海南和四川不同生長年限曼地亞紅豆杉3種紫杉烷類活性成分的比較研究

劉建慧，馬生軍，馬留純，曹雪琴，梁朔，呂苗，王穎,，王萬勇，羅建民

(1.浙江麗水市農業(yè)科學研究院，浙江 麗水 323000；2.新疆農業(yè)大學食品科學與藥學學院，新疆 烏魯木齊 830052；3.新疆分析測試中心，新疆 烏魯木齊 830011;4.澄邁興達田園農業(yè)有限公司，海南 澄邁 571900)

海南和四川不同生長年限曼地亞紅豆杉3種紫杉烷類活性成分的比較研究

劉建慧1，馬生軍2*，馬留純2，曹雪琴3，梁朔1，呂苗2，王穎2,4，王萬勇4，羅建民3

(1.浙江麗水市農業(yè)科學研究院，浙江 麗水 323000；2.新疆農業(yè)大學食品科學與藥學學院，新疆 烏魯木齊 830052；3.新疆分析測試中心，新疆 烏魯木齊 830011;4.澄邁興達田園農業(yè)有限公司，海南 澄邁 571900)

目的：分析和比較海南和四川不同生長年限曼地亞紅豆杉3種紫杉烷類活性成分的的含量差異。方法：利用甲醇和CHCl3混合液超聲浸提后再用甲醇溶解得到相關成分；通過高效液相色譜法對10-DAB Ⅲ、三尖杉寧堿和紫杉醇含量進行測定和比較。結果：1)不同生長年限，海南栽培曼地亞紅豆杉3年生枝條中10-DAB Ⅲ和紫杉醇含量均最高，7年生枝條中三尖杉寧堿含量最高；四川栽培曼地亞紅豆杉4年生枝條中10-DAB Ⅲ和三尖杉寧堿含量均最高，紫杉醇含量在不同生長年限間不存在顯著性差異(P>0.05)。2)相同生長年限，四川栽培曼地亞紅豆杉10-DAB Ⅲ含量普遍高于海南栽培曼地亞紅豆杉，三尖杉寧堿含量兩個產地間有高有低，海南栽培3年生曼地亞紅豆杉紫杉醇含量在所有年限間最高。結論：四川栽培曼地亞紅豆杉10-DAB Ⅲ含量高于海南栽培曼地亞紅豆杉，可以優(yōu)先作為10-DAB Ⅲ提取的材料來源產地；海南栽培4年生和3年生曼地亞紅豆杉分別作為三尖杉寧堿和紫杉醇粗提原料來源更優(yōu)。

海南；四川；生長年限；曼地亞紅豆杉；紫杉烷類

曼地亞紅豆杉(TaxusmadiaRehd.)屬紅豆杉科(Taxaceae)紅豆杉屬(Taxus)，是東北紅豆杉(T.cuspidateSieb. et Zucc.)與歐洲紅豆杉(T.baccataL.)的雜交種，20世紀末引入中國，相較同屬其他種生長迅速且適應性強，不僅樹皮中含有紫杉醇，而且枝葉中紫杉醇含量甚至有高達0.069%的報道，使其成為利用紅豆杉樹皮提取抗癌藥物紫杉醇的最佳替代原料[1-3]。除紫杉醇外紅豆杉枝葉提取物中還包含其他10余種亦具有抗癌活性的紫杉烷類化合物，如10-脫乙酰基巴卡亭Ⅲ(10-deacetyl-bacratin Ⅲ，10-DAB Ⅲ)、三尖杉寧堿(cephalomannine)等[4-5]。藥理實驗表明10-DAB Ⅲ和三尖杉寧堿也具有較強的抗腫瘤活性，10-DAB Ⅲ是紫杉醇半合成的重要前體物之一，還可利用其合成多烯他塞(docetaxel)，后者比紫杉醇具有更高的抗氧化活性；而三尖杉寧堿與紫杉醇結構十分相近，可轉化為紫杉醇或開發(fā)成新的抗腫瘤藥物[4]。

