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    血型分子分型技術(shù)的進(jìn)展和應(yīng)用

    2017-11-16 06:35:55趙桐茂
    臨床輸血與檢驗(yàn) 2017年5期
    關(guān)鍵詞:血型分型抗原

    趙桐茂

    血型分子分型技術(shù)的進(jìn)展和應(yīng)用

    趙桐茂

    血型基因分型 血型基因組學(xué) 分子生物學(xué)技術(shù)

    1900年人類紅細(xì)胞血型被發(fā)現(xiàn),開啟了免疫學(xué)的一個(gè)分支免疫血液學(xué),使用經(jīng)典的血清學(xué)方法檢測血型。20世紀(jì)下半期,隨著基因研究和分子生物學(xué)技術(shù)的快速發(fā)展,出現(xiàn)了分子免疫血液學(xué),在分子水平研究血型抗原和血型基因的分子結(jié)構(gòu)。21世紀(jì)初整個(gè)生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域進(jìn)入了后基因組時(shí)代,一門新的血型基因組學(xué)(Blood Group Genomics)學(xué)科應(yīng)運(yùn)而生,建立了以DNA為基礎(chǔ)的血型分子分型技術(shù)。雖然紅細(xì)胞凝集技術(shù)可以很好地檢測常見血型抗原,但是對于鑒定比較復(fù)雜的抗原變異體,單獨(dú)使用血清學(xué)方法能力有限,為此需要分子生物學(xué)技術(shù)作為一個(gè)輔助工具。本綜述介紹血型分子分型技術(shù)最新進(jìn)展及其在臨床輸血中的應(yīng)用,其中包括一些分子遺傳學(xué)和血型基因多態(tài)性的基礎(chǔ)知識(shí)。

    1 分子遺傳學(xué)基礎(chǔ)

    1.1 DNA 細(xì)胞是具有生命功能的基本單位。真核細(xì)胞含有細(xì)胞核和細(xì)胞器,細(xì)胞核內(nèi)的DNA與組蛋白結(jié)合成染色體。DNA是脫氧核糖核酸的簡稱,是染色體的主要化學(xué)成分,同時(shí)也是組成遺傳密碼的物質(zhì)。DNA的化學(xué)成份是磷酸、脫氧核糖和鹼基。1個(gè)磷酸分子、1個(gè)脫氧核糖和1個(gè)鹼基組成1個(gè)單核苷酸,單核苷酸是構(gòu)建DNA分子的基本單位??偣灿邢汆堰剩ˋ)、鳥嘌呤(G)、胞嘧啶(C)和胸腺嘧啶(T)等4種堿基。核苷酸通過三磷酸根互相連接形成單股多聚核苷酸鏈。單股DNA的一端稱為5'端,另一端稱為3'端,兩端以外有不同的DNA序列。DNA分子是由2條單核苷酸鏈以互補(bǔ)配對原則所構(gòu)成的雙螺旋結(jié)構(gòu),1條單鏈的5'端對應(yīng)另一條單鏈的3'端。2條DNA鏈中的對應(yīng)堿基A-T以雙氫鍵形式連接,C-G以三氫鍵形式連接。

