雞Akirin2和GM-CSF促進(jìn)傳染性法氏囊病病毒VP2基因DNA疫苗免疫效果的研究

任廣彩，劉傳高，黃妙容，黃文科，鐘楚紅，劉郁夫，陳瑞愛,*

(1.肇慶大華農(nóng)生物藥品有限公司，廣東肇慶 526238；2.華南農(nóng)業(yè)大學(xué)獸醫(yī)學(xué)院，廣東廣州 510642)

雞Akirin2和GM-CSF促進(jìn)傳染性法氏囊病病毒VP2基因DNA疫苗免疫效果的研究

任廣彩1，劉傳高2，黃妙容1，黃文科1，鐘楚紅2，劉郁夫2，陳瑞愛1,2*

(1.肇慶大華農(nóng)生物藥品有限公司，廣東肇慶 526238；2.華南農(nóng)業(yè)大學(xué)獸醫(yī)學(xué)院，廣東廣州 510642)

為提高雞傳染性法氏囊病病毒VP2基因DNA疫苗的免疫效力，將IBDV VP2、雞Akirin2和雞GM-CSF三基因編碼區(qū)串聯(lián)后克隆到真核表達(dá)載體pTriEx-4上，用構(gòu)建的pT-VP2-Akirin2-GM-CSF重組質(zhì)粒體外轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞，然后提取表達(dá)產(chǎn)物進(jìn)行SDS-PAGE分析。結(jié)果在58、35、22 ku附近各有一蛋白條帶。用pT-VP2-Akirin2-GM-CSF免疫SPF雞，加強(qiáng)免疫2周后，攻IBDV BC6-85強(qiáng)毒，4 d后統(tǒng)計(jì)保護(hù)率。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，注射14 d后，pT-VP2-Akirin2-GM-CSF質(zhì)粒免疫組血清中能檢測(cè)到特異性IBDV抗體和IBDV中和抗體，第28天，該組雞的抗體滴度極顯著高于空白對(duì)照組(P<0.01)，該組雞外周血淋巴細(xì)胞增殖能力也極顯著高于空白對(duì)照組(P<0.01)。說明VP2-Akirin2-GM-CSF三基因串聯(lián)DNA疫苗有很好的應(yīng)用前景。

雞傳染性法氏囊??；VP2基因；雞Akirin；雞GM-CSF；DNA疫苗

雞傳染性法氏囊病(Infectious bursal disease,IBD)是由雞傳染性法氏囊病病毒(Infectious bursal disease virus，IBDV)引起的一種免疫抑制性疾病，嚴(yán)重危害家禽養(yǎng)殖業(yè)健康發(fā)展[1]。20世紀(jì)80年代流行起來的致病力和抗原性大為不同的變異毒株和超強(qiáng)毒株，能突破傳統(tǒng)疫苗和母源抗體的保護(hù)，使該病的防控形勢(shì)更為嚴(yán)峻[2-4]。DNA疫苗是20世紀(jì)90年代發(fā)展起來的第三代疫苗，在傳染病的防控中顯示出巨大的應(yīng)用前景[5-6]。VP2蛋白是IBDV的主要結(jié)構(gòu)蛋白，與病毒的抗原性[7]、免疫原性、毒力[8]、細(xì)胞嗜性和誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡[9]等有關(guān)。目前IBDV的DNA疫苗或相關(guān)基因工程疫苗大多以VP2作為靶基因，免疫后能起到一定預(yù)防效果[10]，但效果有限，刺激動(dòng)物機(jī)體產(chǎn)生的抗體水平低，保護(hù)力較弱。本研究選擇雞Akirin和雞GM-CSF兩種細(xì)胞因子作為免疫增強(qiáng)劑來構(gòu)建IBD的DNA疫苗。

Goto A等[11]在2008年對(duì)果蠅細(xì)胞進(jìn)行功能性全基因組的RNAi篩選時(shí)發(fā)現(xiàn)一種天然免疫蛋白Akirin，由201個(gè)氨基酸組成，在不同物種間高度保守。在人和牛、小鼠、大鼠、犬等哺乳動(dòng)物中均發(fā)現(xiàn)存在Akirin1和Akirin2兩個(gè)基因，且哺乳動(dòng)物之間Akirin2的同源性明顯高于Akirin1的同源性。雞只有Akirin2基因， 在植物、細(xì)菌和酵母中未發(fā)現(xiàn)該基因[11]。研究表明，Akirin2在果蠅和小鼠的免疫炎癥反應(yīng)中起著重要作用，是天然免疫反應(yīng)信號(hào)通路如Imd和TLR所必須的核內(nèi)因子，并參與到NF-κB依賴的基因轉(zhuǎn)錄中，促進(jìn)多種免疫應(yīng)答基因的轉(zhuǎn)錄[11]。而且豬Akirin2的存在促進(jìn)IL-6的表達(dá)，在獲得性免疫中，IL-6能夠刺激已經(jīng)分化的B淋巴細(xì)胞的生長，因此，Akirin2與先天性免疫和獲得性免疫均有關(guān)聯(lián)。