環(huán)境及人為因素對植物的生長和活性成分含量的影響較為顯著[6]。因此，對在不同生態(tài)地區(qū)引種紅豆杉并進行有效成分含量比較具有重要意義，可為紅豆杉栽培品種的科學選擇與進一步生態(tài)條件的優(yōu)化提供依據(jù)。目前，有關不同采集時間、不同誘導子、不同栽培類型等對曼地亞紅豆杉中紫杉醇含量影響的研究已有報道，而有關環(huán)境因子尤其是產地和生長年限對10-DAB Ⅲ和三尖杉寧堿含量影響的研究卻鮮有報道[7-9]。本研究利用HPLC法對海南和四川不同栽培年限的曼地亞紅豆杉樣品進行檢測，對比兩個不同產區(qū)3種活性成分的差異，從而探討環(huán)境因素對曼地亞紅豆杉紫杉烷類化合物含量的影響，以期為采收和更有效利用曼地亞紅豆杉這一珍貴的藥用植物資源提供理論支持。

1 材料與方法

1.1 材料

2016年2月分別于海南和四川采集人工栽培不同生長年限的曼地亞紅豆杉植株上無病蟲害、生長健康具有代表性的枝條若干。海南2 ～8年生曼地亞紅豆杉枝條采自海南省澄邁縣，四川2 ～7年生曼地亞紅豆杉枝條采自四川省眉山市。將采集的樣品在烘箱中60℃烘干至恒重，利用高速萬能粉碎機將樣品粉碎(過60目篩)，待用。

10-DABⅢ對照品(批號15987，美國MCE公司)；三尖杉寧堿對照品(批號CJ0708QA14，上海源葉生物科技有限公司)；紫杉醇對照品(批號T05M7F10533，上海源葉生物科技有限公司)；乙腈(批號141252，美國賽默飛世爾科技(中國)有限公司)；以上試劑純度均≥98%(HPLC)。水為超純水，其他試劑均為分析純。

1.2 儀器

LC-20AT型高效液相色譜儀(日本島津公司)；SPD-10AVP型DAD紫外檢測器(日本島津公司)；DFT-50型高速萬能粉碎機(溫嶺市林大機械有限公司)；BT 125型電子天平(十萬分之一)(德國賽多利斯科學儀器(北京)有限公司)；DHG-9140A電熱恒溫鼓風干燥箱(上海精宏實驗設備有限公司)。

1.3 方法

參照陳立國等方法并作適當改動進行測定[10]。

1.3.1 色譜條件

Agilent HCC-18色譜柱(250 mm × 4.6 mm，5 μm)；乙腈(A)和超純水(B)為流動相進行梯度洗脫(0～15 min，30%→40%；15～30 min，40%→45%；30～50 min，45%→75%；50～60 min，75%→100%；60～70 min，100%→25%)；紫外檢測波長227 nm;進樣量：10 μL；流速：1.0 mL/min；柱溫：35 ℃。該條件下3種對照品和樣品色譜圖見圖1。

1.3.2 對照品溶液的制備

于5 mL容量瓶中，精密稱定3種對照品適量，甲醇溶解并稀釋至刻度，分別得濃度為1.500 mg/mL的10-DAB Ⅲ、3.000 mg/mL的三尖杉寧堿、0.840 mg/mL的紫杉醇，搖勻，備用。

1.3.3 供試品溶液的制備

分別取2.0 g粉碎的樣品，于室溫下用V(甲醇)(5 mL)∶V(CHCl3)(5 mL)=1∶1混合液超聲浸提3次，每次浸提30 min；合并浸提液，過濾后真空濃縮，再用1 mL甲醇溶解，過微孔濾膜，即得。

