HLA新等位基因HLA-B*67：07測(cè)序分析及確認(rèn)*

王天菊 陳利萍 王小芳 王滿妮 齊珺

·血型與臨床·

HLA新等位基因HLA-B*67：07測(cè)序分析及確認(rèn)*

王天菊 陳利萍 王小芳 王滿妮 齊珺

目的 人類白細(xì)胞抗原B新等位基因核苷酸序列分析及確認(rèn)。 方法 采用序列特異性寡核苷酸探針技術(shù)（SSO）對(duì)2015年中國(guó)造血干細(xì)胞捐獻(xiàn)者資料庫(kù)（CMDP）入庫(kù)數(shù)據(jù)進(jìn)行HLA常規(guī)檢測(cè)，結(jié)果顯示有1個(gè)磁珠反應(yīng)異常，進(jìn)一步選擇多聚酶鏈反應(yīng)-測(cè)序（PCR-SBT）分型發(fā)現(xiàn)1個(gè)與HLA-B*67相關(guān)的有1個(gè)堿基不匹配的等位基因，選擇對(duì)應(yīng)的組特異性引物對(duì)該等位基因進(jìn)行2次分離式測(cè)序，確認(rèn)突變的等位基因和突變位點(diǎn)。 結(jié)果 發(fā)現(xiàn) 1 個(gè)與HLA-B*67：01：01序列相近的新等位基因，實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明在HLA-B*67：0：01第3 外顯子370位置G＞A，其突變?cè)斐蒆LA-B*67：01：01氨基酸序列中100位的氨基端由甘氨酸（Gly）變成絲氨酸（Ser）。 結(jié)論 本次實(shí)驗(yàn)確認(rèn)了1個(gè)新的HLA等位基因，2016年3月30日被世界衛(wèi)生組織HLA因子命名委員會(huì)正式命名為HLA-B*67：07。

人類白細(xì)胞抗原 測(cè)序 組序列特異性引物 新等位基因

人類白細(xì)胞抗原（human leukocyte antigen，HLA）是人類最復(fù)雜、最具有多態(tài)性的免疫遺傳系統(tǒng)，在自我識(shí)別和免疫應(yīng)答中發(fā)揮重要作用。自1958年首個(gè)HLA抗原被檢出至今，截至2016年7月更新的國(guó)際免疫遺傳IMGT/HLA 數(shù)據(jù)3.25版顯示，共檢出等位基因HLA-A 3 492種、HLA-B 4 358種、HLA-C 3 111種、HLA-DRB1 1 929種、HLA-DQB 940種。HLA在造血干細(xì)胞移植中具有重要意義，供者與受者HLA是否相合與移植后移植物抗宿主病的發(fā)生率和移植物的存活密切相關(guān)。近年來(lái)，隨著分子生物學(xué)檢測(cè)技術(shù)的進(jìn)步，新的檢測(cè)技術(shù)不斷應(yīng)用于HLA分型。隨著中國(guó)造血干細(xì)胞志愿捐獻(xiàn)者人數(shù)的增多，越來(lái)越多的HLA新基因被報(bào)道。對(duì)中國(guó)造血干細(xì)胞捐獻(xiàn)者資料庫(kù)樣本進(jìn)行HLA-A/B/DRB1位點(diǎn)常規(guī)檢測(cè)時(shí)，發(fā)現(xiàn)1個(gè)疑似新等位基因，經(jīng)確證實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證后將序列上傳到世界基因庫(kù)（http：//www.ncbi.nlm.nih.gov/Genbank Bankit）比對(duì)核準(zhǔn)，經(jīng)向世界衛(wèi)生組織（WHO）提交一系列信息后，序列2016年3月30號(hào)被HLA因子命名委員會(huì)正式命名為HLAB*67：07。

對(duì)象與方法

1 研究對(duì)象 先證者為中華骨髓庫(kù)陜西分庫(kù)造血干細(xì)胞志愿捐獻(xiàn)者，陜西籍，漢族，男性。對(duì)HLA-A、B、DRB1位點(diǎn)做測(cè)序基因分型時(shí)發(fā)現(xiàn)HLA-B位點(diǎn)與已知序列庫(kù)無(wú)匹配結(jié)果，與常見(jiàn)等位基因組合有1個(gè)堿基不匹配，進(jìn)而對(duì)該樣本進(jìn)一步分析。

