• <tr id="yyy80"></tr>
  • <sup id="yyy80"></sup>
  • <tfoot id="yyy80"><noscript id="yyy80"></noscript></tfoot>
  • 99热精品在线国产_美女午夜性视频免费_国产精品国产高清国产av_av欧美777_自拍偷自拍亚洲精品老妇_亚洲熟女精品中文字幕_www日本黄色视频网_国产精品野战在线观看 ?

    布魯菌鐵轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子rirA基因突變株的構(gòu)建與鑒定

    2017-11-16 02:49:30陳創(chuàng)夫李天森王遠(yuǎn)志劉志強(qiáng)
    關(guān)鍵詞:布魯菌滋養(yǎng)層親本

    王 震,王 勇,張 倩,陳創(chuàng)夫*,郭 飛,李天森,張 輝,王遠(yuǎn)志,劉志強(qiáng),3*

    (1.石河子大學(xué)兵團(tuán)動(dòng)物疾病防控重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,新疆石河子832000;2.石河子大學(xué)新疆地方與民族高發(fā)病教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,新疆石河子 832000;3.新疆畜牧科學(xué)院獸醫(yī)研究所,新疆烏魯木齊 830000)

    研究論文

    布魯菌鐵轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子rirA基因突變株的構(gòu)建與鑒定

    王 震1△,王 勇1△,張 倩1,2,陳創(chuàng)夫1,2*,郭 飛2,李天森1,張 輝1,王遠(yuǎn)志2,劉志強(qiáng)1,3*

    (1.石河子大學(xué)兵團(tuán)動(dòng)物疾病防控重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,新疆石河子832000;2.石河子大學(xué)新疆地方與民族高發(fā)病教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,新疆石河子 832000;3.新疆畜牧科學(xué)院獸醫(yī)研究所,新疆烏魯木齊 830000)

    為了構(gòu)建牛布魯菌S2308(簡稱S2308)的鐵轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子rirA基因突變株(S2308ΔrirA),探討該基因?qū)ψ陨砩L的影響以及其對不同類型細(xì)胞黏附侵襲和胞內(nèi)繁殖的作用。利用同源重組和抗性替換的方法,以卡那抗性基因替換rirA基因,獲得突變株S2308ΔrirA。將親本株S2308、疫苗株RB51和突變株S2308ΔrirA在相同營養(yǎng)條件下培養(yǎng),觀察其振蕩培養(yǎng)時(shí)的生長變化趨勢和靜置培養(yǎng)時(shí)的聚集狀態(tài)。將各菌株侵染人胚胎滋養(yǎng)層細(xì)胞(HPT-8)和小鼠巨噬細(xì)胞(RAW264.7),分別檢測其黏附侵襲能力和胞內(nèi)生存能力。結(jié)果顯示,成功獲得了布魯菌rirA基因突變株且10代內(nèi)未發(fā)生回復(fù)性突變;與親本株相比,S2308ΔrirA在相同體外培養(yǎng)條件下其生長趨勢未發(fā)生明顯改變,且其凝集狀態(tài)與親本株類似;黏附侵襲試驗(yàn)顯示,S2308ΔrirA對HPT-8細(xì)胞的黏附侵襲能力顯著強(qiáng)于親本株,而其對RAW264.7的黏附侵襲能力在一定程度上弱于親本株;布魯菌胞內(nèi)生存試驗(yàn)發(fā)現(xiàn),布魯菌侵染HPT-8細(xì)胞24 h后,其胞內(nèi)細(xì)菌數(shù)量顯著升高,而侵染巨噬細(xì)胞24 h后,S2308ΔrirA的繁殖能力明顯低于親本株。這些結(jié)果表明,鐵轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子rirA基因參與了布魯菌胞內(nèi)寄生的過程,并與菌株的毒力強(qiáng)弱存在密切聯(lián)系。

    布魯菌;鐵轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子;人胚胎滋養(yǎng)層細(xì)胞;小鼠巨噬細(xì)胞

    布魯菌病(Brucellosis)簡稱布病,是由布魯菌(Brucella)引起的世界范圍內(nèi)的人獸共患傳染病[1]。自20世紀(jì)80年代末,全球就有170多個(gè)國家和地區(qū)存在人獸布魯菌病。該病可引起人的波浪熱、慢性感染以及動(dòng)物的流產(chǎn)和睪丸炎等,至今尚無根治方法。布魯菌病每年在我國引起的經(jīng)濟(jì)損失高達(dá)數(shù)億元;嚴(yán)重威脅著我國經(jīng)濟(jì)建設(shè)、人民生活健康和國家安全。

    布魯菌作為一種胞內(nèi)寄生菌,其沒有經(jīng)典的毒力因子[2-3],如莢膜、外毒素、菌毛和質(zhì)粒等。布魯菌的毒力因子是一個(gè)復(fù)雜的病原體分子網(wǎng)絡(luò),其毒力因子的篩選主要取決于其在不同宿主細(xì)胞內(nèi)的生存和繁殖能力[4-5]。目前通過細(xì)胞模型或小鼠動(dòng)物模型成功篩選到200多個(gè)布魯菌毒力基因,功能上可劃分為12類;金屬離子攝取系統(tǒng)作為布魯菌的重要毒力因子,不僅指導(dǎo)細(xì)菌進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)特定的位點(diǎn),也是各種酶所必需的共同因子。

    鐵載體基因是維持布魯菌鐵代謝動(dòng)態(tài)平衡必不可少的毒力因子。布魯菌比較蛋白質(zhì)組學(xué)研究顯示,強(qiáng)弱毒株間的鐵離子攝取相關(guān)蛋白表達(dá)發(fā)生顯著改變[6]。然而,布魯菌鐵離子的新陳代謝是如何被調(diào)控并影響細(xì)菌毒力的機(jī)制尚不清楚。因此,本研究構(gòu)建布魯菌鐵轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子rirA基因缺失株,并對其自身生長特性及其在不同細(xì)胞內(nèi)的黏附侵襲和胞內(nèi)生存能力進(jìn)行評估,為進(jìn)一步揭示布魯菌鐵代謝調(diào)控機(jī)制及其胞內(nèi)寄生機(jī)制奠定基礎(chǔ)。

    1 材料與方法

    1.1 材料

    1.1.1 菌株、細(xì)胞和載體 pMD19-T(sample)載體,TaKaRa公司產(chǎn)品;大腸埃希菌(Escherichiacoli)DH5α、牛布魯菌(Brucellaabortus2308)標(biāo)準(zhǔn)株、牛布魯菌疫苗株RB51、人胚胎滋養(yǎng)層細(xì)胞(HPT-8)和小鼠巨噬細(xì)胞(RAW264.7),兵團(tuán)動(dòng)物疫病防控重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室保存;pUC19K載體,北京軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院惠贈(zèng)。

    1.1.2 主要試劑 布魯菌液體培養(yǎng)基(BrucellaBroth)、布魯菌固體培養(yǎng)基(BrucellaAgar),美國BD公司產(chǎn)品;氨芐青霉素、卡那青霉素,Sigma公司產(chǎn)品,DMEM培養(yǎng)基、胎牛血清,GIBCO公司產(chǎn)品;0.22 μm濾器,美國Milipore公司產(chǎn)品;細(xì)胞培養(yǎng)板,COSTAR公司產(chǎn)品;TaqDNA聚合酶、Pfu DNA聚合酶、DNA Marker,TaKaRa公司產(chǎn)品;質(zhì)粒小提取試劑盒、dNTP、瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒,天根生化科技有限公司產(chǎn)品;其他試劑為國產(chǎn)分析純。