圖1 混合對照品(A)和樣品(B)色譜圖 注：1：10-DAB Ⅲ；2：三尖杉寧堿(cephalomannine)；3：紫杉醇(taxol)。

1.3.4 標準曲線的繪制

分別精密吸取混合對照品溶液1、5、10、13、15、20 μL進樣測定，以進樣量X(μg)為橫坐標，峰面積Y為縱坐標，繪制標準曲線。各對照品的回歸方程、相關系數(shù)及線性范圍見表1。

1.4 數(shù)據(jù)處理

應用Excel進行數(shù)據(jù)計算與表格繪制，運用SPSS 19.0軟件統(tǒng)計分析數(shù)據(jù)。多組間用單因素方差分析(one-way ANOVA)，兩兩比較選用RSD法，P<0.05表示存在顯著性差異，P<0.01表示存在極顯著性差異。

表1 曼地亞紅豆杉中3種活性成分的線性回歸方程

2 結果與分析

2.1 不同生長年限海南曼地亞紅豆杉3種活性成分含量的比較

不同生長年限海南曼地亞紅豆杉3種活性成分含量的對比見表2。由表2可知，不同生長年限的海南曼地亞紅豆杉3種活性成分含量間均存在極顯著差異(P<0.01)。10-DAB Ⅲ含量依次為HN3>HN5>HN7>HN6>HN2>HN4>HN8，3年生枝條10-DABⅢ含量最高為0.017 5%，其次為5年生枝條為0.014 8%，3年生枝條中10-DAB Ⅲ含量除與5年生二者間不存在顯著性差異(P>0.05)外，均顯著高于其他生長年限的曼地亞紅豆杉；8年生枝條10-DABⅢ含量最低僅為0.002 5%，分別只有3年生和5年生枝條的14.29%和16.89%。三尖杉寧堿含量依次為HN7>HN4>HN8>HN3>HN5>HN6>HN2，7年生枝條三尖杉寧堿含量最高為0.068 4%，與3、4、8年生枝條間不存在顯著性差異，但均極顯著高于2、5、6年生枝條中三尖杉寧堿含量(P<0.01)；7年生枝條中三尖杉寧堿含量分別比2、5、6年生枝條增加了66.96%、51.61%、56.87%。紫杉醇含量依次為HN3>HN7>HN2>HN6>HN5>HN4>HN8，3年生枝條紫杉醇含量最高為0.039 0%，極顯著高于其他生長年限枝條中紫杉醇含量(P<0.01)，其次為2年生和7年生枝條分別為0.030 3%、0.030 5%，但后二者間紫杉醇含量不存在顯著性差異；4年生和8年生枝條中紫杉醇含量最低不到0.02%，且二者間不存在顯著性差異，3年生枝條中紫杉醇含量分別是4年生和8年生枝條的2.07、2.52倍。

表2 不同生長年限海南曼地亞紅豆杉3種活性成分含量的比較

注：HN2～8分別代表海南澄邁2～8年生曼地亞紅豆杉枝條。表中不同小寫字母表示差異顯著(P<0.05)，不同大寫字母表示差異極顯著(P<0.01)。

2.2 不同生長年限四川曼地亞紅豆杉3種活性成分含量的比較

不同生長年限四川曼地亞紅豆杉3種活性成分含量的對比見表3。由表3可知，不同生長年限的四川曼地亞紅豆杉3種活性成分中三尖杉寧堿含量間存在極顯著差異，而10-DAB Ⅲ和紫杉醇含量間均不存在顯著性差異(P>0.05)。10-DAB Ⅲ含量依次為SC4>SC3>SC2>SC7>SC5>SC6，4年生枝條10-DABⅢ含量最高為0.030 1%，與2年生和3年生枝條間不存在顯著性差異，但2、3、4年生枝條與5、6、7年生枝條間存在顯著性差異(P<0.05)；5、6年生枝條10-DAB Ⅲ含量最低均不到0.02%，分別只有4年生枝條的64.12%、55.81%。三尖杉寧堿含量依次為SC4>SC5>SC3>SC2>SC7>SC6，4年生枝條三尖杉寧堿含量最高為0.062 3%，與2、3、5年生枝條間不存在顯著性差異，但均極顯著高于6年生枝條中三尖杉寧堿含量(P<0.01)；6年生枝條中三尖杉寧堿含量最低為0.025 3%，2～5年生枝條中三尖杉寧堿含量分別是6年生枝條的2.13、2.19、2.46、2.26倍。紫杉醇含量依次為SC7>SC3>SC4>SC5>SC2>SC6，7年生枝條中紫杉醇含量最高為0.037 0%，6年生枝條中最低為0.030 8%，但不同生長年限之間紫杉醇含量差異不顯著(P>0.05)。