GM-CSF不僅能刺激造血細(xì)胞增殖、分化、成熟,并從骨髓向外周的轉(zhuǎn)移,而且能活化中性粒細(xì)胞、巨噬細(xì)胞及其他單個(gè)核細(xì)胞，在細(xì)胞因子網(wǎng)絡(luò)中占有重要地位，在免疫反應(yīng)中具有重要作用[12]，GM-CSF作為免疫佐劑具有很廣闊的發(fā)展前景。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 試劑 膠回收試劑盒、去內(nèi)毒素質(zhì)粒大量抽提試劑盒,Omega Bio-Tek公司產(chǎn)品；限制性內(nèi)切酶SacⅠ和Hind Ⅲ、T4 DNA連接酶、PremixTaq酶、DNA Marker,TaKaRa公司產(chǎn)品；表達(dá)載體pTriEx-4 DNA，Merck Millipore公司產(chǎn)品； Lipofectamine LTX and Plus轉(zhuǎn)染試劑，Invitrogen公司產(chǎn)品；Akirin2抗體和GM-CSF抗體，Santa Cruz公司產(chǎn)品；FITC標(biāo)記的兔抗雞IgG和羊抗兔IgG，Bioworld Technology公司產(chǎn)品；Protein Marker、RIPA強(qiáng)裂解液，碧云天公司產(chǎn)品；293T細(xì)胞、DF-1細(xì)胞、E.coliDH5α菌株，本實(shí)驗(yàn)室(農(nóng)業(yè)部動(dòng)物疫病防控生物技術(shù)與制品創(chuàng)制重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室)保存；IBD抗體ELISA檢測(cè)試劑盒，BioChek公司產(chǎn)品；IBDV BC6-85毒株及標(biāo)準(zhǔn)陽性血清，中國獸醫(yī)藥品監(jiān)察所產(chǎn)品；IBD中等毒力B87株疫苗，廣東溫氏大華農(nóng)生物科技有限公司提供；其他生化試劑均為國產(chǎn)分析純。

1.1.2 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 14日齡SPF白來航雞，購自廣東溫氏大華農(nóng)生物科技有限公司禽蛋分公司。

1.2 方法

1.2.1 VP2-Akirin2-GM-CSF-pUC57重組質(zhì)粒的合成 根據(jù)美國國家生物技術(shù)信息中心中的IBDV VP2(GenBank登錄號(hào)AF508177)、雞Akirin2(GenBank登錄號(hào)NM-001193595)和雞GM-CSF(GenBank登錄號(hào)EU939770.1)三基因編碼區(qū)進(jìn)行序列優(yōu)化后串聯(lián)；優(yōu)化方法為去掉后兩個(gè)基因的終止密碼子，且對(duì)IBDV VP2基因進(jìn)行雞的密碼子偏好性優(yōu)化。將上述IBDV VP2基因、雞Akirin2基因和雞GM-CSF基因串聯(lián)形成VP2-Akirin2-GM-CSF序列；每相鄰兩個(gè)基因之間由linker片段進(jìn)行連接。linker序列為連接肽Furin(CGAGCAAAGCGC)和2A(GGCAGTGGAGAGGGCAGAGGAAGTCTAACATGCGGTGACGTCGAGGAGAATCCTGGCCCA)編碼基因，將串聯(lián)基因克隆到pUC57質(zhì)粒，獲得VP2-Akirin2-GM-CSF-pUC57重組質(zhì)粒；VP2-Akirin2-GM-CSF-pUC57重組質(zhì)?；蛐蛄形刑K州金維智生物科技有限公司合成，經(jīng)測(cè)序正確后將質(zhì)粒置于-20℃保存，菌種添加150 mL/L無菌甘油凍存于-80℃。

1.2.2 引物設(shè)計(jì) 根據(jù)VP2-Akirin2-GM-CSF-pUC57基因序列，分別設(shè)計(jì)擴(kuò)增VP2、Akirin2、GM-CSF的引物對(duì)，引物序列如下：

