血漿EB病毒DNA濃度檢測(cè)在初診鼻咽癌患者分期中的應(yīng)用

凡任芝

血漿EB病毒DNA濃度檢測(cè)在初診鼻咽癌患者分期中的應(yīng)用

凡任芝

目的 探討血漿EBV DNA濃度檢測(cè)在初診鼻咽癌患者診斷分型中的應(yīng)用價(jià)值。方法 按腫瘤淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移（Tumor Node Metastasis，TNM）進(jìn)行臨床分期，對(duì)57例初診鼻咽癌患者用熒光定量PCR技術(shù)檢測(cè)血漿內(nèi)EBV DNA濃度。結(jié)果 EBV DNA陽(yáng)性率與患者的性別及年齡段均無(wú)相關(guān)性；TNM分期中Ⅲ期和Ⅳ期的EBV DNA濃度檢測(cè)結(jié)果的差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），且Ⅳ期較高；隨T分期的發(fā)展，各期EBV DNA陽(yáng)性檢出率增高，T2和T4期EBV DNA濃度檢測(cè)結(jié)果的差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），且T4期較高；M和N分期患者的差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。結(jié)論 血漿EBV DNA濃度水平變化與鼻咽癌患者的臨床分期呈正相關(guān)，可以作為一種初診鼻咽癌患者的輔助診斷手段。

實(shí)時(shí)熒光定量PCR 鼻咽癌 EB病毒

早在1 9 9 8年Mutirrangura等就研究發(fā)現(xiàn)EB病毒（epstein-barr virus，EBV）與鼻咽癌（nasopharyngeal carcinoma NPC）的發(fā)生、發(fā)展和轉(zhuǎn)歸等呈現(xiàn)出一定的相關(guān)性[1]，且有研究表明完整的EBV能誘發(fā)人鼻咽粘膜上皮細(xì)胞發(fā)生癌變[2，3]，EBV和NPC間的關(guān)系一直是研究熱點(diǎn)，越來(lái)越多的研究表明EB病毒含量與鼻咽癌臨床分期、腫瘤負(fù)荷等病情相關(guān)。為此，本研究采用熒光定量PCR方法，對(duì)初診NPC患者血漿中EBV DNA的濃度水平進(jìn)行檢測(cè)，分析量化的病毒濃度與患者性別、年齡等基礎(chǔ)參數(shù)的關(guān)系，并深入分析與現(xiàn)行的TNM標(biāo)準(zhǔn)間的關(guān)系，為下一步深入研究NPC治療期間EBV DNA動(dòng)態(tài)變化情況及預(yù)后判斷等提供前期基礎(chǔ)數(shù)據(jù)。

對(duì)象與方法

1 對(duì)象 選取2015年4月～2016年12月在本院腫瘤放療科收治的57例初診鼻咽癌患者，經(jīng)鼻咽、頸部CT掃描或者M(jìn)RI、胸片、腹部B超、電子鼻咽鏡等檢查手段，及進(jìn)一步根據(jù)需要進(jìn)行骨掃描或病理檢查等明確TNM分期（2008分期方案）[4]及轉(zhuǎn)移情況。其中男性43例，女性14例。年齡分布：最小17歲，最大80歲，平均年齡46.38歲。

2 儀器與試劑 儀器為美國(guó)ABI PCR擴(kuò)增分析儀（型號(hào)7500），試劑為中山達(dá)安公司生產(chǎn)的“EB病毒核酸擴(kuò)增PCR檢測(cè)試劑盒”。熒光探針序列為：5'（FAM）-CCTCGGACAGCTCCTAAGAAGGCACC-3'引物序列為：F5'-AA-GCCCAACACTCCACCAC-3'，5'-CTGGTAGGACTGGGCGAC-3'。

3 方法

3.1 標(biāo)本制備：用一次性無(wú)菌真空采血管（EDTA抗凝）抽取靜脈血2 ml，輕輕混勻。取血漿50 μl置于滅菌的離心管中，加入等體積的DNA提取液，100℃裂解10 min，12 000 r/min離心10 min，取含DNA的上清液備用。