    1.1.3 引物 參照GenBank上公布的卡那抗性基因Kan序列和牛布魯菌標(biāo)準(zhǔn)株2308的rirA基因(BAB2-0678)序列,使用Primer 5引物設(shè)計(jì)軟件設(shè)計(jì)相應(yīng)的引物(表1),引物由北京華大基因公司合成。

    表1 引物和序列Table 1 Primers and sequences

    1.2 方法

    1.2.1 目的基因的高保真擴(kuò)增 以牛布魯菌2308的基因組為模板,分別用rirA-N-F、rirA-N-R和rirA-C-F、rirA-C-R引物高保真擴(kuò)增rirA基因的上、下游同源臂。同時(shí)用含有卡那抗性的PUC19K質(zhì)粒為模板,以Kan-F、Kan-R為引物擴(kuò)增Kan基因。擴(kuò)增后的產(chǎn)物于15 g/L瓊脂糖凝膠中進(jìn)行電泳,特異性目的條帶用康為世紀(jì)的普通瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒回收?;厥债a(chǎn)物置于-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

    1.2.2 布魯菌rirA基因突變株自殺載體的構(gòu)建 以膠回收的rirA基因上游同源臂、卡那抗性基因和rirA下游同源臂按含量1∶1∶1混合作為模板進(jìn)行融合擴(kuò)增;以第一輪PCR的反應(yīng)產(chǎn)物為模板,以rirA-N- F和rirA-C-R為引物進(jìn)行第二輪PCR擴(kuò)增,擴(kuò)增產(chǎn)物瓊脂糖凝膠電泳后進(jìn)行膠回收。將回收的DNA片段與pMD19-T載體連接后,轉(zhuǎn)化DH5α感受態(tài)細(xì)胞,并涂布氨芐抗性LB固體平板,過夜培養(yǎng)后挑取單菌落,進(jìn)行菌液PCR鑒定,將PCR鑒定正確的菌液和質(zhì)粒送華大基因有限公司進(jìn)行測序分析。

    1.2.3 布魯菌rirA基因突變株的構(gòu)建與初步鑒定 取重組自殺質(zhì)粒電轉(zhuǎn)化布魯菌2308感受態(tài)細(xì)胞中,活化后涂布含氨芐和卡那霉素抗性的布魯菌固體培養(yǎng)基,37℃培養(yǎng)24 h~72 h,篩選單克隆。以rirA-N-F和Kan-R為引物進(jìn)行PCR初步鑒定。

    1.2.4 布魯菌rirA基因突變株的遺傳穩(wěn)定性檢測 將篩選的陽性布魯菌突變株經(jīng)過10次反復(fù)傳代培養(yǎng)后,分別用外部檢測引物(rirA-外檢-F/rirA-外檢-R)和內(nèi)部檢測引物(rirA-內(nèi)檢-F/rirA-內(nèi)檢-R)對布魯菌進(jìn)行PCR鑒定和遺傳穩(wěn)定性分析。檢測該缺失株有沒有發(fā)生回復(fù)性突變現(xiàn)象,并對其進(jìn)行常規(guī)的生態(tài)學(xué)觀察。

    1.2.5 布魯菌生長曲線分析 從布魯菌固體培養(yǎng)基上挑取牛布魯菌S2308、RB51以及S2308ΔrirA基因突變株的單菌落,接種于布魯菌液體培養(yǎng)基中,37℃、170 r/min振蕩培養(yǎng)至OD 600 nm≈0.6,然后分別將菌液稀釋到OD 600 nm≈0.1,置于37℃、170 r/min恒溫?fù)u床進(jìn)行培養(yǎng)。培養(yǎng)過程中每2 h取樣1次,每次取樣20 μL菌液,用終濃度為40 g/L的甲醛滅活10 min,檢測OD 600 nm的變化,直至細(xì)菌進(jìn)入平臺(tái)期,繪制S2308、RB51以及S2308ΔrirA的生長曲線。

    1.2.6 布魯菌聚集現(xiàn)象的觀察 從布魯菌固體培養(yǎng)基上挑取牛布魯菌S2308、RB51以及S2308ΔrirA基因突變株的單菌落,接種于布魯菌液體培養(yǎng)基中,37℃、170 r/min振蕩培養(yǎng)至OD 600 nm≈0.6,接種至含有5 mL布魯菌液體培養(yǎng)基的透明玻璃試管中培養(yǎng)至靜止期,觀察細(xì)菌生長的聚集現(xiàn)象。

    1.2.7 布魯菌黏附侵襲試驗(yàn) 將HPT-8和RAW264.7細(xì)胞分別傳代至6孔細(xì)胞培養(yǎng)板中培養(yǎng),當(dāng)單層細(xì)胞生長至80%覆蓋度時(shí)(約1×106個(gè));分別用牛布魯菌S2308、RB51以及S2308ΔrirA基因突變株以感染復(fù)數(shù)為200∶1侵染上述兩種細(xì)胞,在體積分?jǐn)?shù)為5%的CO2、37℃環(huán)境中共孵育10、20、40、60、90、120 min后,PBS漂洗3遍,洗去培養(yǎng)液中未黏附的細(xì)菌,在含有50 μg/mL慶大霉素的DMEM培養(yǎng)基中再孵育60 min殺死胞外菌,PBS漂洗3遍后,用2 mL/L的Tritonx-100裂解細(xì)胞釋放胞內(nèi)菌,倍比稀釋后涂布布魯菌固體平板。記錄各組細(xì)菌的數(shù)量,比較S2308、RB51以及S2308ΔrirA基因突變株黏附入侵胚胎滋養(yǎng)層細(xì)胞和小鼠巨噬細(xì)胞的能力。

    1.2.8 布魯菌胞內(nèi)生存試驗(yàn) HPT-8和RAW264.7細(xì)胞在6孔板中培養(yǎng)形成單層細(xì)胞(約1×106個(gè)),將牛布魯菌S2308、RB51以及S2308ΔrirA 基因突變株以200∶1的感染復(fù)數(shù)侵染細(xì)胞。37℃共孵育90 min。PBS緩沖液漂洗細(xì)胞3次,去除未感染的胞外細(xì)菌,添加含有50 μg/mL慶大霉素的DMEM培養(yǎng)基,再孵育60 min殺死胞外菌,PBS漂洗3次,更換不含有抗生素的胎牛血清DMEM培養(yǎng)液,于侵染結(jié)束后的不同時(shí)間點(diǎn)(0、4、8、12、24 h)去除培養(yǎng)基,PBS漂洗3次。用2 mL/L的Tritonx-100裂解細(xì)胞,室溫放置10 min,釋放胞內(nèi)菌,將裂解液倍比稀釋以后涂布魯菌固體平板,計(jì)算CFU;比較布魯菌S2308、RB51以及S2308ΔrirA基因突變株在胚胎滋養(yǎng)層細(xì)胞和小鼠巨噬細(xì)胞內(nèi)的復(fù)制繁殖能力。

