液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法測定蛋及蛋制品中氟蟲腈及其代謝物的殘留量

時逸吟 李 優(yōu) 伊雄海 張 怡 盛永剛 鄧曉軍 郭德華

（上海出入境檢驗檢疫局 上海 200135）

液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法測定蛋及蛋制品中氟蟲腈及其代謝物的殘留量

時逸吟 李 優(yōu) 伊雄海 張 怡 盛永剛 鄧曉軍 郭德華

（上海出入境檢驗檢疫局 上海 200135）

建立了液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜測定蛋及蛋制品中氟蟲腈及其代謝產(chǎn)物的分析方法。樣品經(jīng)酸性乙腈提取，QuEChERS法凈化，XDB-C18色譜柱（50mm×4.6 mm，1.8 μm）分離，并以含0.1%（v/v）甲酸的5 mmol/L乙酸銨水溶液-含0.1%（v/v）甲酸的乙腈溶液為流動相，梯度洗脫，電噴霧負離子模式電離，多反應(yīng)監(jiān)測模式檢測，基質(zhì)匹配外標法定量。結(jié)果表明氟蟲腈及其代謝物在0.2～10μg/L范圍內(nèi)線性關(guān)系良好，相關(guān)系數(shù)（r2）均大于0.99。方法檢出限（S/N＞3）和定量限（S/N＞10）分別為0.2μg/kg和2μg/kg。在不同基質(zhì)中，氟蟲腈及其代謝物在2、5、20μg/kg的添加水平下平均加標回收率為74.6%～113%，相對標準標準偏差為2.21%～14.0%（n=6）。該方法有效補償了液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜檢測過程中的離子化抑制效應(yīng)，靈敏度和準確度高，適用于雞蛋、雞肉、雞內(nèi)臟、雞蛋面、蛋糕和蛋黃醬中氟蟲腈、氟蟲腈砜、氟蟲腈亞砜和氟甲腈的測定。

蛋及蛋制品；氟蟲腈及其代謝物；液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜；QuEChERS

1 前言

氟蟲腈（Fipronil）又稱芬普尼、銳勁特，為苯基吡唑類殺蟲劑。動物實驗研究表明，短期攝取大量氟蟲腈會對神經(jīng)系統(tǒng)造成不良影響，長期攝取氟蟲腈可能會損害肝臟、甲狀腺和腎臟[1]。2017年7月，比利時有關(guān)部門發(fā)現(xiàn)荷蘭雞蛋含有氟蟲腈，同年8月歐洲16個國家、香港、臺灣相繼在雞蛋中發(fā)現(xiàn)氟蟲腈，使“毒雞蛋”事件發(fā)酵成世界范圍內(nèi)的重大食品安全事件，為我國蛋及蛋制品的安全敲響了警鐘。

目前世界各國已對雞蛋中氟蟲腈的殘留量制定了最大限量標準 （MRL）。其中，國際食品法典委員會（CAC）的規(guī)定MRL值為0.02mg/kg[2]；美國為0.15mg/kg[3]；歐盟為0.005mg/kg，以氟蟲腈和MB46136之和計[4]；日本肯定列表為0.02mg/kg。我國食品安全國家標準GB 2763-2016《食品中農(nóng)藥最大殘留限量》對谷物、果蔬、糖料、食用菌和油脂中的氟蟲腈制訂了殘留限量，以氟蟲腈、氟甲腈（MB46513）、MB46136、MB45950之和計[5]，具體化合物信息見圖1，并對茶葉、果蔬、雞肉中的氟蟲腈制訂了檢測標準[6-9]，也有較多文獻報道了植物性食品中氟蟲腈的檢測方法[10-15]，但是未見蛋及蛋制品中氟蟲腈檢測方法的文獻和標準，為技術(shù)執(zhí)法帶來困難，因此建立蛋及蛋制品中氟蟲腈的檢測方法，對嚴防 “毒雞蛋”入境、保障國內(nèi)蛋和蛋制品安全具有重要意義。

