木犀草素和槲皮素體外抗炎作用研究

周霄楠，韓 超，宋鵬琰，趙興華,2* 鐘秀會,2

(1.河北農(nóng)業(yè)大學(xué)動物醫(yī)學(xué)院, 河北保定 071001；2.河北農(nóng)業(yè)大學(xué)中獸醫(yī)研究所, 河北保定 071001)

木犀草素和槲皮素體外抗炎作用研究

周霄楠1，韓 超1，宋鵬琰1，趙興華1,2*鐘秀會1,2

(1.河北農(nóng)業(yè)大學(xué)動物醫(yī)學(xué)院, 河北保定 071001；2.河北農(nóng)業(yè)大學(xué)中獸醫(yī)研究所, 河北保定 071001)

旨在觀察木犀草素及槲皮素對脂多糖(LPS)誘導(dǎo)小鼠巨噬細胞瘤細胞系(RAW264.7)分泌NO、TNF-α、IL-1β、IL-6以及IL-10的影響，評價其抗炎效果。試驗采用LPS誘導(dǎo)RAW264.7細胞炎癥模型，選對數(shù)生長期細胞，設(shè)對照組、LPS組、木犀草素5、2.5、1.25 μg/mL組，槲皮素10、5、2.5 μg/mL組。藥物預(yù)處理4 h后致炎24 h，Griess法測定細胞培養(yǎng)上清液中NO的含量，ELISA測定上清液中TNF-α、IL-1β、IL-6以及IL-10的含量。 試驗數(shù)據(jù)表明，木犀草素及槲皮素均可極顯著地抑制LPS誘導(dǎo)RAW264.7細胞后NO、TNF-α、IL-1β以及IL-6含量的升高(P<0.01), 且在一定程度上呈劑量依賴性。結(jié)果表明，木犀草素及槲皮素在體外具有良好的抗炎效果。

木犀草素；槲皮素；抗炎作用；小鼠巨噬細胞瘤細胞系

炎癥反應(yīng)是臨床常見的病理過程，是指動物機體針對促炎因子、致炎因素、外界對機體的刺激發(fā)生的以防御反應(yīng)為主的應(yīng)答反應(yīng)，以局部組織的變質(zhì)、滲出和增生變化為主要表現(xiàn)[1]。中獸醫(yī)所述癰腫、瘡瘍、疔毒等病證與西醫(yī)中的炎癥病理過程類似，可用有清熱解毒、活血化淤等藥效的中藥進行治療[2]。蒲公英(TaraxacummongolicumHand.-Mazz.)為菊科多年生草本蒲公英屬植物的干燥全草，廣泛分布于我國，是藥食兼用的植物，其藥味苦甘、性寒、無毒，入肝、胃經(jīng)，具清熱解毒，消腫散結(jié)，利尿通淋之功效?？捎糜谥委燄郫從[毒，乳癰，瘰疬，目赤，咽痛，肺癰，腸癰，濕熱黃疸，熱淋澀痛[3]。蒲公英中含多種藥用活性成分，前期研究中發(fā)現(xiàn)黃酮類粗提物表現(xiàn)出較強的體內(nèi)外抗炎活性。木犀草素(luteolin)及槲皮素(quercetin)為蒲公英中黃酮類的代表化合物[4]，本文通過脂多糖(lipopolysaccharide,LPS)誘導(dǎo)RAW264.7細胞建立炎癥模型，通過測定木犀草素、槲皮素對細胞因子的影響，觀察體外抗炎效果，并初步闡明其抗炎作用機理，以期為臨床應(yīng)用提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 細胞 RAW264.7小鼠巨噬細胞瘤細胞，中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)研究所細胞資源中心。