VP2 F：5′-TTTGAGCTCATGACCAACCTCCAAGACCAG-3′,(下劃線部分為SacⅠ酶切位點(diǎn))；VP2 R：5′-CCCAAGCTTACGGAGGGCACGAATGATGTC-3′,(下劃線部分為Hind Ⅲ酶切位點(diǎn))；Akirin2 F：5′-TTTGAGCTCATGGCTTGTGGTGCCACTCTC-3′,(下劃線部分為SacⅠ酶切位點(diǎn))；Akirin2 R：5′-CCCAAGCTTGGACACGTAGGAGGCGGGCTG-3′,(下劃線部分為Hind Ⅲ酶切位點(diǎn));GM-CSF F：5′-CGCGAGCTCATGCATCACCATCACCATCAC-3′,(下劃線部分為SacⅠ酶切位點(diǎn));GM-CSF R：5′-CCCAAGCTTTTAGATGCAATCTTTTTCTTC-3′,(下劃線部分為Hind Ⅲ酶切位點(diǎn))。

上述6條引物委托上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司合成。

1.2.3 PCR擴(kuò)增體系和反應(yīng)程序 采用50 μL PCR反應(yīng)體系，包括：PremixTaq(5 U/μL)25 μL，VP2-Akirin2-GM-CSF-pUC-57(20 ng/μL)5 μL，上、下游引物(20 μmol/L)各2.5 μL，最后用ddH2O補(bǔ)足至50 μL；然后在BioRad PCR儀上進(jìn)行PCR擴(kuò)增，反應(yīng)程序?yàn)椋?5℃ 3 min；95℃ 30 s，56℃ 30 s，72℃ 45 s，35個(gè)循環(huán)；72℃ 10 min；用VP2 F和VP2 R擴(kuò)增VP2基因，Akirin2 F和Akirin2 R擴(kuò)增Akirin2基因，GM-CSF F和GM-CSF R擴(kuò)增GM-CSF基因，VP2 F和GM-CSF R引物擴(kuò)增VP2-Akirin2-GM-CSF串聯(lián)基因。瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)目的條帶大小。

1.2.4 pTVP2-Akirin2-GM-CSF的構(gòu)建

1.2.4.1 酶切、連接 將擴(kuò)增后的產(chǎn)物用瓊脂糖凝膠電泳回收大小為2 532 bp的條帶并純化，獲得目的基因。再將回收的目的基因進(jìn)行SacⅠ和Hind Ⅲ雙酶切：體系PCR回收產(chǎn)物16 μL，10×M buffer 2 μL，SacⅠ 1 μL，Hind Ⅲ 1 μL；pTriEx-4載體雙酶切體系：pTriEx-4載體0.5 μg，10×M buffer 2 μL，SacⅠ 1 μL，Hind Ⅲ 1 μL，最后用ddH2O補(bǔ)足至20 μL。上述雙酶切反應(yīng)均在37℃水浴反應(yīng)2 h。

將目的片段雙酶切產(chǎn)物和pTriEx-4載體雙酶切大片段16℃過夜連接，連接反應(yīng)體系：目的基因雙酶切回收產(chǎn)物6 μL，pTriEx-4載體雙酶切大片段回收產(chǎn)物2 μL，10×Ligase buffer 1 μL，T4 DNA Ligase 1 μL。

1.2.4.2 轉(zhuǎn)化、鑒定 所得連接產(chǎn)物與100 μL大腸埃希菌DH5α感受態(tài)混勻后冰浴30 min，42℃熱激90 s，立即置冰上放置10 min，加入預(yù)熱至室溫的LB液體培養(yǎng)基900 μL，在37℃恒溫?fù)u床上150 r/min培養(yǎng)1 h，5 000 r/min離心1 min，棄去900 μL培養(yǎng)上清，剩余100 μL用移液器混勻后均勻涂布于含100 μg/mL Amp的LB固體培養(yǎng)基平板上，37℃恒溫培養(yǎng)箱倒置培養(yǎng)過夜；倒置培養(yǎng)過夜后的培養(yǎng)基平板上挑取單菌落接種于5 mL含100 μg/mL Amp的LB液體培養(yǎng)基中，在37℃恒溫?fù)u床上200 r/min振蕩培養(yǎng)過夜，用小量質(zhì)粒抽提試劑盒抽提質(zhì)粒，所得質(zhì)粒用SacⅠ和Hind Ⅲ進(jìn)行雙酶切鑒定，將鑒定正確的重組克隆進(jìn)行測(cè)序驗(yàn)證，驗(yàn)證正確的質(zhì)粒命名為pT-VP2-Akirin2-GM-CSF，質(zhì)粒圖譜如圖1。