    2 結(jié)果

    2.1 布魯菌rirA基因突變株的構(gòu)建

    2.1.1 目的基因的高保真擴(kuò)增 以布魯菌S2308基因組為模板,對rirA 基因的上、下游同源臂序列進(jìn)行PCR擴(kuò)增,經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳顯示,獲得了大小分別約為470 bp和437 bp的特異性片段,與布魯菌 rirA基因上、下游同源臂的理論值相符;同時(shí)以pUC19K為模板擴(kuò)增卡那抗性基因Kan ,獲得的基因片段約為1 093 bp(圖1)。

    A:M.DNA 標(biāo)準(zhǔn)DL 1 000;1.陰性對照;2~4.rirA-N PCR產(chǎn)物;B:M.DNA 標(biāo)準(zhǔn)DL 1 000;1.陰性對照;2~4.rirA-C PCR產(chǎn)物;C:M.DNA標(biāo)準(zhǔn)DL 1 200;1.陰性對照;2~4.卡那抗性基因Kan PCR產(chǎn)物
    A:M.DNA Marker DL 1 000;1.Negative control;2-4.PCR products of N-terminal of rirA gene;B:M.DNA Marker DL 1 000;1.Negative control;2-4.PCR products of C-terminal of rirA gene;C:M.DNA Marker of DL 1 200;1.Negative control;2-4.Kanamycin resistance gene
    圖1 rirA基因同源臂和卡那抗性基因Kan的PCR擴(kuò)增
    Fig.1 PCR amplification of rirA gene homologous arms and Kanamycin resistance gene

    2.1.2 布魯菌rirA基因突變株自殺載體的構(gòu)建 使用融合PCR對獲得的rirA基因上游同源臂、Kan抗性基因和rirA基因下游同源臂三段目的基因進(jìn)行融合擴(kuò)增,經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳,顯示獲得了大小約2 000 bp的特異性條帶(圖2)。將回收后的融合片段與pMD19-T載體連接轉(zhuǎn)化,獲得的同源重組載體pMD19-T-ΔrirA-Kan經(jīng)菌液PCR驗(yàn)證,顯示其與rirA上、下游同源臂和卡那抗性基因序列疊加的理論值一致(圖3)。經(jīng)華大基因測序顯示,其同源性為100%。

    2.1.3 布魯菌S2308ΔrirA基因突變株的篩選鑒定 將同源重組質(zhì)粒pMD19-T-ΔrirA-Kan電轉(zhuǎn)化至布魯菌S2308中,通過rirA上、下游同源序列的交換,置換出染色體上的待缺失區(qū)域,獲得的卡那抗性克隆菌命名為S2308ΔrirA,用鑒定引物rirA-N-F和Kan-R對S2308ΔrirA行擴(kuò)增,結(jié)果S2308ΔrirA突變株可以擴(kuò)增出預(yù)期大小1 563 bp的特異片段,而對照組S2308的擴(kuò)增結(jié)果為陰性,表明抗性基因正確替換了rirA基因(圖4)。

    M.DNA 標(biāo)準(zhǔn)DL 2 000;1~3.rirA-N-K-C融合PCR產(chǎn)物M.DNA Marker DL 2 000;1-3.rirA-N-K-C fusion PCR products圖2 rirA同源臂與卡那抗性基因Kan的融合PCR擴(kuò)增Fig.2 PCR amplification of fusion rirA gene homolofous arms and kanamycin resistance gene

    M.DNA 標(biāo)準(zhǔn)DL 5 000;1.陰性對照;2~4.PMD19-T-ΔrirA-Kan重組質(zhì)粒M.DNA Marker DL 5 000;1.Negative control;2-4.PMD19-T-ΔrirA-Kan plasmid圖3 同源重組載體PMD19-T-ΔrirA-Kan的菌液PCR鑒定Fig.3 PCR verification of PMD19-T-ΔrirA-Kan plasmid

    M.DNA 標(biāo)準(zhǔn)DL 10 000;1.陰性對照;2.S2308;3~5.S2308ΔrirAM.DNA Marker DL 10 000;1.Negative control;2.S2308;3-5.S2308ΔrirA圖4 S2308ΔrirA突變株的篩選鑒定Fig.4 The identification of S2308ΔrirA

    2.2 布魯菌rirA基因突變株的遺傳穩(wěn)定性檢測

    將鑒定正確的基因突變株S2308ΔrirA傳代至第10代,突變菌株在傳代培養(yǎng)過程中與親本菌株比較,未發(fā)現(xiàn)肉眼可見的變化,如突變株生長速度,菌落顏色和形態(tài)等特征。分別用內(nèi)部檢測引物和外部檢測引物對傳代菌進(jìn)行PCR驗(yàn)證,內(nèi)部引物和外部檢測引物檢測缺失前后目的片度的變化如表2。

    結(jié)果顯示,構(gòu)建的基因突變株缺失前后,所擴(kuò)增的基因片段與理論值一致,說明成功獲得了相應(yīng)的突變株,并且基因突變株經(jīng)過10代連續(xù)培養(yǎng)后未發(fā)生回復(fù)突變現(xiàn)象,表明S2308ΔrirA突變株可進(jìn)行穩(wěn)定遺傳(圖5)。

    表2 檢測引物及片段長度Table 2 Detection primer and fragment length

    2.3 生長曲線

    布魯菌S2308、RB51以及S2308ΔrirA基因突變株在相同初始濃度(OD 600 nm≈0.1)下進(jìn)行培養(yǎng),每2 h測定一次菌液濃度(OD 600 nm),直至細(xì)菌生長進(jìn)入平臺(tái)期。從體外培養(yǎng)的生長曲線中可以看出,S2308ΔrirA突變株在初始濃度(OD 600 nm≈0.1) 下培養(yǎng)約32 h 后,細(xì)菌進(jìn)入對數(shù)生長期;約40 h后,細(xì)菌生長進(jìn)入平臺(tái)期。雖然S2308ΔrirA、RB51和S2308菌株整體生長趨勢類似,但同一時(shí)間點(diǎn)菌株濃度存在微小差異。而且布魯菌S2308ΔrirA和RB51的生長速度明顯快于親本株2308(圖6)。

    2.4 布魯菌聚集現(xiàn)象

    對布魯菌親本株S2308、疫苗株RB51和S2308ΔrirA基因突變株進(jìn)行靜置培養(yǎng),當(dāng)布魯菌生長至靜止期時(shí),發(fā)現(xiàn)布魯菌S2308ΔΔrirA基因突變株與布魯菌親本株S2308相比,未發(fā)生明顯變化,均處于渾濁生長狀態(tài);而布魯菌RB51株培養(yǎng)液中形成生物膜樣的聚集現(xiàn)象(圖7)。

    2.5 布魯菌的黏附侵襲能力

    布魯菌侵染小鼠巨噬細(xì)胞RAW264.7過程中,隨著侵染時(shí)間的延長,布魯菌親本株S2308、疫苗株RB51和S2308ΔrirA基因突變株黏附入侵的數(shù)量逐漸增加,至40 min各菌株進(jìn)入RAW264.7的數(shù)量達(dá)到飽和。布魯菌與小鼠巨噬細(xì)胞RAW264.7共孵育40 min和60 min時(shí),S2308ΔrirA基因突變株黏附侵襲能力顯著低于親本株S2308和疫苗株RB51(P<0.05)(圖8)。由此可見,rirA基因在一定程度上調(diào)控了布魯菌對巨噬細(xì)胞的入侵過程。