    1.2 基因結(jié)構(gòu) 人類基因一般可以分為4個(gè)區(qū)域:①轉(zhuǎn)錄區(qū):該區(qū)域包含外顯子與內(nèi)含子,其兩側(cè)被稱為側(cè)翼序列,分別用5'UTR 和3'UTR表示;②前導(dǎo)區(qū):位于基因編碼區(qū)上游,相當(dāng)于RNA的5'末端非編碼區(qū)(非翻譯區(qū));③尾部區(qū):位于RNA的3'編碼區(qū)下游,相當(dāng)于末端非編碼區(qū);④調(diào)控區(qū):位于基因編碼區(qū)域兩側(cè),含有啟動(dòng)子和增強(qiáng)子等基因調(diào)控序列(圖1)。 啟動(dòng)子包括某些保守序列,能促進(jìn)轉(zhuǎn)錄過程。真核基因轉(zhuǎn)錄起始點(diǎn)的上游或下游一般都有增強(qiáng)子,不能啟動(dòng)基因轉(zhuǎn)錄,但有增強(qiáng)轉(zhuǎn)錄的功能。不同基因的大小差異甚大,比如LW血型基因跨度僅2 600堿(bp),而編碼S抗原的GYPB基因全長58 000bp,該基因含有較長的內(nèi)含子序列,實(shí)際編碼序列僅為276bp,僅占全部序列的0.5%?;蛑械木幋a片段又稱為外顯子,其DNA序列決定編碼產(chǎn)生的氨基酸多肽序列。外顯子被非編碼的內(nèi)含子序列隔離開。外顯子和內(nèi)含子接頭區(qū)都有一段高度保守序列,內(nèi)含子5'端大多數(shù)是gt開始,3'端大多是ag結(jié)束,稱為gt-ag法則,是普遍存在于真核基因中RNA剪接的識(shí)別信號(hào)。

    1.3 從基因到蛋白質(zhì) 從基因到蛋白質(zhì)遺傳信息傳遞的第1步是DNA被轉(zhuǎn)錄為mRNA?;蜣D(zhuǎn)錄在細(xì)胞核內(nèi)進(jìn)行,其中轉(zhuǎn)移RNA(tRNA)的合成發(fā)生在核仁,mRNA的的合成在核質(zhì)中進(jìn)行。轉(zhuǎn)錄過程首先是以DNA的1條鏈為模板,按照堿基互補(bǔ)配對原則轉(zhuǎn)錄成前mRNA。然后通過剪接加工,內(nèi)含子片段被去除,外顯子片段連接在一起產(chǎn)生mRNA。mRNA只含有外顯子順序,保留了編碼序列的連續(xù)性(圖1)。

    圖1 基因結(jié)構(gòu)和基因轉(zhuǎn)錄示意圖

    啟動(dòng)子區(qū)屬于非編碼區(qū),含有多種控制基因轉(zhuǎn)錄的轉(zhuǎn)錄因子,如Ets-2、SP1、TATA盒等。異質(zhì)核RNA(hnRNA)又稱為前mRNA,是RNA轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物。一旦開始轉(zhuǎn)錄,hnRNA被剪接以去除內(nèi)含子側(cè)翼部分gt ... ag的非編碼序列,留下只有外顯子的編碼序列,因此mRNA核糖核酸序列中含有正確的閱讀框。從轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)開始,三聯(lián)密碼子通過核糖體機(jī)制翻譯成多肽。按照慣例第1個(gè)核苷酸(+1)密碼子AUG翻譯成第1個(gè)氨基酸甲硫氨酸(Met),但是基因最終產(chǎn)物可以在細(xì)胞表達(dá)過程中被切割,因此成熟蛋白質(zhì)的第一氨基酸可以不是甲硫氨酸。在轉(zhuǎn)錄中遇到UGA,UAG,UAA等終止密碼子時(shí)轉(zhuǎn)錄將終止,不編碼任何氨基酸,一般用*號(hào)表示。SNP的位置可以在啟動(dòng)子區(qū)、外顯子和內(nèi)含子等區(qū)域,可以有1個(gè)或多個(gè)。

    1.4 基因表達(dá)調(diào)控 基因表達(dá)受到轉(zhuǎn)錄起始點(diǎn)上游的啟動(dòng)子DNA序列的調(diào)控。啟動(dòng)子可以延伸至上游1千多個(gè)堿基,其他影響轉(zhuǎn)錄的調(diào)節(jié)因子序列可以在更遠(yuǎn)的位置上。位于啟動(dòng)子區(qū)域的TATA盒存在于大多數(shù)基因中,其功能是將RNA聚合酶定位于適當(dāng)位置以起始轉(zhuǎn)錄。啟動(dòng)子區(qū)域的突變有可能導(dǎo)致失去起始轉(zhuǎn)錄能力,結(jié)果無轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物。如Duffy血型基因啟動(dòng)子TATA盒內(nèi)序列突變,導(dǎo)致不能產(chǎn)生Duffy血型抗原蛋白。