圖1 質(zhì)粒圖譜Fig.1 Plasmid profile

將所得含有質(zhì)粒pT-VP2-Akirin2-GM-CSF的大腸埃希菌擴(kuò)增后，用去內(nèi)毒素質(zhì)粒提取試劑盒提取純化，用微量分光光度計(jì)進(jìn)行定量，然后用PBS調(diào)整DNA濃度為1 000 ng/μL。

1.2.5 SDS-PAGE檢測(cè) 將pT-VP2-Akirin2-GM-CSF與適量Lipofectamine LTX充分混勻后加入鋪有293T細(xì)胞的細(xì)胞培養(yǎng)板中，利用空載體(pTriEx-4)和3種單基因重組表達(dá)載體pT-VP2、pT-Akirin2、pT-GM-CSF(本實(shí)驗(yàn)室構(gòu)建并測(cè)序正確)同時(shí)進(jìn)行相應(yīng)的對(duì)照試驗(yàn)。48 h后收集所培養(yǎng)的細(xì)胞，RIPA裂解液裂解獲得蛋白。取少量蛋白加入5×SDS Loading buffer，以100 g/L分離膠和40 g/L濃縮膠進(jìn)行SDS-PAGE電泳。

1.2.6 間接免疫熒光檢測(cè) 將pT-VP2-Akirin2-GM-CSF與適量Lipofectamine LTX充分混勻后加入鋪有293T細(xì)胞的細(xì)胞培養(yǎng)板中，37℃繼續(xù)培養(yǎng)72 h后，棄掉培養(yǎng)基，以40 g/L多聚甲醛室溫固定30 min；PBST洗滌3次并拍干后以1 000倍稀釋的雞IBDV陽性血清為一抗4℃孵育過夜；以PBST洗滌3次并拍干后與2 000倍稀釋的FITC標(biāo)記的兔抗雞IgG 37℃孵育2 h；再次以PBST洗滌3次，置于熒光顯微鏡下觀察。以相同的操作步驟檢測(cè)Akirin2和GM-CSF的表達(dá)情況。

1.2.7 免疫攻毒保護(hù)試驗(yàn) 將14日齡SPF白來航雞隨機(jī)分組，共分為7組，每組20羽(表1)。將DNA濃度均為1 000 ng/μL的pT-VP2-Akirin2-GM-CSF質(zhì)粒溶液和pT-VP2、pT-Akirin2、pT-GM-CSF、pTriEx-4四種對(duì)照質(zhì)粒溶液200 μL對(duì)14日齡SPF白來航雞進(jìn)行腿部肌肉兩點(diǎn)注射，并記為第0天，于第14天進(jìn)行同樣處理加強(qiáng)免疫。每天觀察各組雞的變化情況(采食活動(dòng)、精神狀態(tài)等)。于第28天，除空白對(duì)照組1外，其余各組均經(jīng)口感染IBDV BC6/85病毒(接種量為2×104BID50/羽)，記錄各組死亡情況。于第32天將存活雞只全部處死并剖檢，檢查法氏囊的病變情況，法氏囊發(fā)黃、膿腫或萎縮視為發(fā)病，法氏囊外觀粉紅視為正常。試驗(yàn)過程中于第0天、第14天、第28天和第32天各組隨機(jī)取5羽雞進(jìn)行翅下靜脈采血分離血清,參照試劑盒說明檢測(cè)血清中IBDV特異性抗體滴度和IBDV中和抗體滴度，并檢測(cè)第28天各組試驗(yàn)雞外周血淋巴細(xì)胞增殖能力。

表1 試驗(yàn)動(dòng)物分組情況Table 1 Groups of experimental animals

1.2.8 間接ELISA檢測(cè)血清IBDV抗體滴度 按照BioChek IBDV抗體檢測(cè)試劑盒說明書，檢測(cè)上述分離的雞血清IBDV抗體滴度，根據(jù)公式S/P=(樣品OD 405 nm-陰性對(duì)照OD 405 nm)/(陽性對(duì)照OD 405 nm-陰性對(duì)照OD 405 nm)，log10Titer=1.1×log10(S/P)+3.361，計(jì)算血清IBDV抗體滴度(Titer)，Titer≥391判定為IBDV抗體陽性。

