNA，擴增成功的 PCR產(chǎn)物[6]，將所測定的菌株的16S rDNA序列同Gen-Bank數(shù)據(jù)庫進行相似性比較分析，選取與實驗菌株親緣關系較近者用BioEdit軟件的多序列比對排列(clustalw multiple alignment)，系統(tǒng)發(fā)育分析采用Mega3軟件的鄰接法(neighbor-joining method)進行。

2 結果與分析

2.1 初篩

試驗以是否能水解酪蛋白來判定是否為產(chǎn)蛋白酶菌株，試驗共篩選出4個菌株，其中菌株4水解圈較大，直徑比在2.0以上的為2株。

初篩所得菌株的直徑比見表1。

表1 初篩所得菌株的直徑比

初篩的菌株的分離與斜面保藏，見圖1。

圖1 初篩菌株的分離與斜面保藏

2.2 復篩

表2 復篩所得產(chǎn)蛋白酶菌株的直徑比

由表2可知，R4的直徑比最大。

2.3 酶活的測定

先自行配制好福林-酚試劑、560 μg/mL酪氨酸溶液、0.4 mol/L三氯乙酸溶液、0.4 mol/L碳酸鈉溶液、20 g/L酪蛋白溶液。

表3 L-酪氨酸標準溶液

按表3，取6支試管，分別吸取各溶液放入試管中，置于40 ℃的水浴中20 min。然后于660 nm下測定吸光度。以酪氨酸濃度為橫坐標，以吸光度為縱坐標，繪制標準曲線，建立回歸線方程。

由表3中的數(shù)據(jù)可得回歸線性方程，見圖2。

圖2 酪氨酸的標準曲線

菌株酶活(U/mL)R167．8R217．2R324．3R497．1

采用福林-酚法對所得菌株進行酶活測定，其中R4酶活最高。

2.4 菌種的鑒定

形態(tài)觀察：涂布平板經(jīng)24 h培養(yǎng)后，觀察培養(yǎng)基上生長的 R4菌株，菌落表面圓滑，規(guī)則圓形，中央隆起，邊緣整齊，不透明，呈乳白色。經(jīng)革蘭氏染色，菌體呈紫紅，為陽性菌。在顯微鏡下，單個細胞呈短桿狀，不規(guī)則排列。菌體中少數(shù)有芽孢，多數(shù)成對生長。

2.5 菌株R4的16S rDNA基因序列測定

將R4菌株的16S rDNA序列提交到GenBank數(shù)據(jù)庫并構建菌株的系統(tǒng)發(fā)育樹，可以初步鑒定R4菌株屬于Bacillusmarcorestinctum(消瘦芽孢桿菌)，擴增的16S rDNA與Bacillusmarcorestinctum序列相似性達到99.9%，序列同源性為99%，所以初步確定該菌株為Bacillusmarcorestinctum。

R4菌株全長1443 bp，其序列如下：

圖3 R4菌株的16S rDNA序列

圖4 基于16S rDNA建立的系統(tǒng)發(fā)育樹

一般認為，16S rDNA序列同源性小于97%的屬于不同的種，同源性小于93%的屬于不同的屬[7]。通過16S rDNA序列的比較分析發(fā)現(xiàn)，本研究分離的菌株R4與Bacillusmarcorestinctum(消瘦芽孢桿菌) 的序列相似度最高，二者在系統(tǒng)發(fā)育樹上亦處于同一分支；結合該菌的培養(yǎng)特征、形態(tài)特征及生理生化特征可以初步鑒定R4菌株屬于Bacillusmarcorestinctum。