    1.5 等位基因和SNP 在同1個(gè)遺傳位點(diǎn)上,由于基因突變產(chǎn)生的變異體被稱為等位基因,由此產(chǎn)生遺傳多態(tài)性。單核苷酸取代產(chǎn)生的多態(tài)性簡稱SNP(Single Nucleotide Polymorphism,SNP),是最常見的基因突變。如果單核苷酸取代沒有改變所編碼的氨基酸,稱為沉默取代;改變所編碼的氨基酸稱為錯(cuò)義取代;如果產(chǎn)生終止信號(hào),稱為無義取代。單核苷酸的缺失或插入也可以產(chǎn)生新的DNA序列,或產(chǎn)生終止密碼(圖2)。

    圖2 產(chǎn)生單核苷酸多態(tài)性示意圖

    1.6 其他基因突變 由于DNA分子中堿基對的改變、DNA片段增添或缺失、基因轉(zhuǎn)換和基因重組等機(jī)制引起的基因結(jié)構(gòu)的改變,可以統(tǒng)稱為基因突變,一些常見的基因變異機(jī)制見圖3。基因突變通常發(fā)生在DNA復(fù)制時(shí)期,即細(xì)胞分裂間期,包括有絲分裂間期和減數(shù)分裂間期。在進(jìn)化中,一些基因序列由于突變而不能產(chǎn)生相應(yīng)的蛋白質(zhì),這些無功能的基因被稱為假基因。

    2 血型多態(tài)性分子基礎(chǔ) 目前被國際輸血協(xié)會(huì)(ISBT)認(rèn)可的紅細(xì)胞血型抗原總數(shù)為346個(gè),其中308個(gè)分屬36個(gè)血型系統(tǒng),其余38個(gè)抗原尚未被歸類。幾乎所有具有臨床意義的血型系統(tǒng)的分子基礎(chǔ)已被闡明,并已開發(fā)出相應(yīng)的分子檢測技術(shù)[1]。根據(jù)美國國家生物技術(shù)中心的血型基因突變數(shù)據(jù)庫(Blood Group antigen gene Mutation Database,BGMUT)統(tǒng)計(jì),至2017年4月已檢測出45個(gè)血型基因,共含有1 802個(gè)等位基因[2]。

    圖3 常見基因變異示意圖

    2.1 多態(tài)性產(chǎn)生機(jī)制 36個(gè)血型系統(tǒng)遺傳多態(tài)性的產(chǎn)生機(jī)制大致可以分為10種類型[3],在表1中用數(shù)字1~10表示。數(shù)字1代表最常見的單核苷酸取代產(chǎn)生的 SNP,可以發(fā)生在單個(gè)外顯子、多個(gè)外顯子、內(nèi)含子以及基因調(diào)節(jié)區(qū)域。外顯子中發(fā)生的SNP,可以產(chǎn)生同義突變、錯(cuò)義突變和無義突變等3種結(jié)果。如編碼紅細(xì)胞Lua和Lub、Aua和Aub、K1和K2、Jka和Jkb、Dia和Dib,以及Doa和Dob等所謂對偶抗原的等位基因,都是由于單個(gè)堿基取代而產(chǎn)生。數(shù)字2 代表缺失,最典型的例子是白種人中RhD陰性個(gè)體缺失整個(gè)RHD基因。數(shù)字3表示存在插入1個(gè)或多個(gè)核苷酸堿基。如黑人中,RHD基因內(nèi)含子3和外顯子4之間有1段37bp的插入片段,導(dǎo)致產(chǎn)生RhD陰性表型。數(shù)字4代表基因重復(fù)作用,如C4A和C4B基因之間的不等交換,使1條單體型帶有重復(fù)的C4A基因片段。數(shù)字5代表基因重排,如Gerbich血型基因含有的4個(gè)外顯子,通過重排產(chǎn)生新的基因型和新的表型。數(shù)字6表示內(nèi)含子SNP造成信息RNA的GT和AG剪接位點(diǎn)突變,不能產(chǎn)生正常的多肽分子。在MMS和Rh血型系統(tǒng)中常見的基因重組和雜交基因用數(shù)字7表示。數(shù)字8表示基因轉(zhuǎn)換作用;數(shù)字9代表不等重組作用;由于轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物不同產(chǎn)生的多態(tài)性用數(shù)字10表示。