1.2.9 IBDV中和抗體滴度檢測(cè) 按Reed-Muench法計(jì)算TCID50。 二免后14 d，各組取5羽雞血清，56 ℃水浴滅活30 min，冷卻至室溫使用。將待檢血清進(jìn)行2倍比連續(xù)稀釋，各取100 μL分別與等體積的病毒懸液(200 TCID50)充分混勻，37 ℃作用1 h。用DMEM將DF-1細(xì)胞調(diào)整至1×105個(gè)/mL，鋪入96孔板，100 μL/孔。取100 μL病毒-血清混合液加入到鋪有細(xì)胞的96孔板中，均重復(fù)4孔。同時(shí)設(shè)立標(biāo)準(zhǔn)陽性血清對(duì)照、陰性血清對(duì)照、正常細(xì)胞對(duì)照和病毒對(duì)照。37℃、體積分?jǐn)?shù)為5%的CO2繼續(xù)培養(yǎng)5 d，每天觀察并記錄結(jié)果，按Reed-Muench法計(jì)算每個(gè)血清樣品的中和抗體效價(jià)，并計(jì)算每組5個(gè)樣品中和抗體效價(jià)的平均數(shù)，作為本試驗(yàn)組該日齡血清的中和抗體效價(jià)(GMT值)。

1.2.10 外周血淋巴細(xì)胞增殖試驗(yàn)(MTT法) 于首免后28 d，每組取5羽雞翅下靜脈采血肝素抗凝，利用雞淋巴細(xì)胞分離液分離外周血淋巴細(xì)胞，以RPMI-1640培養(yǎng)基調(diào)整細(xì)胞密度至5×106個(gè)/mL，100 μL/孔鋪入96孔板。以終濃度為5 μg/mL的ConA刺激48 h，MTT標(biāo)記，經(jīng)DMSO裂解后讀取各孔在570 nm處的吸光值OD 570 nm，作為淋巴細(xì)胞增殖的指標(biāo)。

2 結(jié)果

2.1 VP2、Akirin2、GM-CSF 3個(gè)基因的擴(kuò)增結(jié)果

根據(jù)VP2-Akirin2-GM-CSF-pUC57基因序列，分別設(shè)計(jì)擴(kuò)增VP2、Akirin2、GM-CSF的引物，以質(zhì)粒為模板擴(kuò)增相應(yīng)的目的基因，瓊脂糖凝膠電泳顯示大小分別為1 374 bp(VP2)、591 bp(Akirin2)、453 bp(GM-CSF)和2 532 bp(VP2+Akirin2+GM-CSF串聯(lián)基因)，與預(yù)期結(jié)果一致(圖2)。

M1.DNA 標(biāo)準(zhǔn)DL 2 000;1.VP2；2.Akirin2；3.GM-CSF；4.VP2-Akirin2-GM-CSF；M2.DNA標(biāo)準(zhǔn) DL 5 000M1.DNA Marker DL 2 000;1.VP2；2.Akirin2；3.GM-CSF；4.VP2-Akirin2-GM-CSF；M2.DNA Marker DL 5 000圖2 目的基因PCR擴(kuò)增結(jié)果Fig.2 PCR amplification results of objective genes

2.2 pT-VP2-Akirin2-GM-CSF重組質(zhì)粒酶切鑒定結(jié)果

將重組質(zhì)粒pTVP2-Akirin2-GM-CSF經(jīng)SacⅠ/Hind Ⅲ雙酶切鑒定，獲得大小分別約為5 100 bp和2 500 bp的兩個(gè)片段(圖3)，與預(yù)期結(jié)果相符，測(cè)序結(jié)果也表明重組質(zhì)粒pT-VP2-Akirin2-GM-CSF構(gòu)建正確。

2.3 SDS-PAGE檢測(cè)結(jié)果

pT-VP2-Akirin2-GM-CSF轉(zhuǎn)染 293T細(xì)胞，于轉(zhuǎn)染后48 h收集細(xì)胞裂解后，分別檢測(cè)表達(dá)VP2、Akirin2和GM-CSF 3種蛋白的表達(dá)情況，證實(shí)pT-VP2-Akirin2-GM-CSF能在293T細(xì)胞中表達(dá)目標(biāo)蛋白，檢測(cè)結(jié)果見圖4和圖5。從圖4可知，3種蛋白均有表達(dá)。

