血復生浸膏結合辨證治療對重型再障患者外周血microRNA、淋巴細胞亞群及細胞因子的影響

李峻，陳劼，孫雪梅，朱學軍，姜鵬君，陳健一，倪海雯，張文曦，夏雯

(南京中醫(yī)藥大學附屬醫(yī)院(江蘇省中醫(yī)院)，江蘇 南京 210029)

血復生浸膏結合辨證治療對重型再障患者外周血microRNA、淋巴細胞亞群及細胞因子的影響

李峻，陳劼，孫雪梅，朱學軍，姜鵬君，陳健一，倪海雯，張文曦，夏雯

(南京中醫(yī)藥大學附屬醫(yī)院(江蘇省中醫(yī)院)，江蘇 南京 210029)

目的：研究血復生浸膏結合辨證治療重型再障(SAA)的療效及對外周血microRNA、淋巴細胞亞群、細胞因子的影響。方法：再障患者均來源于南京中醫(yī)藥大學附屬醫(yī)院血液科，分為治療組30例和對照組30例，治療組應用中醫(yī)治療+基礎治療，對照組僅用基礎治療；中醫(yī)治療為血復生浸膏結合辨證分型隨證加減，腎陰虛型患者服用血復生浸膏合左歸丸、知柏地黃丸、犀角地黃湯加減，腎陽虛型患者服用血復生浸膏合右歸丸加減，腎陰陽兩虛型患者服用血復生浸膏合左歸丸、右歸丸加減，熱毒壅盛型患者服用血復生浸膏合清瘟敗毒飲、犀角地黃湯加減；基礎治療為環(huán)孢素、十一酸睪酮、輸血等對癥支持治療，兩組均治療6個月。采用實時定量PCR(realtime PCR)方法檢測SAA患者治療前后外周血單個核細胞(peripheral blood mononuclear cell, PBMNC)miRNA-155-5p、miRNA-1260b表達情況，采用流式細胞術、酶聯(lián)免疫吸附法(ELISA)檢測CAA患者治療前后淋巴細胞亞群及血漿IFN-γ、IL-12p70、TNF-α、TGF-β1水平。結果：治療組總有效率高于對照組(63.3% Vs 36.7%，P=0.039)；治療前SAA患者PBMNC miRNA-155-5p、miRNA-1260b表達、Tc比例、血漿IFN-γ、IL-12p70、TNF-α水平均明顯高于正常對照組(P<0.01)，而Th比例、Th/Tc比值、TGF-β1水平則低于正常對照組(P<0.01)；治療組患者治療6個月后miRNA-1260b表達、IFN-γ、TNF-α水平均明顯下降(P<0.01)，miRNA-155-5p、Tc比例、IL-12p70亦有所下降(P<0.05)，TGF-β1水平明顯升高(P<0.01)，而Th比例、Th/Tc比值、NK比例也有所升高(P<0.05)，但上述指標尚未達到正常水平，治療組上述指標變化較對照組更明顯。結論：miRNA-155-5p、miRNA-1260b表達上調(diào)、細胞免疫功能亢進、造血調(diào)控因子紊亂在SAA免疫異常的發(fā)病過程中起到關鍵作用；血復生浸膏結合辨證治療重型再障療效優(yōu)于單純西藥治療組，其作用機理包括下調(diào)miRNA-155-5p、miRNA-1260b表達，改善淋巴細胞亞群失衡，調(diào)節(jié)細胞因子紊亂，進而減輕異?？哼M的細胞免疫，解除造血抑制。