    表1 紅細(xì)胞血型基因多態(tài)性機(jī)制

    2.2 無效型表型的遺傳型 無效型個(gè)體的紅細(xì)胞表面不表達(dá)相應(yīng)抗原,如果接受輸血通常會(huì)產(chǎn)生抗體。無效型個(gè)體的群體頻率較低,為滿足這類群體的輸血,需要預(yù)先篩選無效型供者。由于相應(yīng)抗體來源一般有限,所以多采用血型分子分型方法。產(chǎn)生無效型的機(jī)制包括:①轉(zhuǎn)錄突變。如在表型Fy(a-b-)的黑人中,由于紅細(xì)胞轉(zhuǎn)錄因子GATA中-46位置上T>C突變,改變增強(qiáng)子GATA結(jié)合位點(diǎn),結(jié)果不能產(chǎn)生Duffy 糖蛋白;②表型S-s-、Gy(a-)、Dr(a-)等缺失型的產(chǎn)生,是由于轉(zhuǎn)錄過程中剪接位點(diǎn)核苷酸突變,使部分或全部外顯子被跳過;③由于堿基缺失、插入或取代作用,導(dǎo)致閱讀框架移位而產(chǎn)生終止信號(hào),不能產(chǎn)生完整的蛋白質(zhì)。如ABO血型中的O基因,由于外顯子6中261位置上單核苷酸缺失,導(dǎo)致產(chǎn)生終止信號(hào),不能產(chǎn)生完整的ABO轉(zhuǎn)移酶;④表型Rhnull、Ko、McLeod是由于核苷酸錯(cuò)意突變而改變了氨基酸序列;⑤ 表型Co(a-b-)是由于錯(cuò)意突變而降低蛋白質(zhì)的表達(dá);⑥Rh血型中的RhD缺失型是由于基因交換或基因轉(zhuǎn)換而產(chǎn)生;⑦Kell和Ge抗原弱表達(dá)涉及蛋白相互作用,他們分別缺少Kx和4.1蛋白;⑧ 由于修飾基因的作用,產(chǎn)生Lu(a-b-)、Jk(a-b-)等表型。

    3 血型分子分型技術(shù)

    3.1 聚合酶鏈反應(yīng) 聚合酶鏈反應(yīng) (Polymerase Chain Reaction,PCR)是在體外大量擴(kuò)增DNA片段的快速方法。PCR需要下列材料:①耐熱的DNA聚合酶,在高溫時(shí)不被破壞。最常用的是Taq聚合酶;②純化的DNA樣板;③4種三磷酸堿基脫氧核苷酸 (dATP、dCTP、dGTP、dTTP),它們是合成DNA的原料;④人工合成的寡核苷酸PCR引物。PCR擴(kuò)增需要使用1對引物,它們連接在被復(fù)制的DNA的兩側(cè),與其方向相反的1股DNA雜交,因此2股DNA可以同時(shí)被復(fù)制。在5'端的引物,被稱為正向引物,或編碼引物;在3'端的引物,被稱為反向引物,或非編碼引物。引物序列必須與它們的靶序列完全互補(bǔ)(圖4)。