1.1.2 藥品、試劑與儀器 木犀草素(批號Z14J6L1)，上海源葉公司產(chǎn)品；槲皮素(批號SLBD8415V)、LPS(批號121M4024V)、MTT，Sigma公司產(chǎn)品；DMEM(高糖)、DMSO，北京索萊寶公司產(chǎn)品；胎牛血清，杭州四季青公司產(chǎn)品。Griess法NO檢測試劑盒，Promega公司產(chǎn)品；TNF-α、IL-1β、IL-6、IL-10非即用型ELISA檢測試劑盒，R&D公司產(chǎn)品；所用其他化學(xué)試劑均為國產(chǎn)分析純。SYNERGY HTX全波長酶標(biāo)儀，BioTek公司產(chǎn)品；Series II Water Jacket二氧化碳培養(yǎng)箱，Thermo公司產(chǎn)品；CKX41光學(xué)顯微鏡，Olympus公司產(chǎn)品。

1.2 方法

1.2.1 木犀草素、槲皮素對RAW264.7細胞的毒性作用 取處于對數(shù)生長期的RAW264.7細胞，接種于96孔培養(yǎng)板，細胞密度約為5×105個/mL，每孔100 μL細胞混懸液，培養(yǎng)液為含100 mL/L胎牛血清的DMEM(高糖)培養(yǎng)液，四周每孔加入200 μL PBS作為保濕孔，37℃、體積分數(shù)為5%的CO2條件下培養(yǎng)12 h待其貼壁且恢復(fù)至靜息狀態(tài)。吸棄全部培養(yǎng)液，后續(xù)使用的培養(yǎng)液均為不含胎牛血清的DMEM(高糖)培養(yǎng)液。針對不同組別加入含不同成分的DMEM(高糖)培養(yǎng)液各100 μL，具體為：對照組，加入DMEM(高糖)培養(yǎng)液；LPS組，在DMEM(高糖)培養(yǎng)液中加入濃度為100 μg/mL的LPS母液，使LPS終濃度為1 μg/mL；木犀草素組，在DMEM(高糖)培養(yǎng)液中加入濃度為100 μg/mL的木犀草素母液或槲皮素母液，0.22 μm過濾，木犀草素組終濃度分別為10、9、8、7、6 μg/mL，槲皮素組終濃度分別為20、15、10、5 μg/mL，每組6個復(fù)孔，繼續(xù)培養(yǎng)24 h。各組均加入20 μL濃度為5 mg/mL的MTT，繼續(xù)培養(yǎng)2 h。終止培養(yǎng)，吸棄全部液體，不要損失貼壁的細胞，各組均加入100 μL DMSO，振蕩10 min，使細胞內(nèi)結(jié)晶充分溶解，酶標(biāo)儀520 nm波長處測定各孔OD值。

1.2.2 木犀草素、槲皮素對RAW264.7細胞分泌細胞因子的影響

1.2.2.1 木犀草素、槲皮素對RAW264.7細胞分泌NO的影響 取處于對數(shù)生長期的 RAW264.7細胞，接種于6孔培養(yǎng)板，細胞密度約為5×105個/mL，每孔2 mL細胞混懸液，培養(yǎng)液為含100 mL/L胎牛血清的DMEM(高糖)培養(yǎng)液，37℃、體積分數(shù)為5%的CO2條件下培養(yǎng)12 h，待其貼壁且恢復(fù)至靜息狀態(tài)。后續(xù)使用的培養(yǎng)液均為不含胎牛血清的DMEM(高糖)培養(yǎng)液。細胞恢復(fù)至靜息狀態(tài)后，吸棄全部培養(yǎng)液，針對不同組別加入含不同成分的DMEM(高糖)培養(yǎng)液2 m L，具體為：對照組及LPS組，加入DMEM(高糖)培養(yǎng)液；用藥組，在DMEM(高糖)培養(yǎng)液中加入濃度為100 μg/mL的木犀草素及槲皮素母液，0.22 μm過濾后稀釋，木犀草素組終濃度分別為5、2.5、1.25 μg/mL，槲皮素組終濃度分別為10、5、2.5 μg/mL，每組3個復(fù)孔，培養(yǎng)4 h。預(yù)處理后吸棄全部培養(yǎng)液，對照組加入DMEM(高糖)培養(yǎng)液；LPS組及各用藥組加入含LPS(終濃度為1 μg/mL)的DMEM(高糖)培養(yǎng)液，培養(yǎng)24 h。分別于培養(yǎng)達6、12、18、24 h時，收集細胞培養(yǎng)上清液，使用Griess試劑盒測定各組樣品的NO含量。