3.2 熒光定量PCR檢測(cè)：PCR反應(yīng)管中按順序加入標(biāo)本，陰陽(yáng)性質(zhì)控品，標(biāo)準(zhǔn)品各5 μl DNA 模板提取液，置于ABI7500PCR儀擴(kuò)增檢測(cè)，依據(jù)試劑說(shuō)明書(shū)設(shè)置擴(kuò)增條件及結(jié)果判斷。

4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理：利用SPSS17.0軟件分析初診患者血漿EBV DNA陽(yáng)性率及濃度水平在不同性別及年齡段的差異；同時(shí)對(duì)各病例TNM分期間的EBV DNA水平的差異進(jìn)行單因素方差分析；按照公認(rèn)的T、N、M分期進(jìn)一步進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析，采用卡方檢驗(yàn)或t檢驗(yàn)，P＜0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

1 初診鼻咽癌患者EB病毒陽(yáng)性檢出率與性別的關(guān)系 研究發(fā)現(xiàn)，57例鼻咽癌初診患者EB病毒感染患者的陽(yáng)性檢出率為82.46%（47/57），以男性患者陽(yáng)性檢出率81.40%略低于女性患者（85.74%），差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義見(jiàn)表1。

表1 不同性別患者的EB病毒檢出率比較

2 不同年齡段患者的EB病毒陽(yáng)性檢出率見(jiàn)表2，不同年齡段EB病毒陽(yáng)性檢出率的差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

3 與臨床TNM分期的關(guān)系 57例鼻咽癌初診患者按照TNM分期，其分布、檢出情況及EBV DNA定量檢測(cè)值見(jiàn)表3。TNM分期中，Ⅲ和Ⅳ期患者血漿EBV DNA濃度的差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.0 5），Ⅳ期陽(yáng)性率（9 5.2 4%）高于Ⅲ期（79.41%），平均拷貝數(shù)Ⅳ期大于Ⅲ期。T分期中，各期陽(yáng)性率依次遞增，平均拷貝數(shù)T1期＜T2期＜T3期＜T4期，T2和T4期EBV DNA濃度的差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。

表2 鼻咽癌初診患者各年齡段與EBV感染檢測(cè)出情況

表3 不同分期患者的血漿EBV DNA檢出情況

討 論

近年來(lái)大量文獻(xiàn)報(bào)道了NPC患者血漿中EBV DNA水平與鼻咽癌的關(guān)系，病毒檢出率與患者性別、年齡等基礎(chǔ)參數(shù)的關(guān)系也是研究關(guān)注的重點(diǎn)之一[5]，有研究表明NPC的高危人群中有91.70%的個(gè)體可以檢測(cè)到EBV DNA[6]，本研究利用實(shí)時(shí)熒光定量PCR方法檢測(cè)57例初診NPC患者血漿內(nèi)EBV DNA濃度水平，EBV陽(yáng)性檢出率為82.46%，與其他省份的最新報(bào)道相近[7]。有文獻(xiàn)報(bào)道初診NPC患者的EBV感染情況與性別無(wú)相關(guān)性[8]，本研究結(jié)果亦顯示不同性別陽(yáng)性檢出率的差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

有學(xué)者通過(guò)測(cè)序比較了NPC患者血漿和原發(fā)腫瘤的EBV基因型，證實(shí)血漿EBV DNA是源于整合EBV的NPC癌細(xì)胞[9]，推測(cè)血漿內(nèi)EBV DNA源于含有EB病毒的腫瘤細(xì)胞或者單核/吞噬細(xì)胞破裂后釋放入血所致，故能很好的反應(yīng)體內(nèi)腫瘤的負(fù)荷情況。研究結(jié)果表明臨床分期越晚，鼻咽癌患者血漿EBV DNA濃度水平和陽(yáng)性率越高[10]。在本次研究中臨床分期Ⅳ期鼻咽癌患者的EB病毒陽(yáng)性率為95.24%，平均病毒含量為7 295.71拷貝數(shù)/ml，均高于Ⅲ期EB病毒陽(yáng)性率（79.41%）和平均病毒含量（4 441.60拷貝數(shù)/ml）；T分期中各期患者的EB病毒陽(yáng)性率和平均病毒含量依次遞增，即