重型再生障礙性貧血；微小RNA；淋巴細胞亞群；細胞因子；血復生浸膏

再生障礙性貧血(aplastic anemia，簡稱AA)是一種以全血細胞減少和骨髓造血衰竭為特征的血液系統(tǒng)難治性疾病。根據(jù)血象及骨髓增生減低情況，再障可分為重型再障(severe aplastic anemia，簡稱SAA)和非重型再障(non-severe aplastic anemia，簡稱NSAA)。目前再障被公認為是一種以骨髓造血組織為靶器官的T細胞介導的自身免疫性疾病。microRNA (miRNA)是一種保守、非編碼的小分子RNA，能夠結合到目標mRNA的3′非翻譯區(qū)(3′UTR)，使之降解或抑制其翻譯，從而抑制蛋白質(zhì)的合成，達到轉錄后調(diào)控基因表達的目的。近年來研究表明miRNA在調(diào)控固有免疫及適應性免疫中發(fā)揮重要作用[1]，miRNA失調(diào)可導致多種自身免疫性疾病，小鼠模型實驗中糾正失調(diào)的miRNA可起到控制疾病的作用，因而miRNA可作為疾病診斷的新型標志物和潛在的治療靶標。我們前期運用miRNA表達譜芯片篩查再障患者外周血單個核細胞miRNA差異表達譜發(fā)現(xiàn)重型再障患者具有特異性miRNA差異表達譜，其中miRNA-155-5p和miRNA-1260b均表達上調(diào)。治療上，重型再障主要是抗胸腺細胞球蛋白(ATG)/抗淋巴細胞球蛋白(ALG)聯(lián)合環(huán)孢素的免疫抑制療法、異基因造血干細胞移植及刺激造血、輸血等支持治療，國內(nèi)由于ATG/ALG及其后期支持治療費用昂貴，造血干細胞移植供體來源不足、費用高、風險大，使得兩者在臨床應用受到限制。中醫(yī)藥治療再障具有安全、有效、經(jīng)濟等優(yōu)點，一直是國內(nèi)治療再障的重要手段之一。我科在多年臨床實踐和文獻挖掘整理基礎上，創(chuàng)制了具有補腎填精、益髓生血作用的院內(nèi)制劑“血復生浸膏”(鹿角片、紫河車、菟絲子、熟地黃、何首烏、淫羊藿、黃芪、當歸、女貞子、旱蓮草等)，以血復生浸膏為治療基本方，結合辨證分型隨證加減，治療再障療效顯著，且未見明顯毒副作用[2-3]。我們將近期血復生浸膏為主聯(lián)合環(huán)孢素、雄激素治療重型再障，并研究治療前后患者外周血miRNA、淋巴細胞亞群、細胞因子的變化，現(xiàn)報告如下。

1 材料與方法

1.1 病例選擇

所有病例均來源于南京中醫(yī)藥大學附屬醫(yī)院2013年8月—2016年7月期間血液科病房重型再生障礙性貧血患者，共60例，隨機分為治療組和對照組。治療組30例，包括14例SAA-Ⅰ、16例SAA-Ⅱ；男16例，女14例；年齡25～86歲，中位年齡為45歲；血紅蛋白濃度(Hb)(52.6±22.4)g/L；白細胞計數(shù)(WBC)(1.45±0.68)×109/L；血小板計數(shù)(PLT)(13.24±5.63)×109/L；中性粒細胞百分比(GR)(35.28±14.36)%；淋巴細胞百分比(Ly)(56.35±20.34%)；網(wǎng)織紅細胞絕對值(Ret)(18.38±9.15)×109/L；骨髓象分級IV級5例，V級25例。對照組30例，包括15例SAA-Ⅰ、15例SAA-Ⅱ；男14例，女16例；年齡23～88歲，中位年齡為46.5歲；血紅蛋白濃度(Hb)(50.7±23.7)g/L；白細胞計數(shù)(WBC)(1.38±0.65)×109/L；血小板計數(shù)(PLT)(14.68±7.27)×109/L；中性粒細胞百分比(GR)(33.76±15.54)%；淋巴細胞百分比(Ly)(57.62±19.37)%；網(wǎng)織紅細胞絕對值(Ret)(19.24±9.13)×109/L；骨髓象分級IV級4例，V級26例。兩組患者一般資料比較，差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)，具有可比性。

所有患者診斷均符合《血液病診斷及療效標準》(第3版)中重型再障診斷標準[4]，有其他自身免疫性疾病者、精神病患者、合并有心血管、腦血管、肝、腎和其他造血系統(tǒng)等原發(fā)疾病、懷孕及哺乳期婦女均排除在外。正常對照組共20例，均為南京中醫(yī)藥大學附屬醫(yī)院健康體檢者，男10例，女10例，年齡22～66歲，中位年齡35.5歲。本試驗通過南京中醫(yī)藥大學附屬醫(yī)院倫理委員會批準，受試者知情同意后進行。