圖 1 氟蟲腈及其代謝物的化合物信息

目前食品中氟蟲腈的檢測方法有氣相色譜法（GC）[10，11，13]、氣相色譜-質(zhì)譜法（GC-MS）[12-14]、液相色譜法（LC）[15]和液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法（LC-MS/ MS）[16]。其中，LC-MS/MS法因其技術(shù)成熟、靈敏度和準確性高，已被廣泛應(yīng)用于食品中農(nóng)藥殘留的檢測。胡貝貞等[16]采用該技術(shù)對茶葉中的氟蟲腈進行了測定，然而對于蛋及含蛋食品中氟蟲腈殘留量的檢測缺乏定性、定量檢測方法。本項目采用QuEChERS法前處理，建立快速、準確、靈敏度高的HPLC-MS/ MS法測定蛋及蛋制品中氟蟲腈的含量。QuEChERS法具有操作快速簡便、試劑消耗少、環(huán)境污染小的優(yōu)點，已成為果蔬中農(nóng)藥殘留檢測和水產(chǎn)品中獸藥殘留檢測的常用前處理手段。本方法的建立能夠及時有效地應(yīng)對突發(fā)性、大批量、多種蛋及蛋制品中氟蟲腈的檢測任務(wù)，填補我國氟蟲腈檢測技術(shù)存在的空白，為執(zhí)法部門提供執(zhí)法依據(jù)，保障人民的食品安全。

2 材料與方法

2.1 材料

2.1.1 試驗樣品

雞蛋、雞肉、雞內(nèi)臟、雞蛋面、蛋糕和蛋黃醬：均由市場采購。

2.1.2 試劑

乙腈：色譜純，迪馬科技有限公司；乙酸銨、無水硫酸鎂、氯化鈉、二水合檸檬酸鈉、檸檬酸二鈉鹽：均為分析純，國藥集團化學試劑有限公司；甲酸：純度98%，美國Sigma-Aldrich公司；十八烷基鍵合硅膠吸附劑（C18）、N-丙基乙二胺吸附劑（PSA）、石墨化炭黑（GCB）：上海安譜實驗科技有限公司；氟蟲腈、氟蟲腈砜、氟蟲腈亞砜和氟甲腈標準品：純度>98%，德國Dr.Ehrensorfer公司；實驗用水：由Milli-Q超純水系統(tǒng)制得。

2.1.3 儀器

液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜聯(lián)用儀：美國AB公司；PL602-L電子天平：瑞士 Mettler-Toledo公司；Centrifuge 5810R離心機：德國 Eppendorf公司；KMC-1300V觸式振蕩器：韓國Vision公司；Milli-Q超純水系統(tǒng)：美國Millipore公司。

2.2 方法

2.2.1 標準溶液配制

分別準確稱取適量氟蟲腈、氟蟲腈砜、氟蟲腈亞砜和氟甲腈標準品，用乙腈溶解并定容，配制質(zhì)量濃度為1 000mg/L的標準儲備液，于-18℃避光保存；移取各標準儲備液，根據(jù)需要用空白基質(zhì)溶液逐級稀釋，并配制適當濃度的標準工作液，現(xiàn)用現(xiàn)配。

2.2.2 樣品前處理

2.2.2.1 提取

新鮮雞蛋去殼后攪拌混勻；雞肉、雞內(nèi)臟、蛋糕和雞蛋面用粉碎機搗碎；蛋黃醬直接使用。稱取4 g試樣（精確至0.01 g）于50mL離心管中，加入10mL水，放入陶瓷均質(zhì)子，加入10mL含1%甲酸的乙腈提取，劇烈振蕩1min。快速加入4.0 g無水硫酸鎂、1.0 g氯化鈉、1.0 g二水合檸檬酸鈉和0.5 g檸檬酸二鈉鹽，劇烈振蕩1min，靜置5min，再次劇烈振蕩1min，以4 500 r/min離心10min，吸取6mL上清液于15mL離心管中，待凈化。

2.2.2.2 凈化

在上述提取液中加入150mg C18、150mg PSA、900mg無水硫酸鎂和15mg GCB粉末，振蕩2min，以4 500 r/min離心5min，取0.5mL上述提取液，乙腈定容至1mL，過0.45 μm濾膜，供LC-MS/MS測定。

2.2.3 液相色譜-質(zhì)譜條件

2.2.3.1 液相色譜條件

色譜柱：Agilent XDB-C18（50 mm×4.6 mm，1.8 μm）；柱溫：30℃；進樣量10 μL；流動相A：含0.1%（v/v）甲酸的5 mmol/L乙酸銨水溶液；流動相B：含0.1%（v/v）甲酸的乙腈溶液；流速：0.4mL/min；進樣量10 μL。梯度洗脫程序：0～2.0min，2%B；2.0～11.0min，99%B；11.0～15.0min，2%B；流速：0.4mL/min。