1.2.2.2 木犀草素、槲皮素對RAW264.7細胞分泌TNF-α的影響 細胞處理同1.2.2.1。分別于培養(yǎng)達6、12、18、24 h時，收集細胞培養(yǎng)上清液，使用非即用型ELISA檢測試劑盒測定各組樣品的TNF-α含量。

1.2.2.3 木犀草素、槲皮素對RAW264.7細胞分泌IL-1β、IL-6以及IL-10的影響 細胞處理同1.2.2.1。于培養(yǎng)達24 h時，收集細胞培養(yǎng)上清液，使用非即用型ELISA檢測試劑盒測定各組樣品的IL-1β、IL-6和IL-10含量。

2 結(jié)果

2.1 木犀草素、槲皮素對細胞活性的影響

濃度≤8 μg/mL的木犀草素及濃度≤15 μg/mL的槲皮素在24 h內(nèi)對RAW264.7細胞無毒性作用，OD值與對照組無顯著差異(P>0.05)(圖1)。后續(xù)試驗中的藥物劑量均在安全范圍內(nèi)選取。

1.對照;2.脂多糖;3.9 μg/mL木犀草素;4.8 μg/mL木犀草素;5.7 μg/mL木犀草素;6.6 μg/mL木犀草素;7.20 μg/mL槲皮素;8.15 μg/mL槲皮素;9.10 μg/mL槲皮素;10.5 μg/mL槲皮素
1.Control;2.LPS;3.9 μg/mL luteolin;4.8 μg/mL luteolin;5.7 μg/mL luteolin;6.6 μg/mL luteolin;7.20 μg/mL quercetin;8.15 μg/mL quercetin;9.10 μg/mL quercetin;10.5 μg/mL quercetin
**表示與對照組相比差異極顯著(P<0.01)
**indicates extremely significant difference compared with control group(P<0.01)
圖1木犀草素和槲皮素對RAW264.7的細胞毒性作用
Fig.1 The toxic effect of luteolin and quercetin on RAW264.7

2.2 木犀草素、槲皮素對RAW264.7分泌NO的影響

如圖2所示，LPS組細胞在致炎藥物刺激12 h后，其NO分泌量極顯著地高于對照組(P<0.01)，且在12 h～24 h刺激時間與NO分泌量呈正相關(guān)。木犀草素組(圖2A)、槲皮素組(圖2B)細胞經(jīng)4 h不同濃度的藥物保護后再經(jīng)LPS刺激12、18、24 h，各劑量組的NO分泌量均極顯著地低于LPS組(P<0.01)，其中槲皮素10、5 μg/mL組在18 h時，10 μg/mL組在24 h時，NO的分泌量與對照組相比無顯著差異(P>0.05)，但其余各時間-劑量點的NO分泌量均極顯著地高于對照組(P<0.01)。LPS刺激6 h內(nèi)各組間的NO分泌量無顯著差異(P>0.05)。

2.3 木犀草素、槲皮素對RAW264.7分泌TNF-α的影響

如圖3所示，LPS組細胞在致炎藥物刺激6 h后，TNF-α分泌量極顯著地高于對照組(P<0.01)，且在24 h內(nèi)刺激時間與TNF-α分泌量呈正相關(guān)。木犀草素組(圖3A)、槲皮素組(圖3B)細胞經(jīng)4 h不同濃度的藥物保護后再經(jīng)LPS刺激6、12、18、24 h，各劑量組的TNF-α分泌量均極顯著地低于LPS組(P<0.01)，但同時均極顯著地高于對照組(P<0.01)。分析數(shù)據(jù)得出，木犀草素組、槲皮素組抑制TNF-α分泌的作用在24 h內(nèi)呈劑量依賴性，即在用藥安全范圍內(nèi)，藥物濃度越高抑制TNF-α分泌的效果越好。