T1＜T2＜T3＜T4，其中T2和T4期血漿EBV DNA濃度的差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。N和M分期中EB病毒陽(yáng)性率和平均病毒含量的差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，這可能也驗(yàn)證了一些觀點(diǎn)：N分期系統(tǒng)仍存在問(wèn)題，轉(zhuǎn)移淋巴結(jié)大小與預(yù)后的關(guān)系一直存有爭(zhēng)議，有學(xué)者認(rèn)為頸部淋巴結(jié)的大小不是鼻咽癌的獨(dú)立預(yù)后因素[11]。本次研究表明N1～N3各期的平均病毒含量要高于N0期，與馮海燕等研究結(jié)論一致[12]。由于M1期的病例數(shù)僅為2例，所獲臨床分期數(shù)據(jù)沒(méi)有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，在隨后的研究中會(huì)增加這部分病例的收集?？傊狙芯拷Y(jié)果也符合EBV DNA的水平2008TNM分期方案[13]。

許多研究表明，EBV DNA 濃度檢測(cè)可作為NPC篩查及早期診斷指標(biāo)，病毒表達(dá)水平對(duì)于NPC 患者的分期、預(yù)后判斷等有重要意義[14]，血漿EBV DNA 濃度檢測(cè)可作為評(píng)估鼻咽癌患者臨床分期的一種輔助性檢測(cè)指標(biāo)，有望將其引入鼻咽癌分期系統(tǒng)中[15]。也有學(xué)者分析了鼻咽癌患者鼻咽部分泌物的EB病毒感染情況，認(rèn)為鼻咽部分泌物的取材更加直接的反應(yīng)局部病變[16]，還有文獻(xiàn)表明鼻咽組織EBV檢測(cè)的陽(yáng)性率高于外周血[17]，本研究結(jié)果證明血漿EBV DNA檢測(cè)作為非創(chuàng)傷性的檢測(cè)方法值得在臨床推廣和應(yīng)用，實(shí)驗(yàn)室應(yīng)加強(qiáng)質(zhì)量控制工作，以確保檢測(cè)結(jié)果的精密度和準(zhǔn)確度。

綜上所述，EBV感染和NPC的發(fā)生、發(fā)展有密切關(guān)系，初診NPC患者的EBV DNA濃度水平和腫瘤負(fù)荷情況密切相關(guān)，與中國(guó)2008TNM分期呈正相關(guān)，熒光定量PCR方法檢測(cè)初診NPC外周血內(nèi)EBV DNA水平有助于臨床分期診斷，這種非侵入性的外周血檢測(cè)方法可作為NPC診斷與治療的重要輔助診斷手段。

1 MUTIRANGURA A，PPRNTHANAKASEM W，THEAMBOONLERS A，et a1．Epstein-barr viral DNA in serum of patients with nasopharyngeal carcinoma [J]Clin Cancer Res，1998，4（3） ：665-669．

2 Liu MT，Yeh CY．Prognostic value 0f anti-Epstein-Barr virus antibodies in nasopharyngeal carcinoma（NPC）[J]．Radiat Med，1998，16（2）：113-117.

3 鄧洪，曾毅，梁建甲．488 683人鼻咽癌普查基本方案分析[J]．腫瘤，2005，25（2） ：152-154．

4 中國(guó)鼻咽癌臨床分期工作委員會(huì).鼻咽癌92分期修訂工作報(bào)告[J].中華放射學(xué)腫瘤雜志，2009，18（1）：2-6.

5 李冰，司勇鋒，覃揚(yáng)達(dá)，等.應(yīng)用FQ-PCR技術(shù)測(cè)定鼻咽癌患者血漿EB病毒DNA定量分析及其臨床意義實(shí)用癌癥雜志[J].2017，32 （2） ：200-203.