2.2.3.2 質(zhì)譜條件

離子源：電噴霧離子源（ESI）；掃描方法：負離子掃描；監(jiān)測模式：多反應(yīng)監(jiān)測（MRM）；霧化氣（Gas1）流量：55.0 L/h；加熱輔助氣（Gas2）流量：55.0 L/h；氣簾氣（Curtain gas）流量：30.0L/h；噴霧電壓（IS）：5500V；氟蟲腈、氟蟲腈砜、氟蟲腈亞砜和氟甲腈的保留時間、定性離子、定量離子、碰撞能量（CE）、去簇電壓（DP）、碰撞室入口電壓（EP）和碰撞室出口電壓（CXP）等質(zhì)譜參數(shù)見表1。

表1 氟蟲腈、氟蟲腈砜、氟蟲腈亞砜和氟甲腈的保留時間、母離子、子離子及其他質(zhì)譜參數(shù)

3 結(jié)果與討論

3.1 色譜條件的優(yōu)化

根據(jù)氟蟲腈及其代謝物的化學結(jié)構(gòu)[17]，本項目選用Agilent XDB-C18色譜柱，分別比較了乙腈-水、乙腈-甲酸水溶液、酸性乙腈-酸性乙酸銨水溶液3種不同組成的流動相對目標化合物的分離效果和靈敏度。結(jié)果表明，酸性乙腈-酸性乙酸銨水溶液體系下氟蟲腈及其代謝產(chǎn)物的峰性和靈敏度要高于乙腈-水和乙腈-甲酸水溶液體系[16]；故本項目采用酸性乙腈-酸性乙酸銨水溶液，通過梯度洗脫，氟蟲腈及其代謝產(chǎn)物的色譜圖如圖2所示。

圖2 氟蟲腈、氟蟲腈砜、氟蟲腈亞砜和氟甲腈標準溶液（1μg/L）在MRM模式下的色譜圖

3.2 質(zhì)譜條件的優(yōu)化

分別取1mL 100μg/L的氟蟲腈、氟蟲腈砜、氟蟲腈亞砜和氟甲腈標準工作液，利用流動注射泵進樣，在負離子模式下進行一級質(zhì)譜全掃描，氟蟲腈及其代謝物的化學結(jié)構(gòu)中含有NH2基團，因此在負離子模式下較易失去H+而形成準分子離子[17]，見圖3。同時優(yōu)化其去簇電壓（DP）和碰撞室入口電壓（EP），再以準分子離子進行二級質(zhì)譜掃描，選擇豐度較高的2個碎片離子分別作為定量與定性離子，并優(yōu)化其碰撞能量（CE）和碰撞室出口電壓（CXP）。氟蟲腈及其代謝物的相關(guān)質(zhì)譜參數(shù)見表1。氟蟲腈及其代謝物在正離子模式和負離子模式下均有響應(yīng)，但是在同樣的混合標準品濃度下，正離子模式下的響應(yīng)值遠遠低于負離子模式，故最終選擇了靈敏度更好的負離子模式對目標化為進行測定。

圖 3 氟蟲腈、氟蟲腈砜、氟蟲腈亞砜和氟甲腈的母離子和子離子全掃描質(zhì)譜圖

3.3 前處理條件的優(yōu)化

3.3.1 提取溶劑的優(yōu)化

選擇陰性雞蛋樣品為試驗材料，添加5.0μg/kg混合標準溶液，采用基質(zhì)匹配外標法對萃取溶劑進行優(yōu)化。萃取溶劑選取了QuEChERS方法中常用的4種試劑：乙酸乙酯、甲醇、乙腈和1%甲酸-乙腈（1∶99，v/v）。結(jié)果表明，用乙酸乙酯和甲醇提取時，氟蟲腈及其代謝物的回收率<60%，達不到檢測要求；用乙腈、酸化乙腈提取時，回收率均可滿足檢測方法的要求，但是乙腈提取時，基質(zhì)影響較大；在加入1%甲酸后，減少了基質(zhì)對氟蟲腈及其代謝物的干擾。因此，本項目選擇1%甲酸-乙腈（1∶99，v/v）為提取溶劑（圖4）。