2 主要儀器及試劑

2.1 主要儀器：生物安全柜（型號(hào)BSC-10001，蘇州安泰空氣技術(shù)有限公司）；核酸檢測(cè)儀（型號(hào)GeneQuant pro，Biochrom公司）； PCR擴(kuò)增儀（型號(hào)SENSOQUEST，圣歐國(guó)際有限公司）；流式微磁珠分析儀（型號(hào)IS-200，Luminex公司）；DNA測(cè)序分析儀（型號(hào)3730xl，ABI公司）。

2.2 試劑：北京天根血液基因組DNA提取試劑盒（批號(hào)DP318，北京TIANGEN）；LABTypeTM RSSOH1A/1B/2B1試劑盒（批號(hào)：009，009，009，Luminex公司）；SeCore? HLA-SBT分型試劑盒（批號(hào)1249290，1249289，1275334，life公司）。

3 方法

3.1 標(biāo)本采集和基因組DNA提?。翰杉驹妇璜I(xiàn)者外周靜脈血5 ml（EDTA抗凝），采用北京天根血液基因組DNA提取試劑盒，嚴(yán)格按照試劑操作說(shuō)明提取血液基因組DNA，利用GeneQuant核酸蛋白測(cè)定儀測(cè)定所提取DNA的濃度和純度，此標(biāo)本的濃度為56 ng/μl，純度A260 nm/280 nm為1.82。

3.2 PCR-SSO方法檢測(cè)：選擇基于Luminex平臺(tái)的聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)-序列特異性寡核苷酸探針（polymerase chain reaction-sequence specific oligonucleotide probes，PCR-SSO）方法，采用LABTypeTM RSSOH1A/1B/2B1試劑盒進(jìn)行樣本的HLA-A、B、DRB1基因分型。將提取的DNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增，擴(kuò)增產(chǎn)物與標(biāo)記有熒光的特異性探針磁珠雜交后，用Luminex IS-200流式微磁珠分析儀檢測(cè)，結(jié)果判讀應(yīng)用與試劑盒對(duì)應(yīng)的HLAFusion 2.0軟件判讀，根據(jù)DNA與每個(gè)磁珠探針的反應(yīng)格局，自動(dòng)給出HLA-A、B、DRB1各基因座位的分型結(jié)果。

3.3 PCR產(chǎn)物直接測(cè)序（sequence-based typing，SBT）：采用SeCore? HLA-SBT分型試劑盒對(duì)該樣本HLA-A、B、DRB1位點(diǎn)進(jìn)行常規(guī)高分辨的HLA基因分型。對(duì)提取的DNA進(jìn)行HLA-A、HLA-B、HLA-DRB1位點(diǎn)的PCR擴(kuò)增，擴(kuò)增產(chǎn)物用ExoⅠ/SAP酶純化后，對(duì)HLA-A、HLA-B進(jìn)行第2、3、4外顯子正反向測(cè)序反應(yīng)和對(duì)HLA-DRB1進(jìn)行第2外顯子正反向及Condon86正向測(cè)序反應(yīng)，測(cè)序產(chǎn)物再經(jīng)過(guò)乙醇/醋酸鈉沉淀，95℃熱變性迅速冷卻后的產(chǎn)物用ABI 3737xl測(cè)序儀進(jìn)行毛細(xì)管電泳，將電泳序列導(dǎo)入uTYPE?分析軟件進(jìn)行分析后，發(fā)現(xiàn)HLA-B位點(diǎn)無(wú)法生成確切的結(jié)果，與常見(jiàn)等位基因組合存在不可修改的不匹配堿基峰，所以進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)確定是否有堿基突變。

3.4 組特異性DNA序列分析：根據(jù)分析軟件提示結(jié)果，進(jìn)一步選擇組特異性引物Z52、Z76，對(duì)PCR擴(kuò)增純化后的產(chǎn)物進(jìn)行2次分離式測(cè)序反應(yīng)，將GSSP結(jié)果與上一步測(cè)序反應(yīng)的序列共同導(dǎo)入uTYPE?軟件進(jìn)行分析。