    PCR反應(yīng)一般需要4個(gè)步驟:①DNA變性。DNA被加熱到94℃ ~ 96℃,變性產(chǎn)生單股DNA樣板;②引物退火。根據(jù)引物的變性溫度Tm,降低反應(yīng)溫度,使引物與其序列匹配的DNA特異性地結(jié)合;③DNA的延伸。在72℃左右合成新的DNA;④然后循環(huán)重復(fù)①~③程序,一般進(jìn)行30~40個(gè)循環(huán),可以將1個(gè)DNA片段擴(kuò)增為上百萬個(gè)拷貝。

    圖4 寡核苷酸引物設(shè)計(jì)示意圖

    3.2 PCR-SSP技術(shù) 采用序列特異性引物(Sequence Specific Primer,SSP)進(jìn)行PCR擴(kuò)增。SSP的3’端具有獨(dú)一無二的序列,在退火時(shí)只能與某特定等位基因結(jié)合,因此能夠特異性地?cái)U(kuò)增該基因片段。檢測PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的方法包括:直接凝膠電泳、限制性內(nèi)切酶水解后凝膠電泳、酶聯(lián)免疫吸附等。使用實(shí)時(shí) (real time)PCR擴(kuò)增儀,結(jié)合使用熒光標(biāo)記的探針,可以實(shí)時(shí)記錄PCR反應(yīng)過程中熒光強(qiáng)度的變化,根據(jù)熔解溫度曲線可以檢測特定的等位基因,此法又稱為TaqMan分析,具有敏感度高、可自動(dòng)記錄分析結(jié)果等特點(diǎn)。目前已報(bào)告的血型基因分型方法多以PCR-SSP為基礎(chǔ),它屬于低至中等通量檢測技術(shù)。根據(jù)PCR引物的設(shè)計(jì)、反應(yīng)溫度、聚合酶的性質(zhì)、產(chǎn)品的檢測方法、擴(kuò)增儀的類型,有多種檢測方法(表2)[4-7]。

    3.3 PCR-SSOP和基因芯片技術(shù) 基因芯片又稱為DNA 芯片、寡核苷酸陣列、雜交陣列等,是基于核酸鏈之間分子雜交的一種技術(shù)。該方法的第1步是使用PCR擴(kuò)增某段待檢基因片段,然后通過與序列特異性寡核苷酸探針(Sequence Specific Oligonucleotide Probes,SSOP)的雜交來鑒定相應(yīng)基因,這個(gè)技術(shù)又稱為PCR-SSOP。雜交反應(yīng)可以在尼龍薄膜、玻璃或塑料片等固體支持物上進(jìn)行。探針用熒光標(biāo)記,通過化學(xué)顯色或熒光信號(hào)檢測顯示出雜交結(jié)果。在芯片表面能夠固定數(shù)千個(gè)寡核苷酸探針,對多個(gè)待測基因進(jìn)行檢測。在Luminex 流式熒光技術(shù)中,SSOP探針和數(shù)百種微球偶聯(lián),1次反應(yīng)可同時(shí)鑒定100多個(gè)等位基因。

    3.4 DNA測序技術(shù) 測序技術(shù)可以提供更精確的DNA堿基序列信息,基因檢測的金標(biāo)準(zhǔn)。在以上介紹的PCR-SSP和PCR-SSOP技術(shù)中,需要知道突變基因的DNA序列,才可以制備相應(yīng)的引物或探針,因此不適合檢測未知DNA序列的基因突變,或是篩選基因突變。而測序技術(shù)有可能發(fā)現(xiàn)新的等位基因。測定DNA序列可以使用兩種檢材:①如果以RNA為檢材,首先需要通過反轉(zhuǎn)錄制備互補(bǔ)cDNA,再以cDNA為模板通過PCR擴(kuò)增,然后對擴(kuò)增產(chǎn)物測序;②如果以DNA為檢材,可以直接通過PCR擴(kuò)增特定基因片段,然后對擴(kuò)增產(chǎn)物測序,可以檢測出包括編碼區(qū)和非編碼區(qū)的整個(gè)基因序列,通過和基因參考品序列的比對可以發(fā)現(xiàn)基因突變。