3 結語

本試驗以酪蛋白為篩選的條件，進行了平板法初篩、復篩以及蛋白酶活力的測定，再經(jīng)過一一反復的篩選后，選出了幾種具有產(chǎn)蛋白酶能力且形成孢子的菌株，為進一步在腐乳等大豆類豆制品中的實際應用提供一些基礎。通過測定發(fā)酵后蛋白酶活力、革蘭氏染色鑒定與16S rDNA基因序列測定等方法，得到了相對其他菌種較優(yōu)的1株菌株R4菌株。通過對其進行形態(tài)學觀察及進一步鑒定，R4菌株屬于消瘦芽孢桿菌屬。我們在實驗過程中還存在許多急需解決的問題， 還需要在后續(xù)的試驗中進一步研究。只有經(jīng)過科學的全方面、深層次研究，才能解決高產(chǎn)菌株的篩選問題以及實際使用中用量的問題，才能實現(xiàn)傳統(tǒng)大豆發(fā)酵食品的現(xiàn)代化工業(yè)生產(chǎn)， 才能進一步提高豆類產(chǎn)品的營養(yǎng)功能和加工特性，提高大豆蛋白產(chǎn)品的利用價值與附加值，造福社會。

[1]李進，郭峰.特用玉米營養(yǎng)價值及綜合加工利用[J].新疆農(nóng)業(yè)科學,1999(4):162-165.

[2]張國民,張玉華,宋立泉,等.淺談大米中的蛋白質(zhì)對營養(yǎng)價值及食味品質(zhì)的影響[J].黑龍江農(nóng)業(yè)科學,2001(3):38-39.

[3]李素麗,李志剛,馬光庭,等.大豆黃漿水醋酸菌種選育及其發(fā)酵實驗初探[J].大眾科技,2009(7):109-110.

[4]佟獻俊,孫洋,錢方.大豆黃漿水中乳清蛋白和低聚糖制備研究進展[J].中國釀造，2009(12):3-5.

[5]孫玉梅，崔迎進，曹芳,等.豆腐黃漿水中補加乙醇和葡萄糖發(fā)酵蝦青素的研究[J].中國釀造,2007(1):24-27.

[6]徐國英,林學政,王能飛,等.產(chǎn)低溫蛋白酶極地菌株的篩選及Pseudoalteromonassp.QI-1產(chǎn)蛋白酶粗酶性質(zhì)[J].生物加工過程,2010,8(2):55-60.

[7]王全富,繆錦來,李光友,等.南極微生物產(chǎn)低溫蛋白酶菌株的篩選、分子鑒定及部分酶活特性[J].中國水產(chǎn)科學,2005,12(4):437-440.

ScreeningandIdentificationofProteaseStrain

FENG Ai-juan1，2, YE Mao1，2, CHEN Ping-rou1, DENG Mao-cheng1，2*

(1.School of Food and Biological Engineering, Guangdong Industry Technical College, Guangzhou 510300, China；2.Center of Guangdong Higher Education for Engineering and Technological Development of Specialty Condiments, Guangzhou 510300, China)

Select strains from the beancurd produced strains, which are capable of producing proteases,and then through the combination of protease fermentation experiment and activity test, screen out a high-yield protease strain named R4 strain. The method of conventional microorganism is used to identify the target strain R4, and PCR amplifies its 16S rDNA gene and conducts phylogenetic analysis, the morphological and physiological characteristics of the bacteria are preliminarily identified asBacillusmarcorestinctum. After testing the incubation temperature, inoculum quantity, incubation time and other factors of strain R, it is found that the enzyme production factors of strain R under primary and secondary fermentation conditions are incubation temperature, inoculum quantity, incubation time.Under the conditions of temperature of 37 ℃, pH of 7.0, cultivation for 36 h, the bacteria have the highest yield.

fermented bean curd;protease;screening;high-yield bacteria;identification

TS201.25

A

10.3969/j.issn.1000-9973.2017.11.010

1000-9973(2017)11-0049-04

2017-06-13 *通訊作者

廣東高校特色調(diào)味品工程技術開發(fā)中心建設項目(GCZX-B1103)；國家青年科學基金項目(31500102)；“創(chuàng)新強效工程”之自主創(chuàng)新能力提升項目(1A10205)；廣東輕工職業(yè)技術學院校級項目(KJ201509)

馮愛娟(1976-)，女，副教授，博士，研究方向：微生物發(fā)酵。