• <tr id="yyy80"></tr>
  • <sup id="yyy80"></sup>
  • <tfoot id="yyy80"><noscript id="yyy80"></noscript></tfoot>
  • 99热精品在线国产_美女午夜性视频免费_国产精品国产高清国产av_av欧美777_自拍偷自拍亚洲精品老妇_亚洲熟女精品中文字幕_www日本黄色视频网_国产精品野战在线观看 ?

    DSC和同步輻射寬角XRD法研究丹皮酚在脂質(zhì)體疏水尾鏈區(qū)的包封位置及對膜流動(dòng)性的影響

    2017-11-16 07:36:25魏田田郭皓月周洪偉鄔瑞光
    中醫(yī)藥信息 2017年6期
    關(guān)鍵詞:添加物丹皮X光

    魏田田,郭皓月,周洪偉,鄔瑞光*

    (1.北京中醫(yī)藥大學(xué)中藥學(xué)院,北京 100102;2.清華大學(xué)化學(xué)系,生命有機(jī)磷化學(xué)與化學(xué)生物學(xué)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,北京 100084;3.中國中醫(yī)科學(xué)院,中醫(yī)臨床基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)研究所,北京 100700)

    中藥研究

    DSC和同步輻射寬角XRD法研究丹皮酚在脂質(zhì)體疏水尾鏈區(qū)的包封位置及對膜流動(dòng)性的影響

    魏田田1,郭皓月2,周洪偉3,鄔瑞光1*

    (1.北京中醫(yī)藥大學(xué)中藥學(xué)院,北京 100102;2.清華大學(xué)化學(xué)系,生命有機(jī)磷化學(xué)與化學(xué)生物學(xué)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,北京 100084;3.中國中醫(yī)科學(xué)院,中醫(yī)臨床基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)研究所,北京 100700)

    目的:研究丹皮酚在脂質(zhì)體疏水尾鏈區(qū)的包封位置及對膜流動(dòng)性的影響,進(jìn)而探討其抗氧化作用機(jī)制。方法:薄膜分散法制備丹皮酚脂質(zhì)體,采用差示掃描量熱法(DSC)研究丹皮酚對脂質(zhì)體膜主相變的影響,進(jìn)而探討丹皮酚在脂質(zhì)體疏水尾鏈的包封位置,采用同步輻射寬角X光衍射法(XRD)研究丹皮酚對液晶態(tài)的脂質(zhì)體膜疏水尾鏈間距的影響,進(jìn)而探討其對膜流動(dòng)性的影響及與抗氧化作用機(jī)制的關(guān)聯(lián)。結(jié)果:DSC結(jié)果表明,隨著丹皮酚濃度的增大,脂質(zhì)體的主相變溫度逐漸降低,半峰寬逐漸增大,同步輻射寬角X光衍射結(jié)果表明與液晶態(tài)的空白脂質(zhì)體相比,丹皮酚的包封增大了磷脂分子疏水尾鏈之間的距離。結(jié)論:丹皮酚分子主要作用在磷脂分子疏水尾鏈的C1~C9的位置;丹皮酚的包封可以增加液晶態(tài)膜尾鏈的無序度,從而提高膜的流動(dòng)性,這是其發(fā)揮抗氧化作用可能的作用機(jī)制。

    差示掃描量熱;同步輻射寬角X光衍射;丹皮酚;脂質(zhì)體;包封位置;膜流動(dòng)性;抗氧化

    丹皮酚(結(jié)構(gòu)式見圖1)又稱牡丹酚,是中藥牡丹皮和徐長卿的主要活性成分,其藥理活性廣泛,臨床多用于心、腦血管、腫瘤、炎癥、變態(tài)反應(yīng)和免疫系統(tǒng)等疾病[1]。但丹皮酚在水中溶解度很低且易揮發(fā),見光易氧化分解,在臨床應(yīng)用中受到制約[2],將其制成脂質(zhì)體不僅可以提高丹皮酚的生物利用度,還可以提高其靶向性,增強(qiáng)療效。

    脂質(zhì)體是脂質(zhì)分子分散在水中自組裝形成的囊泡,主要組成成分是磷脂,脂質(zhì)體膜中常用的磷脂是二棕櫚酰磷脂酰膽堿(DPPC,結(jié)構(gòu)式見圖1),磷脂雙分子層構(gòu)成了細(xì)胞膜的基本支架,因此,脂質(zhì)體可以用作生物膜的模型膜[3]。Nunes[4]等以脂質(zhì)體模擬細(xì)胞膜研究了五種非甾體抗炎藥對細(xì)胞膜的擾動(dòng)作用,揭示了非甾體抗炎藥可能的作用機(jī)制。脂質(zhì)體膜隨著溫度的變化可能呈現(xiàn)晶體相、層狀凝膠相、波動(dòng)凝膠相和液晶相等不同的相態(tài)[5],外源物質(zhì)的加入將影響脂質(zhì)體的相轉(zhuǎn)變,使膜的流動(dòng)性發(fā)生改變。細(xì)胞膜的流動(dòng)性是細(xì)胞膜重要的生物物理特征,膜流動(dòng)性的改變將影響各種膜功能,如物質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)、信息傳遞及膜上酶的活性等[6]。