    表2 以PCR為基礎(chǔ)的血型基因檢測技術(shù)

    3.4.1 PCR-SBT技術(shù) 為了取得足夠數(shù)量的基因拷貝用于測定序列,受檢基因組DNA樣品一般先用PCR擴(kuò)增,然后對擴(kuò)增的DNA模板測序,被稱為PCR-SBT (Sequence Based Typing,SBT)技術(shù)。由于PCR擴(kuò)增產(chǎn)物含有2條鏈DNA,測序結(jié)果是2條鏈序列的加合結(jié)果,一般需要計(jì)算機(jī)軟件協(xié)助分析。該技術(shù)的缺點(diǎn)是可能產(chǎn)生模棱兩可的分型結(jié)果。

    3.4.2 一代測序技術(shù) 一代測序方法包括Sanger末端終止測序法和焦磷酸測序法。改良的Sanger測序方法使用熒光染料標(biāo)記的A,C,T,G 堿基的雙脫氧核苷三磷酸,使用Taq酶在高溫做PCR循環(huán)反應(yīng),或是使用Bst酶在低溫做PCR循環(huán)反應(yīng),然后通過凝膠電泳檢測DNA序列。焦磷酸測序法是通過依賴核苷酸摻入的焦焦磷酸鹽釋放來測定DNA序列。

    3.4.3 二代測序技術(shù) 二代測序又稱為下一代測序(Next generation sequencing,NGS),該技術(shù)采用微乳液PCR或橋式PCR等方法獲得測序模板,DNA片段的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物聚集在微珠的表面,不需要電泳之類的物理分離方法來區(qū)分堿基序列。其原理是通過捕捉新合成的末端標(biāo)記,邊合成邊確定DNA序列,是一種高通量測序技術(shù),允許檢測單獨(dú)1條單體型的DNA序列,可以避免模棱兩可的分型結(jié)果。雖然已經(jīng)成功地用于某些血型基因分型,但是目前的NGS技術(shù)還不能準(zhǔn)確區(qū)分諸如RHD / RHCE或GYPA / GYPB等基因的單倍型。

    3.4.4 PCR-基因克隆測序技術(shù) 使用PCR擴(kuò)增和分子克隆技術(shù),將待測基因克隆到載體后再測序,每個(gè)克隆只含有1條單體型的基因片段。此法優(yōu)點(diǎn)是不存在模棱兩可的測序結(jié)果,缺點(diǎn)是比較費(fèi)時(shí)費(fèi)力,因此一般只用于鑒定新發(fā)現(xiàn)的等位基因。

    3.5 高通量血型基因分型 高通量血型基因分型常用于大規(guī)模篩查攜帶罕見基因或抗原陰性血液。根據(jù)不同的工作原理,目前已經(jīng)開發(fā)出多種高通量檢測技術(shù),表3只是介紹其中的一部分。這些技術(shù)的共同點(diǎn)是都需要專門的檢測儀器,都檢測血型基因SNP突變位點(diǎn),除TaqMan技術(shù)外都采用多重PCR同時(shí)檢測多種血型基因。美國Immucor公司的HEA BeadChip是首個(gè)獲得美國食品暨藥品管理局(FDA)批準(zhǔn)的非ABO/非RhD血型基因分型診斷試劑盒,該技術(shù)使用PCR擴(kuò)增產(chǎn)物和攜帶約4 000個(gè)熒光探針的BeadChip基因芯片雜交,然后通過熒光顯微鏡檢測[8]。ID CORE XT平臺(tái)使用流式微陣列系統(tǒng),是一個(gè)高度自動(dòng)化的測試平臺(tái),允許在小型或更大型樣品批次上進(jìn)行測試,實(shí)施相對容易。特別是Luminex平臺(tái)已經(jīng)在許多免疫血液學(xué)實(shí)驗(yàn)室中使用,除檢測紅細(xì)胞血型基因外,還用于檢測HPA和HLA系統(tǒng)的基因[9]。