M.DNA 標(biāo)準(zhǔn)DL 15 000;1.pTriEx-4；2.pT-VP2-Akirin2-GM-CSFM.DNA Marker DL 15 000;1.pTriEx-4；2.pT-VP2-Akirin2-GM-CSF圖3 重組質(zhì)粒質(zhì)粒SacⅠ/Hind Ⅲ雙酶切鑒定結(jié)果Fig.3 Identification results of pT-VP2-Akirin2-GM-CSF digested with SacⅠ/Hind Ⅲ

2.4 間接免疫熒光檢測(cè)結(jié)果

將pT-VP2-Akirin2-GM-CSF與適量Lipofectamine LTX充分混勻后，加入鋪有293T細(xì)胞的細(xì)胞培養(yǎng)板中，采用IFA分別檢測(cè)VP2、Akirin2、GM-CSF的表達(dá)情況，由圖5可以看出3種基因都能在293T細(xì)胞中表達(dá)。

2.5 免疫攻毒保護(hù)試驗(yàn)

SPF雞注射相應(yīng)DNA后，直至攻毒前，其狀態(tài)未見異常，說明該重組DNA對(duì)雞體的正常生理活動(dòng)無影響。在第14天對(duì)照試驗(yàn)組1和試驗(yàn)組4(pT-VP2-Akirin2-GM-CSF質(zhì)粒注射組)血清中檢測(cè)到特異性IBDV抗體和IBDV中和抗體，第28天抗體滴度明顯升高，且試驗(yàn)組4的抗體滴度極顯著高于試驗(yàn)組1(P<0.01)(表2和表3)。第28天該兩組雞外周血淋巴細(xì)胞增殖能力均增強(qiáng)，且極顯著高于其余各對(duì)照試驗(yàn)組(P<0.01)，試驗(yàn)組4的外周血淋巴細(xì)胞增殖能力極顯著高于對(duì)照試驗(yàn)組1(P<0.01)(表4)。于第28天進(jìn)行攻毒試驗(yàn)，與其余各組相比，對(duì)照試驗(yàn)組1和試驗(yàn)組4的雞只死亡數(shù)和法氏囊病變量均明顯減少，試驗(yàn)組4的存活保護(hù)率達(dá)到100%，病變保護(hù)率達(dá)到85%，保護(hù)效果優(yōu)于試驗(yàn)組1(存活保護(hù)率達(dá)到95%，病變保護(hù)率達(dá)到55%)(表5)。說明3基因共表達(dá)質(zhì)粒pT-VP2-Akirin2-GM-CSF作為DNA疫苗免疫后能夠誘導(dǎo)宿主產(chǎn)生體液免疫應(yīng)答和細(xì)胞免疫應(yīng)答，其誘導(dǎo)的應(yīng)答水平明顯高于單基因表達(dá)載體pT-VP2誘導(dǎo)的應(yīng)答水平，其免疫雞只抵抗IBDV BC6/85毒株感染的能力更強(qiáng)。

M.蛋白分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn);1.pT-Akirin2轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞后表達(dá)產(chǎn)物；2.pT-GM-CSF轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞后表達(dá)產(chǎn)物；3.pT-VP2轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞后表達(dá)產(chǎn)物；4.pT-VP2-Akirin2-GM-CSF轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞后表達(dá)產(chǎn)物；5.正常293T細(xì)胞表達(dá)產(chǎn)物M.Protein molecular weight Marker;1.The expression products of 293T cells after transfection with pTAkirin2;2.The expression products of 293T cells after transfection with pTGM-CSF;3.The expression products of 293T cells after transfection with pTVP2;4.The expression products of 293T cells after transfection with pTVP2-Akirin2-GM-CSF;5.The expression products of 293T cells圖4 目的蛋白的SDS-PAGE檢測(cè)結(jié)果Fig.4 SDS-PAGE results of objective proteins

圖5 重組質(zhì)粒pT-VP2-Akirin2-GM-CSF轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞之后的間接免疫熒光試驗(yàn)檢測(cè)結(jié)果Fig.5 Detection results of indirect immunofluorescence of 293T cells after transfection with pTVP2-Akirin2-GM-CSF

表2 試驗(yàn)雞免疫后血清IBDV抗體水平檢測(cè)結(jié)果Table 2 Detection results of IBDV antibody levels of chicken sera

注：**表示與試驗(yàn)組4差異極顯著(P<0.01)。
Note:**means extremely significant difference compared with treatment group 4 (P<0.01).

表3 試驗(yàn)雞免疫后血清IBDV中和抗體滴度參數(shù)(TITER)變化Table 3 Detection results of IBDV neutralizing antibody levels of chicken sera

注：**表示與試驗(yàn)組4差異極顯著(P<0.01)。
Note:**means extremely significant difference compared with treatment group 4 (P<0.01).