    在胚胎滋養(yǎng)層細(xì)胞中,隨著細(xì)菌與胚胎滋養(yǎng)層細(xì)胞共孵育時(shí)間的延長,進(jìn)入胚胎滋養(yǎng)層細(xì)胞的細(xì)菌數(shù)量逐漸增加;大約90 min各株布魯菌進(jìn)入細(xì)胞的數(shù)量不再增加,胞內(nèi)細(xì)菌數(shù)接近飽和;各時(shí)間段布魯菌S2308ΔrirA和RB51菌株黏附侵襲能力極顯著高于S2308(P<0.01)(圖9)。表明rirA基因可通過某些機(jī)制抑制布魯菌入侵胚胎滋養(yǎng)層細(xì)胞。

    A:外部引物PCR檢測;M.DNA 標(biāo)準(zhǔn)DL 7 000;1.陰性對照;2.S2308;3.pMD19-T-ΔrirA-Kan質(zhì)粒;4~13.S2308ΔrirA基因突變株B:內(nèi)部引物PCR檢測;M.DNA標(biāo)準(zhǔn)DL 4 500;1.陰性對照;2.S2308;3.pMD19-T-ΔrirA-Kan質(zhì)粒;4~13.S2308ΔrirA基因突變株A:Identification of S2308ΔrirA by outer primers;M.DNA Marker DL 7 000;1.Negative control;2.S2308;3.PMD19-T-ΔrirA-Kan positive control;4-13.S2308ΔrirA mutant strainB:Identification of S2308ΔrirA by inner primers;M.DNA Marker DL 4 500;1.Negative control;2.S2308;3.PMD19-T-ΔrirA-Kan positive control;4-13.S2308ΔrirA mutant strain

    圖5布魯菌S2308ΔrirA遺傳穩(wěn)定性檢測
    Fig.5 The genetic stability test ofBrucellaS2308ΔrirA

    圖6 布魯菌生長曲線Fig.6 The gowth curve of Brucella strains

    1.空白對照;2.S2308親本株;3.S2308ΔrirA基因突變株;4.RB51疫苗株
    1.Blank control;2.S2308 strain; 3.S2308ΔrirA strain;4.RB51 strain
    圖7布魯菌的聚集現(xiàn)象
    Fig.7 Aggregates formed duringBrucellagrowth

    圖8 布魯菌對小鼠巨噬細(xì)胞的黏附侵襲能力Fig.8 Invasive ability of Brucella to RAW264.7

    2.6 布魯菌的胞內(nèi)生存能力

    布魯菌侵染小鼠巨噬細(xì)胞RAW264.7后,4 h各布魯菌菌株胞內(nèi)細(xì)菌數(shù)量顯著降低。與親本株S2308相比,S2308ΔrirA 基因突變株在侵染后24 h,胞內(nèi)細(xì)菌數(shù)量顯著性下降(P<0.01)。而RB51菌株侵染小鼠巨噬細(xì)胞后隨著時(shí)間的延長,胞內(nèi)細(xì)菌數(shù)量持續(xù)降低(圖10)。

    在胚胎滋養(yǎng)層細(xì)胞中,布魯菌親本株S2308、疫苗株RB51和S2308ΔrirA基因突變株以200∶1的比例侵襲胚胎滋養(yǎng)層細(xì)胞90 min,在侵染后的不同時(shí)間通過胞內(nèi)布魯菌CFU的變化,比較它們在胚胎滋養(yǎng)層細(xì)胞內(nèi)的復(fù)制繁殖能力。結(jié)果顯示,S2308、RB51和S2308ΔrirA基因突變株在侵染后12 h內(nèi),同一菌株在不同時(shí)間點(diǎn)其胞內(nèi)細(xì)菌數(shù)量無顯著變化(P>0.05);但侵染24 h后,同一菌株胞內(nèi)細(xì)菌數(shù)量極顯著高于其他時(shí)間點(diǎn)(P<0.01)。同時(shí)研究發(fā)現(xiàn),S2308ΔrirA 基因突變株和RB51疫苗株侵染HPT-8細(xì)胞后的各個(gè)時(shí)間段,其胞內(nèi)細(xì)菌數(shù)量極顯著高于S2308株(P<0.01)(圖11)。

    圖9 布魯菌對胚胎滋養(yǎng)層細(xì)胞的黏附侵襲能力Fig.9 Invasive ability of Brucella to HPT-8

    圖10 布魯菌在小鼠巨噬細(xì)胞內(nèi)的存活能力Fig.10 The intracellular survival ability of Brucella in RAW264.7

    圖11 布魯菌在胚胎滋養(yǎng)層細(xì)胞內(nèi)存活能力Fig.11 The intracellular survival ability of Brucella in HPT-8

    由此可以發(fā)現(xiàn),不僅布魯菌在不同細(xì)胞中的存活能力存在一定差異,而且rirA基因的缺失在一定程度上改變了其在不同細(xì)胞中的復(fù)制能力。表明rirA基因調(diào)控布魯菌的生存繁殖。

    3 討論

    布魯菌病是一種自然疫源性人獸共患病,可通過呼吸道、消化道、皮膚和生殖道感染宿主,以流產(chǎn)和發(fā)熱為主要特征,易引起多器官的損傷;布魯菌是布魯菌病的致病菌,其對營養(yǎng)要求嚴(yán)格,在營養(yǎng)條件較高的培養(yǎng)基中才能生長,因此細(xì)菌的生長和增殖需要大量的能量代謝以及生物大分子的合成物質(zhì)。本研究發(fā)現(xiàn),相同培養(yǎng)條件下的S2308ΔrirA基因突變株較親本株提前4 h~6 h進(jìn)入平臺(tái)期。說明rirA基因可能參與了布魯菌能量代謝和生物大分子合成等生長相關(guān)基因的調(diào)控,這也與間接論證了Martin R等提出的rirA基因參與布魯菌對鐵代謝的調(diào)控研究[7]。

    本研究同時(shí)還發(fā)現(xiàn),布魯菌S2308ΔrirA基因突變株的聚集類似于布魯菌親本株2308,而布魯菌疫苗株RB51出現(xiàn)明顯的聚集現(xiàn)象,這與某些粗糙型布魯菌也會(huì)發(fā)生聚集現(xiàn)象的報(bào)道一致。聚集現(xiàn)象似乎與細(xì)菌的毒力沒有直接的關(guān)系,因?yàn)橐恍┚哂胁煌玖Φ木甓伎赡馨l(fā)生聚集現(xiàn)象[8]。細(xì)菌的聚集是生物膜形成的第一步,細(xì)菌生物膜的形成有利于其應(yīng)對惡劣環(huán)境,從而有利于細(xì)菌的生存。