圖 4 不同提取溶劑對氟蟲腈及其代謝物回收率的影響

3.3.2 凈化條件的優(yōu)化

目前常用的吸附劑主要有C18、PSA、GCB和無水硫酸鎂。本項目選擇陰性雞蛋為試驗材料，添加5.0μg/kg混合標準溶液，采用基質(zhì)匹配外標法對萃取溶劑進行優(yōu)化[18]。圖5表明，C18用量在50～200mg范圍內(nèi)，氟蟲腈及其代謝物的回收率在38%～101%之間，C18用量為150mg時氟蟲腈及其代謝物回收率達到最高 （85%～101%）；PSA用量在50～200mg范圍內(nèi)，氟蟲腈及其代謝物的回收率在37%～99%之間，PSA用量為150mg時氟蟲腈及其代謝物回收率達到最高（84%～99%）；無水硫酸鎂用量在300～900mg范圍內(nèi)，氟蟲腈及其代謝物的回收率在41%～ 104%之間，無水硫酸鎂用量為900mg時氟蟲腈及其代謝物回收率達到最高（88%～104%）；GCB用量在10～25mg范圍內(nèi)，氟蟲腈及其代謝產(chǎn)物的回收率在67%～101%，GCB用量為15mg時氟蟲腈及其代謝物回收率達到最高（87%～101%）。本項目最終選擇150mg C18、150mg PSA、900mg無水硫酸鎂和15mg GCB粉為最佳凈化條件。

3.4 方法驗證

3.4.1 基質(zhì)效應(yīng)

基質(zhì)效應(yīng)（ME）在LC-MS/MS分析中普遍存在，且隨儀器試劑和樣品基質(zhì)的不同而表現(xiàn)不同，對ESI源具有明顯的離子化抑制作用，影響檢測靈敏度準確度與精密度。目前，主要通過優(yōu)化前處理條件、添加同位素內(nèi)標、優(yōu)化色譜分離條件、修正質(zhì)譜分析參數(shù)等方法來消除基質(zhì)效應(yīng)[19]。本項目考察了雞蛋、雞肉、雞內(nèi)臟、雞蛋面、蛋糕和蛋黃醬的基質(zhì)效應(yīng)，在純試劑和不同基質(zhì)提取液后添加標樣，比較目標物在純試劑和基質(zhì)液中的信號峰面積，得到基質(zhì)響應(yīng)相對強度（ME）為：基質(zhì)標樣的峰面積/試劑標樣的峰面積×100%。當ME>100%時，表明存在離子化增強效應(yīng)；當ME<100%時，表明存在離子化抑制效應(yīng)。結(jié)果表明，在含水量較高的雞蛋和雞肉樣品中基質(zhì)效應(yīng)在80%～120%之間，基質(zhì)效應(yīng)不明顯；在蛋糕和雞蛋面樣品中基質(zhì)效應(yīng)<80%，表現(xiàn)為基質(zhì)抑制效應(yīng)，可能是較低的含水量濃縮了基質(zhì)共萃物，導致基質(zhì)效應(yīng)較顯著。除此之外，在高油脂的蛋黃醬樣品中基質(zhì)效應(yīng)<80%，表明油脂含量對基質(zhì)抑制的效果形成一定影響，這與報道過的基質(zhì)組分對基質(zhì)效應(yīng)的影響結(jié)論類似[20]。本項目選用基質(zhì)匹配溶液校正方法對基質(zhì)效應(yīng)補償，從而保證檢測結(jié)果的準確性。

3.4.2 方法檢出限（LOD）、定量限（LOQ）和線性關(guān)系

準確量取適量混合標準儲備工作液，用空白雞蛋、雞肉、雞內(nèi)臟、雞蛋面、蛋糕和蛋黃醬基質(zhì)液稀釋，配制混合標準品工作液。以峰面積y為縱坐標，濃度x為橫坐標，氟蟲腈及其代謝產(chǎn)物在0.2μg/L～ 10μg/L質(zhì)量濃度范圍內(nèi)線性良好，相關(guān)系數(shù)（r2）均大于0.99。以3倍信噪比（S/N=3）和10倍信噪比（S/N= 10）確定氟蟲腈及其代謝物的LOD和LOQ，分別為0.2μg/kg和2μg/kg，結(jié)果見表2。

表2 氟蟲腈及其代謝產(chǎn)物的線性回歸方程、相關(guān)系數(shù)及LOD、LOQ

3.4.3 準確度和精密度

在雞蛋、雞肉、雞內(nèi)臟、雞蛋面、蛋糕和蛋黃醬基質(zhì)中添加2、5、20μg/kg的氟蟲腈及其代謝物標準品，按2.2.2節(jié)進行前處理，進行加標回收率試驗（n=6）。結(jié)果表明：雞蛋、雞肉、雞內(nèi)臟、雞蛋面、蛋糕和蛋黃醬基質(zhì)的平均加標回收率分別為70.2%～ 109%、76.0%～106%、79.8%～119%、70.5%～107%、71.0%～112%、71.0%～120%，RSD分別為 5.64%～ 14.0%、3.15%～9.74%、2.21%～9.41%、2.80%～13.3%、2.32%～9.31%、2.16%～9.43%（表3）?？瞻纂u蛋樣品和添加2μg/kg氟蟲腈及其代謝物雞蛋樣品的選擇性離子色譜圖分別見圖6和圖7。結(jié)果顯示，雞蛋樣品中氟蟲腈及其代謝產(chǎn)物的色譜峰峰型良好，基質(zhì)干擾少。說明該方法準確、穩(wěn)定、精密度高，符合殘留檢測要求。