1.2 中醫(yī)證候分型標準

中醫(yī)辨證分型按照1989年6月在大連召開的中國中西醫(yī)結合研究會血液病專業(yè)委員會第三屆第二次學術座談會制訂的辨證分型標準[5]，結合本科室經(jīng)驗，將治療組患者分為腎陰虛、腎陽虛、腎陰陽兩虛、熱毒雍盛4型。其臨床表現(xiàn)分別為：1)腎陰虛型：潮熱盜汗，手足心熱，面白顴紅，少寐多夢，腰酸腿軟，心悸易驚，口干喜飲，出血色鮮，舌嫩紅苔薄少津或少苔，脈細數(shù)。2)腎陽虛型：面色白，形寒肢冷，唇甲色淡，氣短懶言，腰酸腿軟，食少便溏，出血色淡，舌胖大苔白邊有齒痕，脈沉弱。3)腎陰陽兩虛型：面色蒼白，時冷時熱，自汗盜汗，食少納呆，腰膝酸軟，遺精滑泄，舌淡苔薄白或無苔，脈沉細無力或沉細數(shù)。4)熱毒壅盛型：起病急，面色蒼白，壯熱不退或低熱持續(xù)，皮膚瘀點瘀斑，斑色紅紫，鼻衄齒衄，煩燥口渴，便干尿黃，頭暈乏力，舌紅苔黃，脈洪大數(shù)疾。

1.3 治療方法

1.3.1 中醫(yī)治療

血復生浸膏(5 g/包，蘇藥制字Z04001272)5 g每日3次口服。

1)腎陰虛型：血復生浸膏合左歸丸、知柏地黃丸、犀角地黃湯加減(山茱萸10 g，淮山藥20 g，黃精15 g，龜板15 g，枸杞子15 g，茯苓15 g，仙鶴草30 g，茜草15 g，陳皮10 g，知母10 g，炒黃柏10 g，丹皮15 g，水牛角片先煎15 g，生地黃15 g，炙甘草5 g)。

2)腎陽虛型：血復生浸膏合右歸丸加減(仙茅10 g，巴戟天10 g，補骨脂15 g，淮山藥20 g，黨參20 g，茯苓15 g，仙鶴草30 g，茜草15 g，陳皮10 g，炙甘草5 g)。

3)腎陰陽兩虛型：血復生浸膏合左歸丸、右歸丸加減(山茱萸10 g，補骨脂15 g，淮山藥15 g，茯苓15 g，仙鶴草30 g，茜草15 g，陳皮10 g，炙甘草5 g)。

4)熱毒壅盛型：血復生浸膏合清瘟敗毒飲、犀角地黃湯加減(水牛角片先煎30 g，生地黃15 g，丹皮15 g，赤芍15 g，生石膏先煎30 g，知母10 g，炒黃柏10 g，黃芩10 g，焦山梔子10 g，玄參10 g，白茅根30 g，板藍根15 g，連翹15 g，羚羊角粉沖服0.6 g，仙鶴草30 g，茜草15 g，陳皮10 g，甘草5 g)。

中藥復方煎劑由南京中醫(yī)藥大學附屬醫(yī)院中藥制劑中心提供，每日1劑，水煎服，早晚分服。

1.3.2 基礎治療

環(huán)孢素(25 mg/粒，中美華東制藥公司)5 mg/(kg·d)，分2次口服，根據(jù)血清環(huán)孢素谷濃度適當調(diào)整環(huán)孢素用量，使其濃度達到150～250 ng/ml；十一酸睪酮(40 mg/粒，杭州默沙東制藥公司)40 mg，每日3次，口服。治療期間如合并感染加用抗生素；重度貧血者，輸注紅細胞懸液支持；出血明顯或血小板計數(shù)重度減低時加用止血藥及輸注單采血小板懸液支持。治療組采用中醫(yī)治療+基礎治療，對照組采用基礎治療。兩組均觀察6個月。