A.木犀草素;B.槲皮素
A.Luteolin;B.Quercetin
圖2木犀草素和槲皮素對RAW264.7分泌NO的影響
Fig.2 Effects of luteolin and quercetin on NO secretion of RAW264.7

A.木犀草素;B.槲皮素
A.Luteolin;B.Quercetin
圖3木犀草素和槲皮素對RAW264.7分泌TNF-α的影響
Fig.3 Effects of luteolin and quercetin on TNF-α secretion of RAW264.7

2.4 木犀草素、槲皮素對RAW264.7分泌IL-1β、IL-6的影響

LPS組細胞在致炎藥物刺激24 h后，IL-1β(圖4)、IL-6(圖5)分泌量均極顯著地高于對照組(P<0.01)。木犀草素組、槲皮素組細胞經(jīng)4 h不同濃度的藥物保護后再經(jīng)LPS刺激24 h，其中木犀草素組的IL-1β、IL-6分泌量均極顯著地低于LPS組(P<0.01)，且在24 h內(nèi)呈劑量依賴性，即在用藥安全范圍內(nèi)，藥物濃度越高抑制IL-1β、IL-6分泌的效果越好，但IL-1β及IL-6分泌量依然極顯著地高于對照組(P<0.01)。槲皮素組的IL-1β分泌量均極顯著地低于LPS組(P<0.01)，但依然極顯著地高于對照組(P<0.01)；槲皮素10、5 μg/mL組的IL-6分泌量均極顯著地低于LPS組(P<0.01)，但依然極顯著地高于對照組(P<0.01)，其2.5 μg/mL組的IL-6分泌量與LPS組相比無顯著差異(P>0.05)。

2.5 木犀草素、槲皮素對RAW264.7分泌IL-10的影響

如圖6所示，LPS組細胞在致炎藥物刺激24 h后，IL-10分泌量極顯著地高于對照組(P<0.01)。木犀草素組、槲皮素組細胞經(jīng)4 h不同濃度的藥物保護后再經(jīng)LPS刺激24 h，其中木犀草素各劑量組的IL-10分泌量均極顯著地低于LPS組(P<0.01)，且呈劑量依賴性，即在用藥安全范圍內(nèi)，藥物濃度越高，IL-10分泌量越小，但IL-10分泌量依然極顯著地高于對照組(P<0.01)。槲皮素10、5 μg/mL組的IL-10分泌量極顯著地低于LPS組(P<0.01)，但均極顯著地高于對照組(P<0.01)，其2.5 μg/mL組的IL-10分泌量與LPS組相比無顯著差異(P>0.05)。

1.對照;2.脂多糖;3.5 μg/mL木犀草素;4.2.5 μg/mL木犀草素;5.1.25 μg/mL木犀草素;6.10 μg/mL槲皮素;7.5 μg/mL槲皮素;8.2.5 μg/mL槲皮素
1.Control;2.LPS;3.5 μg/mL luteolin;4.2.5 μg/mL luteolin;5.1.25 μg/mL luteolin;6.10 μg/mL quercetin;7.5 μg/mL quercetin;8.2.5 μg/mL quercetin
**表示與對照組相比差異極顯著(P<0.01)；##表示與LPS組相比差異極顯著(P<0.01)
**indicates extremely significant difference compared with control group (P<0.01);##indicates extremely significant difference compared with LPS group(P<0.01)
圖4木犀草素和槲皮素對RAW264.7分泌IL-1β的影響
Fig.4 Effects of luteolin and quercetin on IL-1β secretion of RAW264.7

1.對照;2.脂多糖;3.5 μg/mL木犀草素;4.2.5 μg/mL木犀草素;5.1.25 μg/mL木犀草素;6.10 μg/mL槲皮素;7.5 μg/mL槲皮素;8.2.5 μg/mL槲皮素
1.Control;2.LPS;3.5 μg/mL luteolin;4.2.5 μg/mL luteolin;5.1.25 μg/mL luteolin;6.10 μg/mL quercetin;7.5 μg/mL quercetin;8.2.5 μg/mL quercetin
**表示與對照組相比差異極顯著(P<0.01)；##表示與LPS組相比差異極顯著(P<0.01)
**indicates extremely significant difference compared with control group (P<0.01);##indicates extremely significant difference compared with LPS group(P<0.01)
圖5木犀草素和槲皮素對RAW264.7分泌IL-6的影響
Fig.5 Effects of luteolin and quercetin on IL-6 secretion of RAW264.7