    很多證據(jù)已經(jīng)表明,病原致病能力與其攝取鐵的能力直接相關(guān)[9-10]。Almirón M等[11]對鐵螯合蛋白酶hemH基因的研究發(fā)現(xiàn),缺失hemH基因的布魯菌其毒力明顯降低。布魯菌沒有典型的外毒素,因此,其毒力主要表現(xiàn)為侵襲力和繁殖力。本研究發(fā)現(xiàn),布魯菌侵染非專業(yè)吞噬細(xì)胞時(shí)間大約90 min才可飽和進(jìn)入胚胎滋養(yǎng)層細(xì)胞,且S2308ΔrirA基因突變株黏附侵襲能力高于親本株S2308;同時(shí)其在滋養(yǎng)層細(xì)胞中的生存能力檢測發(fā)現(xiàn),該突變株與親本株或疫苗株其胞內(nèi)細(xì)菌變化趨勢基本一致;而在侵染巨噬細(xì)胞試驗(yàn)中,布魯菌黏附入侵40 min細(xì)菌量達(dá)到最高水平;之前王玉飛[12]在布魯菌侵染巨噬細(xì)胞的研究中也發(fā)現(xiàn),布魯菌45 min可飽和進(jìn)入巨噬細(xì)胞。本研究中也發(fā)現(xiàn)S2308ΔrirA在巨噬細(xì)胞內(nèi)的繁殖能力介于親本S2308和疫苗株RB51之間;這些結(jié)果說明,布魯菌對專業(yè)和非專業(yè)吞噬細(xì)胞的侵染方式存在明顯不同。已有研究表明,布魯菌進(jìn)入巨噬細(xì)胞時(shí),或者是通過細(xì)菌同巨噬細(xì)胞表面直接接觸,或者是通過細(xì)菌表面同血清調(diào)理素間接地相互作用[13]。然而,布魯菌感染非專業(yè)吞噬細(xì)胞的早期運(yùn)輸和復(fù)制機(jī)制尚不明確[14]。因此,解析布魯菌在細(xì)胞內(nèi)的生存繁殖及其分子機(jī)制是了解布魯菌致病性的關(guān)鍵。

    [1] Pappas G.The changingBrucellaecology:novel reservoirs,new threats[J].Int J Antimicrob Agents,2010,36(5):S8-S11.

    [2] Moreno E,Moriyon I.Brucellamelitensis:a nasty bug with hidden credentials for virulence[J].Proc Natl Acad Sci U S A,2002,99(1):1-3.

    [3] Gorve J P,Moreno E.Brucellaintracellular life:from invasion to intracellular replication [J].Vet Microbiol,2002,90(1-4):281-297.

    [4] Smith H.What happens to bacterial pathogensinvivo?[J].Trends Microbiol,1998,6(6):239-243.

    [5] Plommet M,Plommet A M.Virulence ofBrucella:bacterial growth and decline in mice [J].Ann Rech Vet,1988,19(1):65-67.

    [6] Audic S,Lescot M,Claverie J M,et al.Brucellamicroti:the genome sequence of an emerging pathogen[J].BMC Genomics,2009,10(1):1-18.

    [7] Roop R M.Metal acquisition and virulence inBrucella[J].Anim Health Res Rev,2012,13(1):10-20.

    [8] Uzureau S,Godefroid M,Deschamps C,et al.Mutations of the quorum sensing-dependent regulator VjbR lead to drastic surface modifications inBrucellamelitensis[J].J Bacteriol,2007,189(16):6035-6047.

    [9] Eskra L,Covert J,Glasner J,et al.Differential expression of iron acquisition genes byBrucellamelitensisandBrucellacanisduring macrophage infection[J].PLoS One,2012,7(3):e31747.

    [10] Hibbing M E,Fuqua C.Antiparallel and interlinked control of cellular iron levels by the Irr and RirA regulators of agrobacterium tumefaciens[J].J Bacteriol,2011,193(14):3461-3472.

    [11] Almirón M,Martínez M,Sanjuan N,et al.Ferrochelatase is present inBrucellaabortusand is critical for its intracellular survival and virulence[J].Infect Immun,2001,69(10):6225-6230.

    [12] 王玉飛.Ⅳ型分泌系統(tǒng)調(diào)控布魯菌胞內(nèi)生存的分子機(jī)制研究[D].北京:軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院,2008.

    [13] Watarai M,Makino S,Michikawa M,et al.Macrophage plasma membrane cholesterol contributes toBrucellaabortusinfection of mice[J].Infect Immun,2002,70(9):4818-4825.

    [14] Celli J.Surviving inside a macrophage:The many ways ofBrucella[J].Res Microbiol,2006,157(2):93-98.

    ConstructionandIdentificationofIronTranscriptionFactorrirAGeneMutantofBrucella

    WANG Zhen1,WANG Yong1,ZHANG Qian1,2,CHEN Chuang-fu1,2,GUO Fei2,LI Tian-sen1,ZHANG Hui1,WANG Yuan-zhi2,LIU Zhi-qiang1,3

    (1.KeyLaboratoryofPreventionandControlofAnimalDisease,ShiheziUniversity,Shihezi,Xinjiang,832000,China;2.EducationKeyLaboratoryofXinjiangEndemicandEthnicDisease,ShiheziUniversity,Shihezi,Xinjiang,832000,China;3.VeterinaryResearchInstituteofXinjiangAcademyofAnimalSciences,Urumqi,Xinjiang,830000,China)

    To construct the iron transcription factor rirA gene mutant (S2308ΔrirA) ofB.abortusS2308 (S2308),and explore the impact of this gene on its growth and the function of cell invasion or intracellular survival in various cells,the methods of homologous recombination and replacement were applied,and the kanamycin gene was used to replace rirA gene obtaining mutant S2308ΔrirA.The parent strain S2308,vaccine strain RB51 and mutant S2308ΔrirA were cultured in the same nutrient condition.The growth and aggregation status were recorded.Then human trophoblast cells (HPT-8) and macrophages (RAW264.7) were infected with these strains.The invasive and survival abilities were detected.The results showed that the S2308ΔrirA mutant strain was successfully obtained,and was genetically stable within 10 passages.Compared with the parent strain,the growing trends and aggregation of mutant and parent strains were coincidentinvitro.The adhesion ability of S2308 rirA was significantly stronger than that of the parent strain to HPT-8 cells,but slightly weaker to RAW264.7 cells.After 24 h post-infection,the numbers ofBrucellain HPT-8 cells were significantly increased,while the bacterial counts in RAW264.7 cells infected with S2308ΔrirA were significantly lower than that of the parent strain.All of these results indicated that the iron transcription factor rirA gene is involved in the process of intracellular parasitism ofBrucella,and closely related with the virulence.