1.4 臨床療效判定標準

參照張之南、沈悌主編《血液病診斷及療效標準》(第3版)有關再障的療效標準[4]，分為基本治愈、緩解、明顯進步、無效。

1.5 觀察指標及檢測方法

治療前及治療6月后分別檢測患者miRNA表達、淋巴細胞亞群及細胞因子水平。

1.5.1 實時定量PCR方法檢測miRNA-155-5p、miRNA-1260b表達

主要儀器與試劑：PCR擴增儀(Gene Amp PCR System 9700，Applied Biosystems)，Realtime PCR儀(ViiA 7real-time PCR System，Applied Biosystems)，TRIZOL(Invitrogen life technologies)，PCR master mix(Arraystar)。

RT primers(上海百力格生物技術有限公司)：

U6：5’CGCTTCACGAATTTGCGTGTCAT3’；

miR-1260b5’GTCGTATCCAGTGCGTGTCGTGGAGTCGGCAATTGCACTGGATACGACATGGTG3’；

miR-155-5p：5’GTCGTATCCAGTGCGTGTCGTGGAGTCGGCAATTGCACTGGATACGACACCCCT3’；

實時定量PCR雙向引物序列(引物設計軟件：Primer 5.0，GSP是對應miRNA的特異引物，R是與RT引物相匹配的引物)：

U6 F:5’GCTTCGGCAGCACATATACTAAAAT3’，R:5’CGCTTCACGAATTTGCGTGTCAT3’；

miR-155-5p GSP:5’GGGGGTAATGCTAATCGTGAT3’，R:5’GTGCGTGTCGTGGAGTCG3’；

miR-1260b GSP:5'GGGCTATCCCACCACTGC3’，R:5'GTGCGTGTCGTGGAGTCG3’。

檢測方法：采集靜脈血4～5 ml，EDTA抗凝，密度梯度離心法提取外周血單個核細胞(PBMNC)，TRIzol法提取樣品RNA，并檢測RNA質(zhì)量，以U6為內(nèi)參物，進行miRNA-155-5p、miRNA-1260b的實時定量RT-PCR檢測，逆轉錄反應條件：16℃ 30 min，42℃ 40 min，85℃ 5 min；實時PCR反應條件：95℃ 10 min，40個PCR循環(huán)(95℃ 10 s，60℃ 60 s)。數(shù)據(jù)采用2-△△CT法進行分析。

1.5.2 流式細胞儀檢測外周血淋巴細胞亞群(CD3+，CD3+CD4+，CD3+CD8+，CD4+/CD8+，CD19+，CD16+/CD56+)

主要儀器與試劑：采用Beckman Coulter公司Cytomics FC500流式細胞儀，淋巴細胞亞群檢測所用抗體(CD3+為總T淋巴細胞，CD4+CD8-為輔助T淋巴細胞，CD4-CD8+為細胞毒T淋巴細胞，CD19+為B淋巴細胞，CD3-CD16+CD56+為NK細胞)均購自Beckman Coulter公司，自備溶血素及PBS。

標本收集：抽取患者及健康對照者清晨空腹靜脈血2 ml，肝素抗凝。

檢測方法：外周血標本在采集后24 h內(nèi)染色、上機檢測，取流式管，加入10 μl不同熒光標記的單克隆抗體，加入肝素抗凝的外周血100 μl混勻，室溫下避光放置20 min，加人溶血素2 ml，室溫下放置20 min，500 g離心6 min，棄去上清液，加入2 ml PBS洗滌，離心，棄上清液，500 μl PBS重懸細胞，上機檢測，分析采用Beckman Coulter 公司的CXP Analysis 分析軟件。

1.5.3 采用酶聯(lián)免疫吸附法(ELISA)檢測血漿IFN-γ、IL-12p70、TNF-α、TGF-β1水平

主要儀器與試劑：酶標儀(Biotek Elx800)，人IFN-γ、IL-12p70、TNF-α、TGF-β1 ELISA試劑盒均為南京福麥斯生物公司產(chǎn)品。實驗方法：采集EDTA抗凝外周血4 ml，2 000 rpm離心10 min，小心吸取血漿并凍存于-80℃，采用ELISA法檢測細胞因子IFN-γ、IL-12p70、TNF-α、TGF-β1，檢測方法嚴格按試劑盒說明書操作。