表3 雞蛋、雞肉、雞內(nèi)臟、雞蛋面、蛋糕和蛋黃醬中氟蟲腈及其代謝產(chǎn)物的平均加標回收率和相對標準偏差（n=6）

圖5 空白雞蛋樣品中氟蟲腈及其代謝產(chǎn)物的選擇性離子色譜圖

圖6 加標雞蛋樣品中氟蟲腈及其代謝產(chǎn)物（2μg/kg）的選擇性離子色譜圖

3.5 實際樣品測定

對市售170例市售雞蛋、雞肉、雞內(nèi)臟、雞蛋面、蛋糕和蛋黃醬進行檢測，其中6批次雞蛋樣品測出氟蟲腈砜，含量為0.006～3.8mg/kg，4批次蛋糕樣品測出氟蟲腈砜，含量為0.007～0.068mg/kg。圖7為陽性雞蛋樣品中氟蟲腈及其代謝物的選擇性離子色譜圖。

圖7 氟蟲腈砜陽性雞蛋樣品的選擇性離子色譜圖

4 結(jié)論

本研究建立了液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜測定蛋、雞肉、雞內(nèi)臟、雞蛋面、蛋糕和蛋黃醬中氟蟲腈及其代謝產(chǎn)物含量的分析方法。采用QuEChERS前處理法進行提取凈化，對多種食品基質(zhì)的凈化效果良好。通過基質(zhì)匹配外標法定量可同時補償所有食品基質(zhì)中的基質(zhì)效應(yīng)，有效提高定量的準確性，擴大方法的適用范圍。方法的檢出限、回收率、精密度等均滿足我國對食品中氟蟲腈及其代謝產(chǎn)物含量的檢測要求，可作為分析確證的儲備方法。

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Determination of Fipronil and Its Metabolites in Egg and Egg Products by Liquid Chromatography-Tandem Mass Spectrometry

SHI Yiyin，LI You，YI Xionghai，ZHANG Yi，SHENG Yonggang，DENG Xiaojun，GUO Dehua
（Shanghai Entry-Exit Inspection and Quarantine Bureau，Shanghai，200135）

A liquid chromatography-tandem mass spectrometry （LC-MS/MS） was established for thedetermination of fipronil its metabolites in egg and egg products.The samples were extracted with acid-acetonitrile，cleaned up by QuEChERS method.The separation was performed on an XDB-C18column（50mm×4.6mm，1.8μm）with the mobile phases of 5mmol/L ammonium acetate aqueous solution containing 0.1% （v/v） formic acid and acetonitrile containing 0.1% （v/v） formic acid.The identification and quantitation of fipronil and its metabolites were performed by MS/MS in negative electrospray ionization（ESI-）and multiple reaction monitoring （MRM）mode.The quantitative analysis was carried out by external standard method.A good linear relationship，with the correlation coefficient（r2）greater than 0.99，was found in the mass concentration range of 0.2-10μg/L.The limit ofdetection （LOD，S/N＞3）and limit of quantitation（LOQ，S/N＞10）were 0.2μg/kg and 2μg/kg respectively.The recoveries of fipronil and its metabolites indifferent matrixes spiked with 2，5，20μg/kg varied from 74.6%to 113%，and the relative standarddeviations（RSDs）were between 2.21%and 14.4% （n=6）.The method can effectively correct the ionization suppression，and it is sensitive，accurate and suitable for the monitoring of fipronil，fipronil sulfide，fipronil sulfone and fiponildesulfinyl in egg，chicken，chicken entrails，egg noodle，cake and mayonnaise.

Egg and Egg Products；Fipronil and Its Metabolites；Liquid Chromatography-Tandem Mass Spectrometry（LC-MS/MS）；QuEChERS

O657.7+2

E-mail：shiyy@shciq.gov.cn

上海市技術(shù)標準專項 （17DZ2201100）

2017-09-01