結(jié) 果

1 樣本PCR-SSO分型結(jié)果 該樣本A、DRB1位點(diǎn)的分型結(jié)果為：HLA-A*02：01：01G，33：03：01G；HLA-DRB1*01：01：01G，12：01：01G；B位點(diǎn)顯示586號(hào)磁珠反應(yīng)異常，從結(jié)果來(lái)看586號(hào)磁珠應(yīng)該為陰性（見(jiàn)圖1黑色箭頭標(biāo)識(shí)），而分析軟件顯示若結(jié)果是B*58：01：01，67：01：01組合的話，586號(hào)磁珠是假陰性。

2 PCR-SBT分型結(jié)果 該樣本A、DRB1位點(diǎn)的分型結(jié)果為HLA-A*02：01，33：03；HLADRB1*01：01，12：01G；B位點(diǎn)的分型結(jié)果相對(duì)于HLA-B*58：01，67：01在第3外顯子370位堿基有1個(gè)堿基不匹配，測(cè)序結(jié)果顯示結(jié)果有2種組合HLA-B*38：26，58：64與HLA-B*58：01，67：01在370位堿基應(yīng)該為G，但該樣本在這個(gè)位置為R（A/G），見(jiàn)圖2。有可能該位置有突變，應(yīng)進(jìn)行GSSP測(cè)序。

3 組特異性引物對(duì)該樣本HLA-B序列的進(jìn)一步確認(rèn) 根據(jù)軟件提示，用組特異性引物Z52、Z76對(duì)樣本B位點(diǎn)雙鏈擴(kuò)增結(jié)果進(jìn)行分離式測(cè)序，Z52是HLA-B*58：01的特異性引物，證明在370位堿基位置HLA-B*58：01為G，見(jiàn)圖3。因此HLAB*67：01在370的位置為A，但是根據(jù)已公布的B*67：01序列在此位置應(yīng)為G，所以進(jìn)一步確定此位置的堿基發(fā)生了G＞A突變。

4 新等位基因HLA-B*67：07核苷酸和氨基酸序列比對(duì) B位點(diǎn)的測(cè)序反應(yīng)是對(duì)2、3、4外顯子的正反向測(cè)序，測(cè)序長(zhǎng)度（bp）分別為270、276、276，未知基因與同源性最高的等位基因HLAB*67：01：01相比，第3外顯子編碼序列發(fā)生370位G＞A的突變，見(jiàn)圖4；兩者的氨基酸序列比對(duì)見(jiàn)圖5，第3外顯子第100位密碼子由GGC＞AGC，氨基酸由甘氨酸（Gly）變成絲氨酸（Ser）。將所檢測(cè)到的2、3、4外顯子序列提交給GenBank，獲得登錄號(hào)為KT285900。將新等位基因相關(guān)數(shù)據(jù)上報(bào)給WHO HLA因子命名委員會(huì)，被正式命名為HLA-B*67：07。

圖1 HLA-B位點(diǎn) PCR-SSO探針?lè)磻?yīng)格局

圖2 先證者HLA-B位點(diǎn)雜合測(cè)序結(jié)果

圖3 先證者HLA-B位點(diǎn)GSSP測(cè)序結(jié)果

圖4 HLA-B*67：01：01與HLA-B*67：07核苷酸序列比對(duì)圖

圖5 HLA-B*67：01：01與HLA-B*67：07氨基酸序列比對(duì)圖

討 論

HLA的編碼基因位于人類第6號(hào)染色體短臂6P21.31區(qū)域，全長(zhǎng)3600 kb，HLA按編碼分子特性的不同分為HLA-I、II、III類基因，HLA-B屬于HLA-I類基因，HLA-I類基因以糖蛋白的形式表達(dá)在有核細(xì)胞細(xì)胞膜表面。HLA-I類分子重鏈（α鏈）胞外段有3個(gè)結(jié)構(gòu)域（α1、α2、α3），遠(yuǎn)膜端的2個(gè)結(jié)構(gòu)域α1和α2構(gòu)成抗原結(jié)合槽，是抗原肽識(shí)別的部位；α3和β2-m屬于免疫球蛋白超家族（IgSF）結(jié)構(gòu)域。已經(jīng)證實(shí)HLA-I類基因的第2、3、4 外顯子分別編碼α鏈的α1、α2、α3結(jié)構(gòu)域，本例確認(rèn)的新等位基因是在第3外顯子發(fā)生1個(gè)堿基突變，并導(dǎo)致相應(yīng)的氨基酸發(fā)生了改變，α2結(jié)構(gòu)域氨基酸的替換可能會(huì)影響抗原結(jié)合的特異性。