    Brucella;iron transcription factor;HPT-8;RAW264.7

    2017-01-03

    新疆生產(chǎn)建設(shè)兵團(tuán)動(dòng)物疾病防控重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室開放課題 (BTDJ06);國家自然科學(xué)基金項(xiàng)目(31572491,31660705)

    王 震(1987-),男,山東濰坊人,博士研究生,主要從事免疫遺傳與抗病機(jī)理研究。王 勇(1981-),男,新疆石河子人,講師,博士,主要從事病原微生物致病機(jī)制研究。△同等貢獻(xiàn)作者。*

    S852.614;Q789

    A

    1007-5038(2017)10-0001-07

    猜你喜歡
    布魯菌滋養(yǎng)層親本
    甘蔗親本農(nóng)藝性狀評價(jià)與分析
    中國糖料(2023年4期)2023-11-01 09:34:46
    微小miR-184在調(diào)控女性滋養(yǎng)層細(xì)胞凋亡中的作用及其分子機(jī)制探究
    幾種蘋果砧木實(shí)生后代與親本性狀的相關(guān)性
    廣西羊種布魯菌病菌株種型鑒定及評價(jià)
    Kisspeptin對早期胎盤滋養(yǎng)層細(xì)胞的調(diào)節(jié)作用
    云瑞10系列生產(chǎn)性創(chuàng)新親本2種方法評價(jià)
    布魯菌病的流行特點(diǎn)及防控措施
    布魯菌缺失疫苗株M5-ΔznuA和M5-Δbp26-ΔznuA的構(gòu)建及毒力和免疫原性的評估
    滋養(yǎng)層干細(xì)胞研究進(jìn)展
    兩種全自動(dòng)微生物鑒定系統(tǒng)在布魯菌鑒定中的應(yīng)用比較
    嘟嘟电影网在线观看| 精品久久久噜噜| 久久鲁丝午夜福利片| 男的添女的下面高潮视频| 日韩大片免费观看网站 | 天堂网av新在线| 国产黄片美女视频| 在线观看一区二区三区| 亚洲欧美日韩卡通动漫| 亚洲美女搞黄在线观看| 亚洲经典国产精华液单| 精品一区二区免费观看| 国产免费视频播放在线视频 | 欧美日本视频| 久久99蜜桃精品久久| 国产黄a三级三级三级人| 亚洲va在线va天堂va国产| 国产精品久久电影中文字幕| 国产精品乱码一区二三区的特点| 少妇丰满av| 精品免费久久久久久久清纯| 成人鲁丝片一二三区免费| 赤兔流量卡办理| 永久免费av网站大全| 日韩三级伦理在线观看| 亚洲欧美中文字幕日韩二区| 国产免费又黄又爽又色| av在线蜜桃| 亚洲精品色激情综合| 能在线免费看毛片的网站| 精品久久久久久成人av| 最近中文字幕2019免费版| 久久这里只有精品中国| 亚洲精品影视一区二区三区av| 18禁动态无遮挡网站| 麻豆成人av视频| 国产亚洲5aaaaa淫片| 亚洲欧洲国产日韩| 天美传媒精品一区二区| 男人狂女人下面高潮的视频| 欧美日韩国产亚洲二区| 最新中文字幕久久久久| 岛国在线免费视频观看| 国产av一区在线观看免费| 久久久久久久久久久免费av| 日韩大片免费观看网站 | 看免费成人av毛片| 日韩制服骚丝袜av| 国内精品宾馆在线| 国产在线男女| 深夜a级毛片| 我要搜黄色片| 内地一区二区视频在线| 在线天堂最新版资源| 婷婷六月久久综合丁香| 久久国内精品自在自线图片| 国产精品野战在线观看| 91aial.com中文字幕在线观看| 99九九线精品视频在线观看视频| 亚洲av电影不卡..在线观看| 少妇高潮的动态图| 国产精品,欧美在线| 男人的好看免费观看在线视频| 午夜久久久久精精品| 在线观看66精品国产| 日韩制服骚丝袜av| 国产淫片久久久久久久久| 日韩视频在线欧美| 亚洲精品久久久久久婷婷小说 | 在线免费观看不下载黄p国产| 国产激情偷乱视频一区二区| 91aial.com中文字幕在线观看| 午夜亚洲福利在线播放| 亚洲图色成人| 天堂中文最新版在线下载 | 日本黄大片高清| 国产精品一区二区三区四区久久| 国产精品久久久久久精品电影小说 | 成年女人看的毛片在线观看| 免费av毛片视频| 国产在视频线精品| 午夜免费男女啪啪视频观看| 亚洲精品日韩av片在线观看| 一级毛片我不卡| 久久人妻av系列| 熟女电影av网| 久久久久久国产a免费观看| 日韩 亚洲 欧美在线| 麻豆一二三区av精品| 波多野结衣高清无吗| 国产亚洲最大av| 国产精品一二三区在线看| 亚洲无线观看免费| 欧美bdsm另类| 老司机影院成人| 免费一级毛片在线播放高清视频| 2022亚洲国产成人精品| 丝袜美腿在线中文| 国产精品麻豆人妻色哟哟久久 | 九色成人免费人妻av| 水蜜桃什么品种好| 国产成人一区二区在线| 热99在线观看视频| 久久久国产成人免费| 秋霞伦理黄片| 免费观看a级毛片全部| 69人妻影院| 亚洲不卡免费看| 亚洲成人av在线免费| 国产精品,欧美在线| 国产老妇伦熟女老妇高清| 秋霞伦理黄片| 美女大奶头视频| 毛片一级片免费看久久久久| 午夜久久久久精精品| av在线蜜桃| 狂野欧美激情性xxxx在线观看| 欧美丝袜亚洲另类| 人妻制服诱惑在线中文字幕| 又粗又硬又长又爽又黄的视频| 精品人妻熟女av久视频| 日本熟妇午夜| 亚洲精品乱久久久久久| 国产视频内射| 最近中文字幕2019免费版| 长腿黑丝高跟| 国产亚洲一区二区精品| 老司机影院毛片| 亚洲自偷自拍三级| 麻豆av噜噜一区二区三区| 日本熟妇午夜| 亚洲av成人av| 国产单亲对白刺激| 精品熟女少妇av免费看| 舔av片在线| 极品教师在线视频| 国产精品一区二区性色av| 亚洲最大成人av| 嘟嘟电影网在线观看| 国产精品一区二区在线观看99 | 超碰av人人做人人爽久久| 免费大片18禁| 内地一区二区视频在线| 又粗又爽又猛毛片免费看| 国产精品女同一区二区软件| 亚洲国产精品国产精品| 久久欧美精品欧美久久欧美| 性插视频无遮挡在线免费观看| 真实男女啪啪啪动态图| 自拍偷自拍亚洲精品老妇| 99国产精品一区二区蜜桃av| 免费人成在线观看视频色| 国产av在哪里看| 亚洲欧美日韩卡通动漫| 免费一级毛片在线播放高清视频| 亚洲美女视频黄频| 99热全是精品| 人妻制服诱惑在线中文字幕| 精品久久国产蜜桃| 中文字幕免费在线视频6| 中文亚洲av片在线观看爽| 久久久久久久午夜电影| 国产久久久一区二区三区| av.