表4 免疫后第28天試驗(yàn)雞外周血淋巴細(xì)胞增殖能力檢測(cè)結(jié)果Table 4 Proliferation activity of peripheral blood lymphocytes from checken blood on day 28 post-immunization

注：**表示與試驗(yàn)組4差異極顯著(P<0.01)。
Note:**means extremely significant difference compared with treatment group 4 (P<0.01).

3 討論

DNA疫苗是將編碼某種抗原的基因克隆到真核表達(dá)載體上，直接注射到動(dòng)物機(jī)體，通過宿主細(xì)胞的蛋白表達(dá)與加工系統(tǒng)合成抗原蛋白，誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生免疫應(yīng)答。因此，構(gòu)建IBDV DNA疫苗最重要的是選擇合適的能誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生對(duì)IBDV產(chǎn)生免疫保護(hù)作用的靶基因。VP2是IBDV的主要結(jié)構(gòu)和抗原蛋白，與病原的毒力變異和致病性有關(guān)，還可以誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生中和抗體，因此，本研究選擇VP2基因作為IBDV DNA疫苗的靶基因。本試驗(yàn)采用的VP2基因序列來源于IBDV超強(qiáng)毒Gx株，將其插入真核表達(dá)載體，轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞，經(jīng)間接免疫熒光檢測(cè)，結(jié)果顯示VP2基因得到了表達(dá)，這與劉紅梅等[10]研究的結(jié)果一致，VP2能在真核表達(dá)載體上表達(dá)。另外，VP2作為潛在的免疫原來研究IBDV基因工程疫苗， 且已在大腸埃希菌系統(tǒng)、 酵母、 昆蟲細(xì)胞、 禽痘病毒、 腺病毒、 火雞皰疹病毒中得到成功表達(dá)。本研究選擇Novagen公司設(shè)計(jì)的pTriEx-4質(zhì)粒作為表達(dá)載體，該載體是一種多系統(tǒng)通用的表達(dá)載體，帶有CMV、T7、p10三種啟動(dòng)子，可以進(jìn)行哺乳動(dòng)物細(xì)胞表達(dá)、原核表達(dá)和桿狀病毒表達(dá)，本實(shí)驗(yàn)室也驗(yàn)證了該載體可以在原核表達(dá)和桿狀病毒表達(dá)系統(tǒng)中表達(dá)。DNA疫苗的抗原合成和遞呈過程與病原的自然感染極為相似，抗原蛋白經(jīng)內(nèi)源性途徑轉(zhuǎn)運(yùn)到細(xì)胞表面，不僅可以誘導(dǎo)體液免疫，還可誘導(dǎo)細(xì)胞免疫[13]。本試驗(yàn)構(gòu)建的pT-VP2單基因疫苗在注射后不僅可以誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生抗體和中和抗體，還能誘導(dǎo)外周淋巴細(xì)胞增殖，說明本研究構(gòu)建的DNA疫苗不僅可以誘導(dǎo)體液免疫，也可誘導(dǎo)細(xì)胞免疫。

表5 免疫雞攻毒后存活和病變情況Table 5 Survival and lesions in immunizaed chickens challenged with IBDV BC6-85 strain

注：*表示與試驗(yàn)組4差異顯著(P<0.05)。
Note：*means significant difference compared with treatment group 4 (P<0.05).

為了探討雞Akirin2和GM-CSF對(duì)IBDV VP2 DNA疫苗免疫效果的影響，本試驗(yàn)根據(jù)GenBank上IBDV VP2(AF508177)、雞源(Gallus)Akirin2(NM-001193595)和GM-CSF(EU939770.1)，設(shè)計(jì)并優(yōu)化合成三者全序列并進(jìn)行串聯(lián)。為了不影響串聯(lián)基因表達(dá)后各自的蛋白構(gòu)象，采用連接肽F-2A作為連接元件。F-2A是一種小分子連接肽，在真核表達(dá)系統(tǒng)中剪切活性高(90%以上)，且不會(huì)影響到上、下游蛋白的生物活性。將三表達(dá)重組質(zhì)粒pT-VP2-Akirin2-GM-CSF瞬時(shí)轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞，通過SDS-PAGE和Western blot分析，表明3種蛋白均能夠在細(xì)胞中表達(dá)，且具有相應(yīng)蛋白的免疫反應(yīng)原性，說明F-2A不會(huì)影響VP2-Akirin2-GM-CSF串聯(lián)基因的表達(dá)。