HLA分型技術(shù)應(yīng)用于臨床檢測(cè)的主要有PCRSSP、PCR-SSO、DNA測(cè)序和基因芯片等。PCRSSP、PCR-SSO基于已知序列設(shè)計(jì)引物，依據(jù)指定反應(yīng)格局由軟件分析導(dǎo)出結(jié)果，針對(duì)罕見(jiàn)等位基因分析時(shí)，有可能提示假陽(yáng)性或假陰性。在臨床工作中，若出現(xiàn)反應(yīng)格局異常或出現(xiàn)異常的假陽(yáng)性或假陰性提示時(shí)，應(yīng)采用不同的方法驗(yàn)證結(jié)果，一般選擇測(cè)序分析，保證結(jié)果的真實(shí)性和準(zhǔn)確性。本實(shí)驗(yàn)檢測(cè)采用流式磁珠反向SSO的方法，其原理是對(duì)檢測(cè)樣本利用標(biāo)記生物素的引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增后，將擴(kuò)增產(chǎn)物與磁珠雜交，磁珠上標(biāo)記有2種不同比例的熒光素，不同的磁珠上標(biāo)記不同的探針，熒光染色后檢測(cè)磁珠的熒光強(qiáng)度和DNA上標(biāo)記的熒光強(qiáng)度，通過(guò)對(duì)所有磁珠信號(hào)的組合，利用HLAFusion 2.0軟件進(jìn)行識(shí)讀和判斷。該樣本在最初的PCR-SSO檢測(cè)基因分型時(shí)發(fā)現(xiàn)HLA-B分型中顯示586號(hào)探針?lè)磻?yīng)格局異常，真陰性反應(yīng)軟件提示為假陰性，因此懷疑有新基因存在的可能性，進(jìn)一步用DNA測(cè)序?qū)υ摌颖具M(jìn)行檢測(cè)。SBT能夠直接從堿基水平得到HLA的等位基因序列，從而得到高分辨結(jié)果，但是對(duì)于新等位基因的檢測(cè)，若2條等位基因?yàn)榧兒献?，SBT可以檢測(cè)出突變位置的等位基因；但是對(duì)于雜合子，SBT是對(duì)DNA雙鏈的雙向測(cè)序，無(wú)法確定突變位于哪條DNA鏈上。為準(zhǔn)確區(qū)分突變位置，采用組特異性引物測(cè)序的方法，選取Z52、Z76兩個(gè)特異性引物進(jìn)行單鏈測(cè)序，確定了新等位基因HLA-B*67：07。此次報(bào)道的HLA-B*67：07先證者為陜西籍漢族，在2010年本實(shí)驗(yàn)室開展對(duì)HLA進(jìn)行SBT檢測(cè)后，在對(duì)15 000份造血干細(xì)胞捐獻(xiàn)者的檢測(cè)中未發(fā)現(xiàn)該基因，所以推測(cè)HLA-B*67：07為罕見(jiàn)型，此等位基因的頻率還需進(jìn)一步的數(shù)據(jù)研究。