表3 不同生長年限四川曼地亞紅豆杉3種活性成分含量的比較

注：SC2～7分別代表四川眉山2～7年生曼地亞紅豆杉枝條。表中不同小寫字母表示差異顯著(P<0.05)，不同大寫字母表示差異極顯著(P<0.01)。

2.3 相同生長年限海南和四川曼地亞紅豆杉3種活性成分含量差異比較

相同生長年限海南和四川曼地亞紅豆杉3種活性成分含量差異比較見圖2～4。

圖2 相同生長年限海南和四川曼地亞紅豆杉10-DAB Ⅲ含量差異比較

圖3 相同生長年限海南和四川曼地亞紅豆杉三尖杉寧堿含量差異比較

圖4 相同生長年限海南和四川曼地亞紅豆杉紫杉醇含量差異比較

由圖3可以看出，相同生長年限間海南和四川栽培曼地亞紅豆杉三尖杉寧堿含量有高有低，除2年生和5年生枝條間略有差異外，其他生長年限間不存在顯著性差異(P>0.05)。海南栽培3、4、6、7年生曼地亞紅豆杉三尖杉寧堿含量均略高于四川相同栽培年限曼地亞紅豆杉，且4年生和7年生海南栽培曼地亞紅豆杉中三尖杉寧堿含量在所有測定年限間也相對更高。

由圖4可以看出，相同生長年限間除3年生海南栽培曼地亞紅豆杉紫杉醇含量顯著高于四川栽培曼地亞紅豆杉外(P<0.05)，其他生長年限內均是四川栽培曼地亞紅豆杉含量更高一些，但海南栽培3年生曼地亞紅豆杉紫杉醇含量在所有生長年限間均高于其他生長年限。

3 結論與討論

植物的次生代謝是植物在長期進化中與環(huán)境相互作用的結果，受到生物和非生物因子的調控[11-12]。次生代謝產物不僅能夠提高植物抵抗外界不良環(huán)境的能力，同時也是中藥的主要有效成分，對很多人類疾病具有治療作用[13]。這些藥用植物次生代謝產物主要有萜類、黃酮類、甾醇類和生物堿等。10-DAB Ⅲ、三尖杉寧堿和紫杉醇等紫杉烷類均屬于二萜類化合物，作為目前治療癌癥最有效的活性成分可能也是紅豆杉的防御物質，這些成分在紅豆杉體內的形成與積累與不同產地環(huán)境(包括海拔、降水、土壤、光照等)密不可分[14-15]。

1)海南栽培曼地亞紅豆杉3年生枝條中10-DABⅢ和紫杉醇含量均最高，而8年生枝條中二者含量均最低；7年生枝條中三尖杉寧堿含量最高，8年生枝條中三尖杉寧堿含量也最低。四川栽培曼地亞紅豆杉4年生枝條中10-DAB Ⅲ和三尖杉寧堿含量均最高，而6年生枝條中二者含量均最低；紫杉醇含量在不同生長年限間不存在顯著性差異。不同生長年限海南和四川曼地亞紅豆杉枝葉中三種活性成分含量差異的變化可能與生長環(huán)境有關，其原因可能是海南地處熱帶北緣，屬熱帶季風氣候，長夏無冬且降雨充沛，一年四季植物均可自然生長，生活周期相對更長更有利于10-DAB Ⅲ和紫杉醇含量的提前積累；而四川地處中國西南腹地,平均海拔遠高于海南，氣候區(qū)域表現(xiàn)差異顯著，四季分明，對紫杉醇等紫杉烷類化合物積累的影響勢必與海南省引種栽培曼地亞紅豆杉之間存在差異，柏培磊等和楊逢建等對南方紅豆杉的研究結果也很好的證明了這一點[16-18]。