    課題組前期已經(jīng)用差示掃描量熱(DSC)法及同步輻射小角X光衍射法研究了丹皮酚和DPPC的相互作用[3]以及丹皮酚、膽固醇與DPPC之間的競爭性相互作用[7]。藥物在脂質(zhì)體中可能包封于DPPC分子的膽堿部位、甘油骨架部位及疏水尾鏈部位,疏水尾鏈區(qū)又分為C1~C9區(qū)和C10~C16區(qū)[8]。包封于磷脂分子的不同位置對膜流動(dòng)性的影響也不同。本文采用差示掃描量熱(DSC)法結(jié)合同步輻射寬角X光衍射方法研究丹皮酚在脂質(zhì)體疏水尾鏈區(qū)中的包封部位及對液晶態(tài)膜流動(dòng)性的影響,并探討其與丹皮酚抗氧化作用的關(guān)聯(lián)性。

    圖1 丹皮酚和DPPC的結(jié)構(gòu)式

    1 儀器與試藥

    1.1 儀器

    821e型差示掃描量熱儀 (瑞士梅特勒-托利多公司);同步輻射X光衍射實(shí)驗(yàn)裝置(北京同步輻射國家實(shí)驗(yàn)室1W2A站);XSE105DU型電子天平(瑞士梅特勒-托利多公司);EHEIM型變溫附件(英國Linkam公司);RE-52AA型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀(上海亞榮);DZF6050型真空干燥設(shè)備(上海一恒)。

    1.2 試藥

    二棕櫚酰磷脂酰膽堿(DPPC,美國Sigma公司,純度>99%);丹皮酚(美國Sigma公司,純度>99%);其他國產(chǎn)試劑均為分析純。

    2 方法與結(jié)果

    2.1 丹皮酚脂質(zhì)體的制備

    參照文獻(xiàn)[9]的方法制備脂質(zhì)體:按計(jì)量比例稱取DPPC和丹皮酚,溶解于氯仿中,通過旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)以除去氯仿至燒瓶內(nèi)壁形成薄膜,真空干燥箱中過夜以除去殘留的有機(jī)溶劑;加入過量的Tris-HCl(pH=7.4)緩沖溶液,置于60℃水浴1 h,旋渦混合1 min,室溫20 min,旋渦混合1 min,如此反復(fù)3次,至體系均勻分散。

    2.2 差示掃描量熱實(shí)驗(yàn)

    采用高靈敏度傳感器HSS7,實(shí)驗(yàn)氣氛為 N2,以空白坩堝做參比。為了保證樣品在升溫過程中處于相平衡的狀態(tài),選擇較低的升溫速率1 ℃/min。實(shí)驗(yàn)結(jié)果見圖2與表1。

    圖2 含不同摩爾百分比丹皮酚的脂質(zhì)體的DSC曲線

    丹皮酚摩爾百分比主相變相變溫度(℃)半峰寬(℃)相變焓(J/g)042.80.642.181040.71.342.722040.41.945.242539.82.143.90

    圖2所示為空白DPPC和丹皮酚含量不同的DPPC脂質(zhì)體膜的DSC曲線。空白DPPC脂質(zhì)體膜的DSC曲線顯示兩個(gè)峰,第一個(gè)峰峰形平緩且峰面積小,相變溫度為36.6℃,對應(yīng)預(yù)相變(Lβ′to Pβ′);第二個(gè)峰峰形尖銳且峰面積較大,相變溫度為42.8℃,對應(yīng)主相變(Pβ′to Lα)。這一結(jié)果與文獻(xiàn)報(bào)導(dǎo)的空白DPPC脂質(zhì)體的相變溫度一致[10-11]。由表1可知,與空白脂質(zhì)體相比,隨著丹皮酚濃度的增大,含藥脂質(zhì)體主相變溫度逐漸減小,半峰寬ΔT1/2逐漸增大,相變焓先增大后減小。

    2.3 同步輻射寬角XRD實(shí)驗(yàn)