本研究將重組質(zhì)粒pT-VP2-Akirin2-GM-CSF作為DNA疫苗免疫SPF雞，并利用pT-Akirin2、pT-GM-CSF、pT-VP2、pT-VP2-Akirin2、pT-VP2-GM-CSF、空載體作為對(duì)照，加強(qiáng)免疫后經(jīng)口感染IBDV BC6-85，對(duì)存活保護(hù)率、BBIX和病變保護(hù)率進(jìn)行了統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。我們發(fā)現(xiàn)，VP2 DNA疫苗可以提供55%的病變保護(hù)率，并將死亡率減小至0， Akirin2和GM-CSF共同作為免疫增強(qiáng)劑后病變保護(hù)率明顯改善，提高至85%。pT-VP2-Akirin2-GM-CSF質(zhì)粒注射組在一免后第14天可以檢測(cè)特異性IBDV抗體和IBDV中和抗體，第28天后抗體滴度明顯提高，說明兩種細(xì)胞因子有免疫增強(qiáng)作用。通過ConA刺激重組質(zhì)粒免疫二免后14 d外周血淋巴細(xì)胞的增殖能力，表明pVP2-Akirin2-GM-CSF誘導(dǎo)的淋巴細(xì)胞增殖能力顯著高于其余各重組質(zhì)粒。說明Akirin2和GM-CSF在VP2基因誘導(dǎo)的T細(xì)胞增殖和輔助性T細(xì)胞(Th細(xì)胞)分化過程中起到明顯的促進(jìn)作用。GM-CSF可能是通過促進(jìn)包括樹突狀細(xì)胞( DC)在內(nèi)的抗原遞呈細(xì)胞(APC) 的增殖分化, 并將其吸引到注射部位, 增強(qiáng)抗原遞呈能力, 從而達(dá)到增強(qiáng)免疫效果的作用[14]，Akirin2可能通過Toll-樣 受體( toll-like receptor，TLR) 、 腫瘤壞死因子( TNF) 和白介素-1β( IL-1β) 信號(hào)通路發(fā)揮功能[11]。Akirin2和GM-CSF都是具有很好發(fā)展前景的免疫增強(qiáng)劑，其具體作用機(jī)制有待進(jìn)一步研究。

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Akirin2andGM-CSFPromotetheImmuneEffectofVP2DNAVaccineagainstInfectiousBursalDiseaseVirus

REN Guang-cai1，LIU Chuan-gao2，HUANG Miao-rong1，HUAN Wen-ke1， ZHONG Chu-hong2，LIU Yu-fu2，CHEN Rui-ai1,2

(1.ZhaoqingDahuanongBiologyMedicineCo.,Ltd,Zhaoqing,Guangdong,526238,China;2.CollegeofVeterinaryMedicine,SouthChinaAgriculturalUniversity,Guangzhou,Guangdong,510642,China)

To enhance the immunogenicity of the VP2 DNA vaccine of infectious bursal disease (IBD),the synthesized IBDV VP2,chicken Akirin2 and GM-CSF genes were tandemly cloned into eukaryotic expression vector pTriEx-4 to obtain the recombinant plasmid pT-VP2-Akirin2-GM-CSF.Then the plasmid was used to transfect into 293T cells and analyzed by SDS-PAGE.As expected,the three calculated proteins were approximately 58 ku,35 ku and 22ku.Then,the SPF chickens were immunized with pT-VP2-Akirin2-GM-CSF,followed by challenging with IBDV BC6-85 at 2 weeks post the boost vaccination and the protective rate was calculated 4 days later.The result showed that specific antibodies of IBDV and IBDV neutralizing antibody were detected in sera of the group immunized with pT-VP2-Akirin2-GM-CSF after 14 days,and the antibody titers were extremely higher than that tested in control group after 28 days(P<0.01).Moreover,the result of proliferation of peripheral blood lymphocytes also showed that the ability of proliferation in the group immunized with pT-VP2-Akirin2-GM-CSF was significant stronger than that in control group(P<0.01).

Infectious bursal disease;vp2 protein;chicken Akirin2；chicken GM-CSF；DNA vaccine

2017-02-20

廣東省應(yīng)用型科技研發(fā)專項(xiàng)資金項(xiàng)目(2015B020230011)

任廣彩(1982-)，女，山東人，博士，主要從事基因工程疫苗研究。*

S852.659.4;S852.43

A

1007-5038(2017)10-0013-08