1.對照;2.脂多糖;3.5 μg/mL木犀草素;4.2.5 μg/mL木犀草素;5.1.25 μg/mL木犀草素;6.10 μg/mL槲皮素;7.5 μg/mL槲皮素;8.2.5 μg/mL槲皮素
1.Control;2.LPS;3.5 μg/mL luteolin;4.2.5 μg/mL luteolin;5.1.25 μg/mL luteolin;6.10 μg/mL quercetin;7.5 μg/mL quercetin;8.2.5 μg/mL quercetin
**表示與對照組相比差異極顯著(P<0.01)；##表示與LPS組相比差異極顯著(P<0.01)
**indicates extremely significant difference compared with control group(P<0.01);##indicates extremely significant difference compared with LPS group(P<0.01)
圖6木犀草素、槲皮素對RAW264.7分泌IL-10的影響
Fig.6 Effects of luteolin and quercetin on IL-10 secretion of RAW264.7

3 討論

本試驗采用LPS誘導(dǎo)RAW264.7細胞作為體外炎癥模型來研究木犀草素及槲皮素的體外抗炎作用。LPS選用劑量參考Park C M等[5]的試驗數(shù)據(jù)，經(jīng)MTT試驗驗證，濃度為1 μg/mL的LPS在24 h內(nèi)對RAW264.7細胞無毒性作用，并確定木犀草素的藥物安全范圍為≤8 μg/mL，槲皮素的藥物安全范圍為≤15 μg/mL。試驗中，作者發(fā)現(xiàn)加入MTT孵育4 h后[6]，細胞內(nèi)有大量呈放射狀生長的深藍色結(jié)晶，可能導(dǎo)致試驗數(shù)據(jù)失真，故本試驗采用加入MTT后孵育2 h的方法檢測藥物的細胞毒性。

RAW264.7細胞作為一種巨噬細胞系，參與機體的免疫過程。LPS是激發(fā)炎癥反應(yīng)的一種很重要的觸發(fā)劑，能夠刺激體內(nèi)多種細胞特別是巨噬細胞合成和釋放眾多內(nèi)源性生物活性因子，導(dǎo)致炎癥反應(yīng)[7]。NO是機體重要的炎癥介質(zhì)，可在LPS的誘導(dǎo)下由巨噬細胞產(chǎn)生，在炎癥的每個階段都發(fā)揮著重要的調(diào)節(jié)作用[8]。范精華等[9]認為，NO在高濃度狀態(tài)下可激活NF-κB信號通路，誘導(dǎo)促炎細胞因子TNF-α和IL-1β的分泌，并且這一過程還能形成正反饋, 最終導(dǎo)致炎癥反應(yīng)持久且劇烈,對機體造成嚴重的損傷，因此抑制 NO的合成能夠使炎癥癥狀得到改善。TNF-α是機體受到有害刺激后初期分泌，起關(guān)鍵始動作用的促炎性細胞因子，其亦可在LPS的誘導(dǎo)下由巨噬細胞產(chǎn)生。TNF-α和IL-1β在炎癥反應(yīng)初期即會高度表達，其核心作用是在炎癥反應(yīng)中激活細胞因子級聯(lián)反應(yīng)，直接反應(yīng)了炎癥反應(yīng)的強烈程度。TNF-α可刺激IL-6的產(chǎn)生，并可相互作用形成正反饋，從而導(dǎo)致炎癥反應(yīng)的持續(xù)加重[10]。因此抑制TNF-α的過量釋放是預(yù)防和治療炎癥的關(guān)鍵措施之一。