在线天堂| 国产一区二区亚洲精品在线观看| 六月丁香七月| 国产亚洲av片在线观看秒播厂 | 五月伊人婷婷丁香| 亚洲国产色片| 白带黄色成豆腐渣| 五月玫瑰六月丁香| 麻豆av噜噜一区二区三区| 在线观看66精品国产| 97在线视频观看| 久久久久久久国产电影| 国产乱人视频| 一区二区三区免费毛片| 麻豆一二三区av精品| 黄片wwwwww| 老司机影院成人| 亚洲,欧美,日韩| 久久久久久久久大av| 最近2019中文字幕mv第一页| 亚洲经典国产精华液单| 偷拍熟女少妇极品色| 国产久久久一区二区三区| 欧美一区二区精品小视频在线| 精品免费久久久久久久清纯| 亚洲三级黄色毛片| 精品国产三级普通话版| 午夜激情欧美在线| 国产精品一区二区在线观看99 | 卡戴珊不雅视频在线播放| 国产成人精品一,二区| 日日啪夜夜撸| 好男人在线观看高清免费视频| 国产免费男女视频| 成年女人永久免费观看视频| 级片在线观看| 五月伊人婷婷丁香| 亚洲国产色片| 国产熟女欧美一区二区| 一级二级三级毛片免费看| 又爽又黄a免费视频| 国产极品天堂在线| 精品欧美国产一区二区三| 麻豆成人av视频| 日韩大片免费观看网站 | 国内少妇人妻偷人精品xxx网站| 成人午夜高清在线视频| 可以在线观看毛片的网站| 少妇人妻一区二区三区视频| 国产人妻一区二区三区在| 国内精品一区二区在线观看| 乱人视频在线观看| av黄色大香蕉| 精华霜和精华液先用哪个| 99在线视频只有这里精品首页| 伦精品一区二区三区| 亚洲自偷自拍三级| av线在线观看网站| 丝袜喷水一区| 婷婷色综合大香蕉| 非洲黑人性xxxx精品又粗又长| 女人久久www免费人成看片 | 岛国毛片在线播放| 18禁在线播放成人免费| 联通29元200g的流量卡| 七月丁香在线播放| 18禁动态无遮挡网站| 国产爱豆传媒在线观看| 国内精品宾馆在线| 欧美日韩综合久久久久久| 激情 狠狠 欧美| 日本三级黄在线观看| 日日啪夜夜撸| 免费观看的影片在线观看| 欧美激情国产日韩精品一区| 男女国产视频网站| 久久久a久久爽久久v久久| 美女大奶头视频| 国产真实乱freesex| 少妇高潮的动态图| 日本av手机在线免费观看| 亚洲在线观看片| 免费观看a级毛片全部| 简卡轻食公司| 小说图片视频综合网站| av视频在线观看入口| 亚洲av中文字字幕乱码综合| 国产精品av视频在线免费观看| 国产中年淑女户外野战色| 网址你懂的国产日韩在线| 欧美一区二区国产精品久久精品| 丝袜喷水一区| 日日撸夜夜添| 色尼玛亚洲综合影院| 亚洲乱码一区二区免费版| 99久国产av精品国产电影| 国产探花极品一区二区| 欧美性感艳星| 午夜免费男女啪啪视频观看| 有码 亚洲区| 亚洲图色成人| 国内揄拍国产精品人妻在线| 国产精品伦人一区二区| av在线观看视频网站免费| 国产老妇伦熟女老妇高清| 国产精品.久久久| 男女国产视频网站| 天堂av国产一区二区熟女人妻| 我的女老师完整版在线观看| 九九爱精品视频在线观看| 亚洲精品久久久久久婷婷小说 | 老司机影院毛片| 在线观看美女被高潮喷水网站| 黄色欧美视频在线观看| 草草在线视频免费看| 99热这里只有是精品在线观看| 麻豆久久精品国产亚洲av| 毛片一级片免费看久久久久| 内射极品少妇av片p| 一级毛片电影观看 | 久久婷婷人人爽人人干人人爱| 韩国av在线不卡| 国产免费福利视频在线观看| 亚洲精品影视一区二区三区av| 内射极品少妇av片p| 九九热线精品视视频播放| 天堂网av新在线| 久久99热这里只有精品18| 亚洲一区高清亚洲精品| 1000部很黄的大片| 国产精品熟女久久久久浪| 一个人看的www免费观看视频| 成人漫画全彩无遮挡| 欧美潮喷喷水| 天堂√8在线中文| 99久久成人亚洲精品观看| av免费观看日本| 午夜激情福利司机影院| 亚洲精品自拍成人| 亚洲欧美一区二区三区国产| 日本免费一区二区三区高清不卡| 中文乱码字字幕精品一区二区三区 | 中文亚洲av片在线观看爽| 欧美激情在线99| 欧美+日韩+精品| 丰满乱子伦码专区| 精品久久久久久久人妻蜜臀av| 亚洲精品色激情综合| 久久久久久久久久久丰满| 免费观看a级毛片全部| 麻豆精品久久久久久蜜桃| ponron亚洲| 男人的好看免费观看在线视频| 亚洲成色77777| 69人妻影院| 色5月婷婷丁香| 97在线视频观看| 国产探花在线观看一区二区| 少妇的逼好多水| 国产日韩欧美在线精品| 亚州av有码| 天堂影院成人在线观看| 国产成人免费观看mmmm| 亚洲国产精品国产精品| 午夜a级毛片| 极品教师在线视频| 少妇丰满av| 国产精品蜜桃在线观看| av国产免费在线观看| 国产精品国产三级国产专区5o | 成年av动漫网址| 国产真实伦视频高清在线观看| 少妇人妻精品综合一区二区| 国产极品天堂在线| 久久99热6这里只有精品| 中文字幕av成人在线电影| 日韩亚洲欧美综合| 麻豆久久精品国产亚洲av| 毛片女人毛片| 日本黄大片高清| 久久国内精品自在自线图片| 亚洲av日韩在线播放| 免费观看的影片在线观看| 九九在线视频观看精品| 亚洲欧美清纯卡通| 日本-黄色视频高清免费观看| 日韩高清综合在线| 亚洲国产高清在线一区二区三| 亚洲精品影视一区二区三区av| 国产精品.久久久| 亚洲aⅴ乱码一区二区在线播放| 国产免费男女视频| 搡老妇女老女人老熟妇| 亚洲欧美日韩东京热| 免费大片18禁| 黄色配什么色好看| 一个人观看的视频www高清免费观看| www.av在线官网国产| 免费大片18禁| 岛国毛片在线播放| videossex国产| 国产老妇女一区| 97热精品久久久久久| 国产黄片美女视频| 国产在视频线精品| 永久免费av网站大全| av女优亚洲男人天堂| 一区二区三区高清视频在线| 水蜜桃什么品种好| 免费看a级黄色片| 99热这里只有是精品在线观看| 亚洲真实伦在线观看| 国产精品国产三级国产专区5o | 又爽又黄a免费视频| 久久久久久久久大av| 国产亚洲av片在线观看秒播厂 | 亚洲av电影在线观看一区二区三区 | 最近的中文字幕免费完整| 日韩一本色道免费dvd| 国产美女午夜福利| 亚洲乱码一区二区免费版| 超碰97精品在线观看| 亚洲自拍偷在线| 又爽又黄无遮挡网站| 少妇人妻一区二区三区视频| 成年av动漫网址| 亚洲伊人久久精品综合 | 婷婷色综合大香蕉| 直男gayav资源| 