    Thermo Fisher公司的SNaPshot技術(shù),用戶可以自行設(shè)計(jì)PCR引物,檢測特定的SNP,不受廠商產(chǎn)品的限制[10]。Agena的HemoID使用基質(zhì)輔助激光解吸/離子化飛行時(shí)間質(zhì)譜儀(MALDI-TOF MS),這是一種敏感的分析方法,具有高通量和高重復(fù)性等優(yōu)點(diǎn),但是使用的儀器價(jià)格昂貴[11]。MRC-Holland的SALSA平臺(tái),使用多重連接依賴性探針擴(kuò)增(multiplex ligation-dependent probe amplification,MLPA)。MLPA是一種易于應(yīng)用的方法,只需要熱循環(huán)儀和毛細(xì)管電泳設(shè)備,允許在單管反應(yīng)中同時(shí)檢測50多個(gè)多態(tài)性[12]。Thermo Fisher公司的QuantStudio平臺(tái),使用TaqMan基因分型技術(shù),可以根據(jù)已知血型抗原SNP設(shè)計(jì)引物,篩查罕見的表型和罕見的抗原組合[13]。

    4 血型分子分型的應(yīng)用 紅細(xì)胞血型抗原是能夠刺激免疫系統(tǒng)產(chǎn)生抗體的紅細(xì)胞表面遺傳標(biāo)記,其化學(xué)成分可以是蛋白質(zhì)或碳水化合物多糖。編碼血型系統(tǒng)的1個(gè)遺傳位點(diǎn)上,可以有1對或多個(gè),乃至數(shù)百個(gè)等位基因,因此血型抗原通常表現(xiàn)出多種變異體。有時(shí)使用血型血清學(xué)方法難以區(qū)分和鑒定這些變異體,如在臨床輸血上有重要意義的Rh弱D抗原,已檢測出的變異體有130余種[2],沒有相應(yīng)的特異性抗體來區(qū)分它們,必須使用分子分型辦法來鑒定。另外,為了在血庫中保存稀有血型供者,包括罕見的抗原陰性(無效型表型)供者,需要預(yù)先在大量供者群體中進(jìn)行篩查,由于相應(yīng)抗體試劑來源的限制,也需要采用分子分型方法。血型分子分型的臨床應(yīng)用大致可以歸納為患者和供者兩方面,臨床方面主要解決ABO/Rh變異體和ABO和Rh血型以外的相容型輸血問題,供者方面主要篩查罕見血型供者(表4)[14]。

    4.1 疑難血型鑒定 鑒定紅細(xì)胞直接抗人球蛋白試驗(yàn)陽性和具有多凝集作用紅細(xì)胞的血型,通常都會(huì)遇到麻煩,在這種情況下可以使用基因分型技術(shù)鑒定血型。對于新近輸血患者或多次輸血患者,由于外周血中含有供者的血液細(xì)胞,使用經(jīng)典的紅細(xì)胞凝集試驗(yàn)不能正確鑒定血型,也可以使用基因分型方法鑒定[15]。

    表3 高通量血型基因分型技術(shù)

    表4 血型分子分型技術(shù)在預(yù)測供者血型和鑒定患者血型中的應(yīng)用

    4.2 篩查罕見血型和無效型供者 篩選罕見血型供者需要大量標(biāo)準(zhǔn)抗血清,在缺少相應(yīng)抗血清的情況下,可以使用DNA分型技術(shù)進(jìn)行篩選。無效型個(gè)體比較少見,通常是在患者已經(jīng)產(chǎn)生抗體后才被發(fā)現(xiàn),這些抗體一般對應(yīng)高頻率抗原?,F(xiàn)在可以在輸血前對患者做無效型基因檢測,確認(rèn)患者是否是無效型,以避免輸血后產(chǎn)生抗體[16,17]。