目前國(guó)際上已檢出HLA-B*67等位基因9個(gè)（IPD-IMGT/HLA Release 3.24.0，2016-04-15），包括HLA-B*67：01：01、B*67：01：02、B*67：01：03、B*67：02、B*67：03、B*67：04、B*67：05、B*67：06、B*67：07。根據(jù)中國(guó)常見(jiàn)及確認(rèn)的HLA等位基因表（CWD）（2.2版），HLA-B*67：01的頻率為0.717 78，HLA-B*67：03的頻率為0.000 42，其他等位基因均罕見(jiàn)。HLA在不同種族和地域有很強(qiáng)的差異性。HLA-B*67：01在北方漢族的基因頻率為0.87%[1]，HLA-B*67：01在江蘇漢族人群中的頻率為0.70%[2]，根據(jù)黑愛(ài)蓮報(bào)道中華骨髓庫(kù)造血干細(xì)胞捐獻(xiàn)志愿者HLA-B*67：01的頻率為0.28%[3]，HLA-B*67在安徽漢族的基因頻率為0.73%[4]， 福 建 為 0.41%[5]， 廣 東 為 0.62%[6]， 湖 北漢族為0.64%[7]，吉林漢族為1.15%[8]，云南地區(qū)為0.21%[9]。李翠瑩等對(duì)中華骨髓庫(kù)陜西分庫(kù)10 122名漢族造血干細(xì)胞捐獻(xiàn)者HLA等位基因分析后得出HLA-B*67的頻率為0.94%[10]。HLA抗原具有高度遺傳多態(tài)性，主要表現(xiàn)在同一基因座位等位基因的高度多態(tài)性，在機(jī)體的免疫應(yīng)答啟動(dòng)和免疫調(diào)節(jié)中發(fā)揮重要作用，HLA與疾病的相關(guān)性研究有很多報(bào)道。HLA-B*67頻率相對(duì)較低，與疾病相關(guān)的報(bào)道較少。對(duì)多發(fā)性大動(dòng)脈炎的研究中發(fā)現(xiàn)HLA-B*67：01是疾病的易感基因，在 Terao等的研究中發(fā)現(xiàn)，多發(fā)性大動(dòng)脈炎多發(fā)于年輕女性，環(huán)境和基因因素共同影響疾病的發(fā)生和發(fā)展，除之前已發(fā)現(xiàn)的HLA-B*52：01是多發(fā)性大動(dòng)脈炎的易感因素，相對(duì)頻率較低的HLA-B*67：01也是易感因素[11，12]。在對(duì)日本人群中HLA-I類等位基因與HIV-1感染者疾病進(jìn)展相關(guān)性研究中發(fā)現(xiàn)，HLA-B*67：01，B*52：01和C*12：02三個(gè)等位基因與低病毒載量和高的CD4 T細(xì)胞數(shù)量相關(guān)[13]。

從1993年HLA-B*67：01：01和1995年HLAB*67：01：02被報(bào)道以來(lái)，HLA-B*67：01：03、HLA-B*67：02、HLA-B*67：03、HLAB*67：04、HLA-B*67：05、HLA-B*67：06、HLA-B*67：07分別在2013、2000、2010、2013、2014年及2016年發(fā)現(xiàn)。隨著基因分型技術(shù)的廣泛應(yīng)用和測(cè)序技術(shù)的發(fā)展、中華骨髓庫(kù)的壯大、造血干細(xì)胞志愿捐獻(xiàn)者的增多，越來(lái)越多的新基因不斷被發(fā)現(xiàn)和報(bào)道。新基因的確認(rèn)和命名不斷豐富了HLA等位基因數(shù)據(jù)庫(kù)，為造血干細(xì)胞移植提供數(shù)據(jù)支持，能更準(zhǔn)確地尋找最適合的供者，減少急性排斥反應(yīng)的發(fā)生和對(duì)抗排斥反應(yīng)藥物的依賴；為進(jìn)一步研究HLA與疾病的相關(guān)性和群體遺傳學(xué)研究提供基本數(shù)據(jù)。

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Objective To identify a novel HLA-B allele in Chinese hematopoietic stem cell donors．Methods A rare HLA-B allele was initially detected by Luminex PCR-SSO typing，then the sample was sequenced by sequence-based typing （SBT） and the group-specific sequencing primer（GSSP） to confirm the mutation allele and locus. Results The sequence of the novel allele was different from that of B*67：01：01 at the position 370（G＞A） in exon 3，which results in an amino acid change from Gly to Ser at codon 100. Conclusion This allele is a new HLA-B allele which has been designated as HLA-B*67：07 by the World Health Organization（WHO） HLA Nomenclature Committee.

Human leukocyte antigen Sequence based typing Group-specific sequencing primer Novel allele

R392.4 R457.1

A

1671-2587（2017）05-0482-05

A Novel HLA-B*67：07 Allele was Identified by Polymerase Chain Reaction-Sequence Based Typing WANG Tianju，CHEN Li-ping，WANG Xiao-fang，et al. Shaanxi Blood Center，Xi’an 710061

10.3969/j.issn.1671-2587.2017.05.000

*本課題受中國(guó)造血干細(xì)胞捐獻(xiàn)者資料庫(kù)（CMDP）資助

710061 西安，陜西省血液中心

王天菊（1984–），女，山西臨汾人，主管技師，碩士，主要從事HLA分型確認(rèn)工作，（Tel）15353557936（E-mail）wangtianju2007@163.com。

齊珺，（Tel）029-85253575（E-mail）qijun0802@163.com。

2017-01-30）

（本文編輯：潘健）