6 李志勇，楊荃荃，吉爽，等．EBV-DNA定量檢測(cè)在鼻咽癌隨訪(fǎng)中的意義[J] .國(guó)際病毒學(xué)雜志，2015，22（4）：281-285．

7 張鳳久 顧建華 宋柏龍，等. EB病毒檢測(cè)對(duì)鼻咽癌診斷的臨床意義[J] .國(guó)際病毒學(xué)雜志，2015，22（6）：408-410．

8 陳文學(xué)，鄒學(xué)森，李金高，等.血漿EB病毒DNA檢測(cè)對(duì)鼻咽癌診斷的價(jià)值研究[J].實(shí)用癌癥雜志，2014，29（12）：1526-1528

9 L I N J C，W A N G W Y，C H E N K Y.e t a l.Quantification of plasma Epstein-barr virus DNA in patients with advanced nasopharyngeal carcinoma [J].N Engl J Med，2004，350（24）：2461–2470.

10 羅耀凌，陳浩，彭頌國(guó)，等. 聯(lián)合檢測(cè)EB病毒不同抗體及EB病毒DNA在鼻咽癌血清學(xué)診斷中的價(jià)值 [J] .中華醫(yī)學(xué)雜志，2013，93（44） ：3516-3519.

11 毛燕萍，李文斐，陳磊，等. 鼻咽癌2008 分期的臨床驗(yàn)證 [J]《癌癥》Chinese Journal of Cancer，2009，28（10）：1022–1028.

12 馮海燕，莫穎禧，周曉瑩，等. 鼻咽癌患者血漿EB病毒DNA水平與腫瘤的分期關(guān)系[J].臨床耳鼻咽喉頭頸外科雜志，2008，22（6）：277-278.

13 朱超綱，趙淑芬，陳新樹(shù)，等.EB病毒DNA定量測(cè)定與鼻咽癌“中國(guó)2008TNM分期”的關(guān)系[J].中國(guó)腫瘤，2011，20（10）：16-18.

14 潘建基.鼻咽癌分期研究[J].中國(guó)癌癥雜志，2011，21（12）：901-905.

15 管振祺，何鳳屏，邱世潔，等.EB病毒DNA定量檢測(cè)在鼻咽癌臨床分期中的診斷價(jià)值[J].國(guó)際檢驗(yàn)醫(yī)學(xué)雜志，2016，37（21） ：2961-2963.

16 馬桂云.鼻咽分泌物中EB 病毒DNA 在鼻咽癌臨床診斷中的應(yīng)用價(jià)值[J].中國(guó)醫(yī)藥指南，2012，10（21）：509-511.

17 康喜訊，萬(wàn)世恒，黃雪雯，等.鼻咽組織和外周血EB病毒DNA檢測(cè)和鼻咽癌[J].臨床醫(yī)學(xué)工程，2012，19（10） ：1697-1699.

Objective To investigate the correlation between plasma EBV-DNA level and clinical stage of untreated nasopharyngeal carcinoma （UNPC）. Methods Clinical stage of the UNPC patients was determined by tumor node metastasis （TNM），and the content of EBV DNA in 57 UNPC patients was detected by fluorescence quantitative PCR. Result EBV-DNA positive rate was not correlated with gender and age of patients，but plasma EBVDNA concentration of stage Ⅲ patients was higher than stage Ⅳ patients （P＜0.05）. EBV-DNA positive rate of patients was increased with the development of T stage progress. The EBV-DNA concentration of stage T4patients was higher than stage T2patients （P＜0.05）. No significant difference of plasma EBV-DNA concentration between the stage M and stage N patients. Conclusion The level of plasma EBV-DNA concentration is positively correlated with clinical stages of nasopharyngeal carcinoma. Detection of plasma EBV-DNA by fluorescence quantitative PCR is a useful auxiliary method for UNPC diagnosis.

Real-time PCR Nasopharyngeal carcinoma Epstein-barr virus EBV

R392.11 R739.6

A

1671-2587（2017）05-0462-04

Application of EBV-DNA Detection to Staging of Untreated Nasopharyngeal Carcinoma FAN Ren-zhi，Laboratory Center of Provincial Hospital of Anhui Medical University，Hefei，230001

10.3969/j.issn.1671-2587.2017.05.016

230001 安徽省醫(yī)科大學(xué)附屬安徽省立醫(yī)院

凡任芝（1978–），男，安徽淮北人，主管技師，碩士，主要從事臨床檢驗(yàn)診斷學(xué)質(zhì)量管理控制，（E-mail）798114@163.com。

2017-04-02）

（本文編輯：潘?。?/p>