1.6 數(shù)據(jù)分析

2 結果

2.1 兩組患者臨床療效比較

治療組患者基本治愈0例，緩解5例，明顯進步14例，無效11例，總有效率63.3%；對照組患者，基本治愈0例，緩解2例，明顯進步9例，無效19例，總有效率36.7%。治療組總有效率高于對照組(P=0.039)，見表1。

表1 兩組患者臨床療效比較[n(%)]

注：與對照組相比，*P<0.05。

2.2 治療前后外周血單個核細胞microRNA表達變化情況比較

治療前SAA患者miRNA-155-5p、miRNA-1260b表達均明顯升高，與正常對照組比較有顯著性差異(P<0.01)，而治療前治療組和對照組相比，miRNA-155-5p、miRNA-1260b表達無明顯差異(P>0.05)；與治療前相比，治療組治療后miRNA-1260b表達明顯下降(P<0.01)，miRNA-155-5p也有所下調(diào)(P<0.05)，對照組miRNA-1260b表達有所下調(diào)(P<0.05)，而miRNA-155-5p與治療前比較無顯著性差異(P>0.05)；治療后治療組miRNA-155-5p、miRNA-1260b表達均低于對照組(P<0.05)，但仍高于正常對照組(P<0.05)，而對照組miRNA-155-5p、miRNA-1260b表達均高于正常對照組(P<0.01)。說明治療前SAA患者miRNA-155-5p、miRNA-1260b表達均明顯升高，治療后兩者有所下降，但均未達到正常水平，治療組miRNA-155-5p、miRNA-1260b下降幅度高于對照組，結果見表2。

表2 SAA患者治療前后PBMNC miRNA-155-5p、miRNA-1260b表達情況比較

注：與本組治療前比較，*P<0.05,**P<0.01；與對照組治療后比較，#P<0.05；治療前后各組與正常對照組比較，△P<0.05，△△P<0.01。

2.3 治療前后外周血淋巴細胞亞群變化情況比較

與正常對照組相比，SAA患者治療前外周血Tc細胞比例明顯升高(P<0.01)，Th細胞比例、Th/Tc比值均下降(P<0.01)，NK細胞比例亦降低(P<0.05)，而總T細胞、B細胞比例與正常對照組比較則無明顯差異(P>0.05)，治療前治療組和對照組各淋巴細胞亞群比較無明顯差異(P>0.05)。與治療前相比，治療組患者治療后Tc比例下降(P<0.05)，而Th比例、Th/Tc比值、NK細胞比例則升高(P<0.05)；對照組患者治療后Tc比例有所下降，Th比例、Th/Tc比值、NK細胞比例有所升高，但差別無統(tǒng)計學意義(P>0.05)；治療后治療組患者NK細胞比例仍低于正常對照組(P<0.05)，但高于對照組(P<0.05)，對照組NK細胞比例亦低于正常對照組(P<0.05)；治療后治療組Tc細胞比例低于對照組(P<0.05)，但仍高于正常對照組(P<0.05)，而對照組治療后Tc比例仍高于正常對照組(P<0.01)；治療后治療組Th比例仍低于正常對照組(P<0.05)，但高于對照組(P<0.05)，而對照組Th比例仍明顯低于正常對照組(P<0.01)；治療后治療組Th/Tc比值仍低于正常對照組(P<0.05)，對照組則明顯低于正常對照組(P<0.01)。說明經(jīng)治療，SAA患者外周血Tc比例有所下降，而Th、Th/Tc、NK比例則有所升高，治療組患者變化更明顯，但尚未達正常，見表3、表4。