亚洲怡红院男人天堂| 日韩欧美国产在线观看| 国产成人精品婷婷| 午夜视频国产福利| 一级毛片久久久久久久久女| 日韩欧美在线乱码| 99九九线精品视频在线观看视频| 久久鲁丝午夜福利片| 色播亚洲综合网| 网址你懂的国产日韩在线| av国产久精品久网站免费入址| 在线a可以看的网站| 97热精品久久久久久| 全区人妻精品视频| 亚洲国产色片| 人人妻人人澡欧美一区二区| 女的被弄到高潮叫床怎么办| 菩萨蛮人人尽说江南好唐韦庄 | 亚洲av成人精品一二三区| 99久久成人亚洲精品观看| eeuss影院久久| 色尼玛亚洲综合影院| 一本—道久久a久久精品蜜桃钙片 精品乱码久久久久久99久播 | 插阴视频在线观看视频| 三级国产精品欧美在线观看| 免费黄色在线免费观看| 亚洲成人精品中文字幕电影| 欧美成人午夜免费资源| 国产精品国产三级国产av玫瑰| 黄色欧美视频在线观看| 中文字幕熟女人妻在线| 91精品一卡2卡3卡4卡| 久久综合国产亚洲精品| 人人妻人人澡人人爽人人夜夜 | 国产真实乱freesex| 欧美又色又爽又黄视频| 中文字幕亚洲精品专区| 一本—道久久a久久精品蜜桃钙片 精品乱码久久久久久99久播 | 禁无遮挡网站| 91午夜精品亚洲一区二区三区| 秋霞在线观看毛片| 久久精品国产自在天天线| 国产在线一区二区三区精 | 亚洲图色成人| 亚洲av成人av| 久久久久免费精品人妻一区二区| 一二三四中文在线观看免费高清| 精品熟女少妇av免费看| 秋霞在线观看毛片| 午夜a级毛片| 丝袜喷水一区| 国产精品爽爽va在线观看网站| 熟妇人妻久久中文字幕3abv| 国产精品久久视频播放| 中文天堂在线官网| 国产精品伦人一区二区| av免费在线看不卡| 欧美潮喷喷水| 一夜夜www| h日本视频在线播放| 午夜免费激情av| 国内少妇人妻偷人精品xxx网站| 韩国高清视频一区二区三区| 久久精品久久久久久噜噜老黄 | 中文字幕熟女人妻在线| 国产精品.久久久| 国产亚洲av嫩草精品影院| 久久久久久九九精品二区国产| 青春草国产在线视频| 国产一区二区在线观看日韩| 国产成人a区在线观看| 久久久久久国产a免费观看| 搞女人的毛片| 最后的刺客免费高清国语| 午夜福利网站1000一区二区三区| 欧美3d第一页| 人人妻人人澡欧美一区二区| 晚上一个人看的免费电影| 美女大奶头视频| 精品人妻一区二区三区麻豆| 亚洲国产欧美人成| 成人高潮视频无遮挡免费网站| videossex国产| 日韩欧美 国产精品| 国产精品国产三级国产专区5o | 久久精品熟女亚洲av麻豆精品 | 一区二区三区乱码不卡18| 欧美一区二区精品小视频在线| 亚洲一区高清亚洲精品| 七月丁香在线播放| 18+在线观看网站| 丝袜美腿在线中文| 亚洲精品aⅴ在线观看| 女人被狂操c到高潮| 亚洲伊人久久精品综合 | 爱豆传媒免费全集在线观看| kizo精华| videossex国产| 日韩人妻高清精品专区| 国产91av在线免费观看| 亚洲自偷自拍三级| 特级一级黄色大片| 免费观看的影片在线观看| 国产极品天堂在线| 99久久成人亚洲精品观看| 亚洲国产欧美人成| 99久久九九国产精品国产免费| 国产精品嫩草影院av在线观看| 久久99蜜桃精品久久| 精品人妻一区二区三区麻豆| 狂野欧美激情性xxxx在线观看| 免费无遮挡裸体视频| 亚洲国产色片| 国产一区二区在线观看日韩| 亚洲三级黄色毛片| 91在线精品国自产拍蜜月| 国产午夜福利久久久久久| 桃色一区二区三区在线观看| av免费在线看不卡| 久久久久免费精品人妻一区二区| 97热精品久久久久久| 男人舔奶头视频| 精品99又大又爽又粗少妇毛片| 天堂√8在线中文| 亚洲最大成人中文| 亚洲av免费高清在线观看| 91aial.com中文字幕在线观看| 国产综合懂色| 乱人视频在线观看| 国产熟女欧美一区二区| 成年免费大片在线观看| 99热网站在线观看| 亚洲成av人片在线播放无| 嫩草影院入口| 欧美又色又爽又黄视频| 级片在线观看| 深爱激情五月婷婷| 高清午夜精品一区二区三区| 啦啦啦啦在线视频资源| 亚洲18禁久久av| 欧美+日韩+精品| 大香蕉97超碰在线| 欧美日韩在线观看h| 亚洲av成人精品一区久久| 一个人免费在线观看电影| 全区人妻精品视频| 久久久国产成人精品二区| 97超视频在线观看视频| 特级一级黄色大片| 老司机影院成人| 日韩中字成人| 99久久精品一区二区三区| 男女视频在线观看网站免费| 国内少妇人妻偷人精品xxx网站| 成年av动漫网址| 久久精品综合一区二区三区| 夫妻性生交免费视频一级片| 国产乱来视频区| 日韩制服骚丝袜av| 中国美白少妇内射xxxbb| 能在线免费看毛片的网站| 2021天堂中文幕一二区在线观| 久久人妻av系列| 国产黄色小视频在线观看| 麻豆久久精品国产亚洲av| 特大巨黑吊av在线直播| 少妇的逼好多水| h日本视频在线播放| 在线免费观看不下载黄p国产| 亚洲综合色惰| 高清视频免费观看一区二区 | 国产精品电影一区二区三区| 91久久精品国产一区二区成人| 日韩一本色道免费dvd| 国产乱人偷精品视频| 深爱激情五月婷婷| 人妻夜夜爽99麻豆av| 国产精品久久电影中文字幕| 日韩强制内射视频| 欧美三级亚洲精品| 亚洲国产成人一精品久久久| 成人特级av手机在线观看| 精品不卡国产一区二区三区| 色视频www国产| 黑人高潮一二区| 黄色一级大片看看| 99热6这里只有精品| 国产精品国产三级国产av玫瑰| 两性午夜刺激爽爽歪歪视频在线观看| 国产精品久久久久久精品电影小说 | 国产视频内射| 亚洲18禁久久av| 国产精品.久久久| 人妻系列 视频| 国产精品一区二区三区四区久久| 国产精品一区二区三区四区免费观看| 久99久视频精品免费| 精品一区二区免费观看| 伦精品一区二区三区| 成人av在线播放网站| 久久这里只有精品中国| av在线亚洲专区| 亚洲国产色片| 免费av毛片视频| 日韩国内少妇激情av| 51国产日韩欧美| 色吧在线观看| 不卡视频在线观看欧美| 国产麻豆成人av免费视频| 99久久中文字幕三级久久日本| 亚洲欧美日韩东京热| 午夜激情欧美在线| 爱豆传媒免费全集在线观看| 精品酒店卫生间| 建设人人有责人人尽责人人享有的 | 好男人在线观看高清免费视频| 亚洲精品自拍成人| 免费看日本二区| 高清日韩中文字幕在线| 熟妇人妻久久中文字幕3abv| 国产美女午夜福利| 一本—道久久a久久精品蜜桃钙片 精品乱码久久久久久99久播 | 嘟嘟电影网在线观看|