2)目前，10-DAB Ⅲ、三尖杉寧堿和紫杉醇等具有顯著抗癌效果的紫杉烷類化合物的提取原料主要是天然紅豆杉植物, 但紅豆杉屬植物普遍生長緩慢, 且樹皮中紫杉醇的含量低(0.01% 干重)。因此，尋找及擴大紫杉醇藥源成為亟待解決的難題[19]。四川栽培曼地亞紅豆杉10-DAB Ⅲ含量相比較海南栽培曼地亞紅豆杉更高，尤其是4年生枝條10-DAB Ⅲ含量，可以作為10-DAB Ⅲ提取的材料來源產地。鑒于海南獨特氣候條件更有利于植株萌蘗生長和更快獲得收益，同時考慮到修剪采收量和后期管理及土地利用率，海南栽培4年生枝條作為三尖杉寧堿粗提原料來源更優(yōu)，海南栽培3年生曼地亞紅豆杉作為紫杉醇粗提原料來源經濟效益更高。

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ThreeEffectiveComponentsofTaxanesfromTaxusmadiaRehd.:ComparativeStudyofDifferentGrowthPeriodandofDifferentOrigin

LIU Jian-hui1, MA Sheng-jun2*, MA Liu-chun2, CAO Xue-qin3, LIANG Shuo1,LV Miao2, WANG Ying2,4, WANG Wan-yong4, LUO Jian-min3

(1.LishuiAgriculturalResearchInstitute,Lishui323000,China;2.XinjiangAgriculturalUniversity,Urumqi830052,China;3.XinjiangAutonomousAcademyofInstrumentalAnalysis,Urumqi830011,China;4.ChengMaiXingdaRuralAgriculturalCompany,Chengmai571900,China)

Objective: To analyze and compare the content differences of three effective components of taxanes inTaxusmadiaRehd. of different growing years from Hainan and Sichuan. Methods:The relevant components were obtained by ultrasonic extraction with the mixed liquor of CH3OH and CHCl3, and CH3OH for dissolving afterwards. 10-deacetyl-bacratin(10-DAB Ⅲ), cephalomannine and taxol were detected and compared by HPLC. Results: ForT.madiain Hainan, the contents of 10-DAB Ⅲ and taxol were the highest at year of three, and the contents of cephalomannine reached the highest at year of seven. ForT.madiain Sichuan, the contents of 10-DAB Ⅲ and cephalomannine were the highest at year of four, and the contents of taxol had no significant differences among different growing years(P>0.05). At the same growth period, the contents of 10-DAB Ⅲ ofT.madiain Sichuan were generally higher than that in Hainan, the contents of cephalomannine were uncertain, and the contents of taxol of three-yearT.madiain Hainan were the highest. Conclusion: The contents of 10-DABⅢ ofT.madiain Sichuan were higher than that in Hainan, and which could primarily be used as a source of material origin. However, the four-year and three-yearT.madiain Hainan were more suitable as material source of cephalomannine and taxol respectively.

Hainan; Sichuan; Growth period;TaxusmadiaRehd.; Taxanes

R28

A

1002-2406(2017)06-0009-05

海南省重點研發(fā)計劃項目(No.ZDYF2016147)

劉建慧(1971-)，男，學士，主要從事林木育種與推廣研究工作。

馬生軍*(1977-),男，博士，副教授,主要研究方向：中藥材規(guī)范化生產及其質量安全評價。

2016-12-21

修回日期：2016-12-31