表3 SAA患者治療前后外周血T細胞、B細胞、NK細胞的比較

注：與本組治療前比較，*P<0.05；與對照組治療后比較，#P<0.05；治療前后各組與正常對照組比較，△P<0.05。

表4 SAA患者治療前后外周血Th細胞、Tc細胞及Th/Tc比值的比較

注：與本組治療前比較，*P<0.05；與對照組治療后比較，#P<0.05；治療前后各組與正常對照組比較，△P<0.05，△△P<0.01。

2.4 治療前后血漿細胞因子變化情況比較

治療前SAA患者血漿IFN-γ、IL-12p70、TNF-α表達水平均明顯高于正常對照組(P<0.01)，而TGF-β1則低于正常對照組(P<0.01)，治療組和對照組各細胞因子水平無明顯差異(P>0.05)；與治療前相比，治療后治療組血漿IFN-γ、TNF-α均明顯下降(P<0.01)，IL-12p70亦有所下降(P<0.05)，而TGF-β1則升高(P<0.01)，對照組IFN-γ、TNF-α有所下降(P<0.05)，TGF-β1升高(P<0.05)，而IL-12p70變化無統(tǒng)計學意義(P>0.05)；治療后與對照組相比，治療組IFN-γ、IL-12p70、TNF-α均更低(P<0.05)，而TGF-β1則高于對照組(P<0.05)；治療后與正常對照組相比，治療組IFN-γ、IL-12p70、TNF-α仍升高(P<0.05)，TGF-β1則低于正常對照組(P<0.05)，而對照組治療后IFN-γ、IL-12p70、TNF-α仍明顯高于正常對照組(P<0.01)，TGF-β1低于正常對照組(P<0.01)。說明經(jīng)治療，SAA患者血漿IFN-γ、IL-12p70、TNF-α均有所下降，而TGF-β1則升高，但均未達到正常水平，治療組患者治療前后細胞因子變化更明顯，見表5～6。

表5 SAA患者治療前后血漿IFN-γ、IL-12p70的比較

注：與本組治療前比較，*P<0.05，**P<0.05；與對照組治療后比較，#P<0.05；治療前后各組與正常對照組比較，△P<0.05，△△P<0.01。

表6 SAA患者治療前后血漿TNF-α、TGF-β1的比較

注：與本組治療前比較，*P<0.05，**P<0.05；與對照組治療后比較，#P<0.05；治療前后各組與正常對照組比較，△P<0.05，△△P<0.01。

2.5 SAA患者不同變量之間相關性分析

治療前SAA患者Tc比例與IFN-γ、IL-12p70成正相關(r分別為0.631、0.574，P<0.05)，與中性粒細胞絕對值、網(wǎng)織紅細胞計數(shù)成負相關(r分別為-0.615、-0.518，P<0.05)，與血小板計數(shù)無明顯相關性； IL-12p70與IFN-γ成正相關性(r為0.628，P<0.05)，與中性粒細胞絕對值、網(wǎng)織紅細胞計數(shù)成負相關(r分別為-0.427、-0.405，P<0.05)，與血小板計數(shù)無明顯相關性，miRNA-155-5p表達與IL-12p70水平成正相關性(r為0.387，P<0.05)。

3 討論

再生障礙性貧血是一種以骨髓造血干祖細胞為靶器官的免疫介導的骨髓衰竭性疾病。AA患者免疫功能異常，尤其是T細胞免疫功能異常在其發(fā)病過程中起重要作用。我們既往研究也表明，IFN-γ/T-bet、IL-12/ STAT4通路的異?；罨?，及Th1/Th2平衡向Th1型偏移，在AA免疫異常的發(fā)病過程中起到關鍵的作用[6]。本研究中我們發(fā)現(xiàn)SAA患者存在細胞毒T細胞比例升高，輔助性T細胞比例減低，Th/Tc比值減低，造血負調(diào)控因子IFN-γ、TNF-α、IL-12p70表達均升高，而TGF-β1水平則減低，且Tc比例、IL-12p70與中性粒細胞絕對值、網(wǎng)織紅細胞計數(shù)成負相關，表明細胞免疫功能亢進在SAA發(fā)病中起到重要作用。