本試驗中LPS誘導(dǎo)RAW264.7細胞6 h后，與對照組進行比較，促炎性細胞因子TNF-α分泌量極顯著地升高(P<0.01)；誘導(dǎo)12 h后，NO分泌量極顯著地升高(P<0.01)；誘導(dǎo)24 h后，IL-1β及IL-6分泌量極顯著地升高(P<0.01)，提示體外炎癥模型成功。試驗中，給予用藥組不同質(zhì)量濃度的木犀草素或槲皮素預(yù)處理4 h后，能夠極顯著地抑制LPS誘導(dǎo)RAW264.7細胞分泌炎癥介質(zhì)NO以及促炎性細胞因子TNF-α、IL-1β以及IL-6(P<0.01)，且在一定程度上呈劑量依賴性，即在藥物安全范圍內(nèi)，濃度越高越能夠抑制促炎性細胞因子的分泌，提示木犀草素及槲皮素有理想的體外抗炎效果。用藥后，抗炎性細胞因子IL-10的分泌量未見顯著提高，與其他抗炎藥物的報道不同[11]，可能是因為木犀草素及槲皮素并不直接影響IL-10的分泌。本試驗中IL-10的分泌量可能與炎癥的嚴重程度正相關(guān)，即炎癥越嚴重，IL-10分泌量越大而與木犀草素及槲皮素?zé)o關(guān)。抑制TNF-α、IL-1β以及IL-6釋放的原因是否為NF-κB、MAPK、JAK-STAT等炎癥通路被抑制[12]，有待進一步深入探究。

目前針對木犀草素與槲皮素抗炎活性的研究多停留在理論或?qū)嶒炇译A段，藥物開發(fā)和臨床應(yīng)用方面的研究較少，僅在呼吸系統(tǒng)疾病中偶有涉及[13-14]。希望隨著國家對中藥開發(fā)重視程度及資金投入地不斷加大，木犀草素與槲皮素能夠早日廣泛應(yīng)用于臨床抗炎。

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Anti-inflammatoryEffectsofLuteolinandQuercetininVitro

ZHOU Xiao-nan1,HAN Chao1,SONG Peng-yan1,ZHAO Xing-hua1,2,ZHONG Xiu-hui1,2

(1.CollegeofVeterinaryMedicine,AgriculturalUniversityofHebei，Baoding，Hebei,071001,China;2.InstituteofTraditionalChineseVeterinaryMedicine,AgriculturalUniversityofHebei,Baoding，Hebei,071001,China)

The aim of the study was to evaluate the anti-inflammatory effects of luteolin and quercetininvitroby observing the effect of luteolin and quercetin on NO,TNF-α,IL-1β,IL-6 and IL-10 in culture supernatant of RAW264.7 cells activated by lipopolysaccharides (LPS).RAW264.7 cells at logarithmic growth phase were allocated to blank control group,model group (treated with LPS),luteolin groups (treated with 5,2.5,1.25 μg/mL luteolin respectively),and quercetin groups (treated with 10,5,2.5 μg/mL quercetin respectively).After being treated with luteolin and quercetin for 4 h and then incubated with 1 μg/mL LPS for 24 h,the changes of NO levels were observed by Griess assay,the levels of TNF-α,IL-1β,IL-6 and IL-10 were evaluated by ELISA.The results showed that the luteolin and quercetin decreased the contents of NO,TNF-α,IL-1β and IL-6 significantly in RAW264.7 cells activated by LPS (P<0.05) and in a dose-dependent manner in certain degrees.The combined data showed that luteolin and quercetin has obviously anti-inflammatory effectsinvitro.

luteolin; quercetin; anti-inflammation; RAW264.7

2017-02-19

公益性行業(yè)(農(nóng)業(yè))科研專項(201403051)；河北省教育廳優(yōu)秀青年基金項目(YQ2013019)

周霄楠(1983-)，男，北京人，碩士研究生，主要從事中獸藥藥理及中獸醫(yī)現(xiàn)代化研究。*

S853.74

A

1007-5038(2017)10-0056-06