    4.3 無創(chuàng)傷胎兒血型鑒定 胎兒血型鑒定對新生兒溶血病的產(chǎn)前診斷有重要意義。過去在產(chǎn)前抽取羊水,再從中取得胎兒細(xì)胞做血型鑒定,是一種有危險(xiǎn)性的臨床手術(shù),不易被產(chǎn)婦接受。近年來發(fā)現(xiàn)在妊娠期以及產(chǎn)后3 d內(nèi),可以從母親血漿或血清中提取游離的胎兒DNA,使用高敏感度的實(shí)時(shí)PCR擴(kuò)增等技術(shù),可以鑒定胎兒的血型。這個(gè)無創(chuàng)傷胎兒血型產(chǎn)前鑒定技術(shù),已成功地鑒定了胎兒ABO、RhD、Rh CE、Kell和Duffy等血型基因[18,19]。在使用基因分型技術(shù)鑒定胎兒RHD基因時(shí)應(yīng)該注意,由于不同種族的RHD基因結(jié)構(gòu)不盡相同,相應(yīng)的基因分型方法也有所不同。如在白種人中,RhD陰性個(gè)體主要是由于缺失整個(gè)RHD基因。而在東方人中,RhD陰性個(gè)體除缺失整個(gè)RHD基因外,也可以是缺失RHD基因中的某些外顯子,或RHD基因中的點(diǎn)突變等多種機(jī)制。

    4.4 分子分型預(yù)測血型的局限性 雖然基于DNA的分子分型對預(yù)測血型有很大的價(jià)值,但是也有其局限性[5]。這主要涉及到檢測技術(shù)和受檢樣品等兩方面因素:①血型分子分型的前提是已知各等位基因的DNA序列,已知血型基因型和血型表型之間的相互關(guān)系。由于不同種族血型變異體遺傳背景不盡相同,對于未知群體的分子分型應(yīng)謹(jǐn)慎行事;②DNA分析一般檢測特定位置的SNP,但是如果其它位置的SNP可以導(dǎo)致編碼抗原不表達(dá),在該SNP純合子時(shí)將產(chǎn)生無效型表型,這時(shí)的基因分型結(jié)果可能被錯(cuò)誤鑒定為抗原陽性。對于供者來說,假陽性結(jié)果意味著將錯(cuò)失有價(jià)值的抗原陰性血液,但不會(huì)危及受血者。但是對于患者,將無效型表型誤定為抗原陽性,接受陽性血液輸注可能產(chǎn)生抗體。無效表型的確認(rèn)需要借助血清學(xué)方法,使用相應(yīng)抗體做血細(xì)胞凝集試驗(yàn),和/或使用交叉配型方法檢測抗體/抗原的不相容性;③在1個(gè)位點(diǎn)上有多個(gè)等位基因的情況下,雖然紅細(xì)胞表達(dá)相應(yīng)抗原,但是DNA分析可能無法檢測出探針/引物結(jié)合點(diǎn),或限制酶切割點(diǎn)發(fā)生改變的等位基因;④在ABO、Rh等血型系統(tǒng)中,大量的等位基因編碼同一種表型,不可能檢測出所有的等位基因。對于某些雜交等位基因,特別是MNS和RH系統(tǒng)的基因,可能會(huì)產(chǎn)生假陽性或假陰性結(jié)果;⑤在雜合子個(gè)體中,某一個(gè)等位基因可能被優(yōu)先擴(kuò)增,因而漏檢另外一個(gè)等位基因;⑥由于輸血或干細(xì)胞移植產(chǎn)生血型嵌合體的情況,和天然產(chǎn)生的嵌合體難以區(qū)別。

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    A

    1671-2587(2017)05-0530-07

    10.3969/j.issn.1671-2587.2017.05.039

    美國國立衛(wèi)生研究院 (NIH)

    趙桐茂 (1943–),男,吉林省長春市人,研究員,主要從事分子免疫血液學(xué)和分子免疫遺傳學(xué)工作,(Tel)13585621829(E-mail)tomhla@163.com。

    2016-05-28)

    (本文編輯:姚萍)

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