miRNA作為一種轉錄后調(diào)控基因表達的重要機制，參與絕大多數(shù)生物過程，近年來其在免疫細胞分化發(fā)育及炎癥、自身免疫性疾病、感染、腫瘤發(fā)生發(fā)展中的作用受到越來越多的重視。我們前期應用microRNA 表達譜芯片檢測再障患者外周血單個核細胞miRNA表達情況，發(fā)現(xiàn)重型再障患者外周血單個核細胞存在特征性的miRNA差異表達譜，其中miR-155-5p、miR-1260b均表達上調(diào)。本研究中我們應用realtime RT-PCR方法檢測了SAA患者miR-155-5p、miR-1260b表達情況，檢測結果和芯片分析一致。miRNA-155是最早鑒別出來的具有調(diào)節(jié)免疫系統(tǒng)分化和免疫應答(包括天然免疫和適應性免疫)作用的miRNA之一。樹突狀細胞內(nèi)源性miRNA-155可促進Th1、Th17極化細胞因子，進而促進炎癥T細胞亞群的分化[6]，其可通過靶向抑制SOCS1表達、促進Th1極化細胞因子IL-12分泌，從而促進Th1細胞分化。過表達miRNA-155可顯著下調(diào)SOCS1，進而上調(diào)IL-12及促進Th17分化的細胞因子(IL-6、IL-23)。輔助性T細胞在TCR激活及Th極化細胞因子存在情況下可誘導miR-155表達。T細胞miRNA-155的表達可通過靶向抑制轉錄因子Ets1—Th17分化的負調(diào)節(jié)因子，從而促進Th17分化[6-7]。miR-155還能通過抑制Jarid2而促進Th17功能[8]。miR-155缺陷的Th17細胞對于IL-23刺激呈低反應性，提示miR-155在致病性Th17發(fā)揮效應功能時起重要調(diào)節(jié)作用[7]。miRNA-155包括miRNA-155-5p和miRNA-155-3p兩個亞型，目前已證實miRNA-155-5p在免疫反應、炎癥、腫瘤發(fā)生等過程中發(fā)揮了重要的作用[9]。本研究中相關性分析表明miRNA-155-5p表達與IL-12p70水平成正相關性，因而AA患者外周血單個核細胞miR-155-5p升高可能在AATh1/Th17極化激活的免疫發(fā)病機制中起到重要作用。miRNA-1260b目前被認為具有類似于癌基因的功能，它可抑制Wnt信號通路相關具有抑癌作用的基因，如SFRP1、Dkk2及Smad4，從而促進腎細胞癌的進展[10]，此外在前列腺癌、結直腸癌、非小細胞肺癌中miRNA-1260b高表達也與腫瘤轉移進展、預后差關系密切[11-13]。生物信息學分析表明，miRNA-1260b和miRNA-155-5p兩者預測作用的靶基因均包括ETS1。Ets1轉錄因子是Ets基因家族的一種，在進化過程中高度保守，在免疫細胞分化發(fā)育、功能調(diào)節(jié)、自身免疫性疾病發(fā)生及腫瘤侵襲過程中具有重要作用。我們研究表明，AA患者高表達miRNA-155-5p和miRNA-1260b，miRNA-1260b可能與miRNA-155-5p協(xié)同作用，通過抑制ETS1表達，進而促進Th17的分化，在AA發(fā)病過程中發(fā)揮作用。

重型再障根據(jù)其臨床表現(xiàn)，屬于中醫(yī)學“髓勞”“虛勞”“血虛”“血證”等范疇，中醫(yī)學認為其病因病機是在外感六淫、內(nèi)傷七情、飲食不節(jié)、勞倦過度、藥物毒邪等因素的作用下，傷及臟腑陰陽，尤其是腎，因腎藏精主骨生髓，精血之化生、骨髓的正常功能均與腎關系密切。對于重型再障中醫(yī)辨證分型，可分為腎陰虛型、腎陽虛型、腎陰陽兩虛型、熱毒雍盛型及陰虛火旺型。由于腎陰虛型患者和陰虛火旺型患者臨床表現(xiàn)及用藥較為相似，我們將這兩型合并為同一組。而腎精虧虛則貫穿再障發(fā)病的始末，目前中醫(yī)藥聯(lián)合環(huán)孢素、雄激素是國內(nèi)公認的治療再障有效、安全的方法。本研究中SAA患者采用血復生浸膏為主治療后，血象改善、病情好轉，療效優(yōu)于單純西藥對照組，Tc比例、IFN-γ、IL-12p70、TNF-α水平下降，Th比例、Th/Tc比值、NK細胞比例、TGF-β1升高，且miRNA-155-5p、miRNA-1260b表達均下調(diào)，上述指標變化幅度均比單純西藥治療組更明顯，提示血復生浸膏為主聯(lián)合辨證治療再障、調(diào)控再障免疫異常的機理部分是通過調(diào)節(jié)細胞免疫、抑制造血負調(diào)控因子、下調(diào)miRNA-155-5p、miRNA-1260b來實現(xiàn)的。

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EffectsofXuefushengExtractumCombinedwithTreatmentBasedonSyndromeDifferentiationinSAAPatients:StudyofChangesofPeripheralBloodmicroRNA,LymphocyteSubsetsandCytokines

LI Jun, CHEN Jie, SUN Xue-mei, ZHU Xue-jun, JIANG Peng-jun, CHEN Jian-yi,NI Hai-wen, ZHANG Wen-xi, XIA Wen

(TheAffiliatedHospitalofNanjingUniversityofChineseMedicine,JiangsuTCMHospital,Nanjing210029,China)

Objective: To study the effects of Xuefusheng extractum on peripheral blood microRNA, lymphocyte subsets and cytokines in severe aplastic anemia(SAA) patients. Methods: 60 Patients were randomly divided into the observation group(n=30) and the control group(n=30). The observation group was treated with TCM treatment plus basic treatment; whereas, the control group was only given basic treatment. TCM treatment included administration of Xuefusheng extractum combined with treatment based on syndrome differentiation. On the basis of Xuefusheng extractum, modified Zuogui pill, Zhibai Dihuang pill and Xijiao Dihuang decoction were also administrated to the patients with Kidney-yin deficiency; modified Yougui pill was also given to the patients with Kidney-yang deficiency; modified Zuogui pill and Yougui pill were also applied to the patients with deficiency of both Kidney-yin and Kidney-yang; and modified Qingwen Baidu decoction and Xijiao Dihuang decoction were also given to the patients with excessive toxic-heat. The basic treatment included the applications of cyclosporine, eleven acid testosterone, blood transfusion, and other support treatment. Both groups were treated for six months. Expressions of miRNA-155-5p and miRNA-1260b in peripheral blood mononuclear cells(PBMNC) were detected with RT-PCR before and after the treatment, levels of IFN-γ, IL-12p70, TNF-α and TGF-β1 were tested with ELISA method and flow cytometry before and after the treatment. Results: The total effective rate of the observation group was higher than that of the control group(63.3% Vs 36.7%,P=0.039). Before the treatment, expressions of miRNA-155-5p and miRNA-1260b, Tc proportion, plasma levels of IFN-γ, IL-12p70 and TNF-α were significantly higher in CAA patients compared to those in normal people(P<0.01); whereas, Th proportion, Th/Tc ratio and TGF-β1 level were lower than those of normal people(P<0.01). After six-month treatment, in the observation group, expression of miRNA-1260b, levels of IFN-γ and TNF-α were significantly decreased (P<0.01); expression of miRNA-155-5p, Tc proportion and IL-12p70 were also decreased(P<0.05); TGF-β1 level were significantly increased(P<0.01). Th proportion, Th/Tc ratio and NK proportion were also increased(P<0.05). However, these indicators had not yet reached the normal level. The indexes of the treatment group changed more significantly than those of the control group. Conclusion: The up-regulation of miRNA-155-5p and miRNA-1260b, cellular immune hyperfunction and disorder of hematopoiesis regulating factors play important roles in the immune abnormalities in SAA patients. Therapeutic effect of treating SAA with Xuefusheng extractum and treatment based on syndrome differentiation is superior to that of simple western medicine treatment. The therapeutic mechanism includes down-regulation of miRNA-155-5p and miRNA-1260b, improving lymphocyte subsets imbalance and disorder of cytokines, and alleviating abnormal hyperfunction of cellular immune response and hematopoietic suppression.

Severe aplastic anemia; microRNA; Lymphocyte subsets; Cytokine; Xuefusheng extractum

R285.6

A

1002-2406(2017)06-0077-07

江蘇省自然科學基金項目(No.BK20131034)；2015年江蘇省政府留學獎學金資助項目(No.蘇教外[2015]44號)；2016年江蘇省衛(wèi)生國際(地區(qū))交流支撐計劃青年醫(yī)師自選項目(No.蘇衛(wèi)國合(2016)155號)

李峻(1981-)，男，副主任醫(yī)師，講師，醫(yī)學博士，主要從事中西醫(yī)診治血液病的臨床與實驗研究工作。

2017-05-03

修回日期：2017-05-25