    在實(shí)驗(yàn)過程中使用可以程序控溫的Linkam變溫附件(英國Linkam公司)對樣品進(jìn)行溫度控制。衍射波長為1.54 ?,樣品與檢測器的距離為246 mm,曝光時(shí)間為120 s。衍射圖像用Fit2D軟件(http://www.esrf.eu/computing/scientific/FIT2D/)處理以得到衍射強(qiáng)度與倒置距離s之間的二維衍射曲線,由倒置間距s可求得反映磷脂分子尾鏈有序度的尾鏈間距d(d=1/s)。

    脂質(zhì)體可以用作細(xì)胞膜的模型膜。細(xì)胞膜適當(dāng)?shù)牧鲃?dòng)性是保證細(xì)胞功能的關(guān)鍵。生理溫度下的細(xì)胞膜是液晶態(tài)的,因此在模擬細(xì)胞膜時(shí)應(yīng)使脂質(zhì)體處于液晶態(tài)。根據(jù)圖2和表1所示,空白脂質(zhì)體和各含藥脂質(zhì)體在45℃時(shí)都處于液晶相。因此本實(shí)驗(yàn)進(jìn)行了45℃下各樣品的同步輻射寬角X光衍射實(shí)驗(yàn)。 結(jié)果見圖3及表2。

    圖3 45℃含不同摩爾百分比丹皮酚的脂質(zhì)體的同步輻射寬角衍射曲線

    丹皮酚摩爾百分比倒置間距(nm-1)尾鏈間距(nm)02.28180.438102.20230.454202.20230.454252.20230.454

    由表2的數(shù)據(jù)可知,與空白脂質(zhì)體相比,各含藥脂質(zhì)體的磷脂分子尾鏈間距都有明顯增加,說明丹皮酚的包封可以增加處于液晶相的脂質(zhì)體膜中磷脂分子尾鏈排列的無序度,磷脂分子尾鏈排列無序度的提高將使其流動(dòng)性增加。

    3 討論

    在空白DPPC脂質(zhì)體的DSC曲線上通??梢钥吹絻蓚€(gè)吸熱峰,峰形平緩且峰面積較小的是預(yù)相變,反映了層狀凝膠相到波動(dòng)凝膠相(Lβ′to Pβ′)的轉(zhuǎn)變,來源于磷脂分子中極性端的熱運(yùn)動(dòng);峰形尖銳且峰面積較大的是主相變,反映了波動(dòng)凝膠相到液晶相(Pβ′to Lα)的轉(zhuǎn)變,來源于磷脂分子中碳?xì)滏湹娜廴赱12]。DSC曲線的主相變溫度、相變焓、半峰寬的增減變化可以用于推測脂質(zhì)體膜結(jié)構(gòu)性質(zhì)的改變及藥物在脂質(zhì)體中的包封位置。

    同步輻射寬角X光衍射實(shí)驗(yàn)可以得到脂質(zhì)體中磷脂分子疏水尾鏈之間的距離,而疏水尾鏈距離的增大可以表征磷脂分子尾鏈無序度的增大,從而反映脂質(zhì)體膜流動(dòng)性的增大。

    3.1 丹皮酚對脂質(zhì)體膜主相變的影響及藥物的包封位置

    主相變來源于磷脂分子中碳?xì)滏湹娜廴赱12],表1表明丹皮酚脂質(zhì)體主相變溫度隨丹皮酚濃度的增大整體呈下降的趨勢,說明丹皮酚進(jìn)入脂質(zhì)體膜的疏水區(qū)。脂質(zhì)體的DSC曲線是外源物質(zhì)對磷脂影響的宏觀表現(xiàn),Jain等研究了多種脂溶性添加物對DPPC脂質(zhì)體的DSC曲線的影響,總結(jié)了根據(jù)加入添加物后脂質(zhì)體主相變的DSC吸熱峰的變化來推測添加物在脂質(zhì)體中包封位置的規(guī)律[8]:若半峰寬增大,峰尖移動(dòng),則添加物主要作用于DPPC分子的C1~C9位置;若峰形上出現(xiàn)小臺(tái)階,且小臺(tái)階下的面積隨添加物濃度的增加而增加(但總面積不變),則添加物主要作用于DPPC分子的甘油骨架位置;若峰尖不發(fā)生移動(dòng),但峰的起始溫度和終止溫度發(fā)生變化,則添加物主要作用于DPPC分子的C10~C16位置;若加入添加物后DSC曲線出現(xiàn)新的峰,且新峰的面積隨添加物濃度的增加而增加,則添加物主要作用于DPPC分子的膽堿位置。在本實(shí)驗(yàn)中,隨著脂質(zhì)體中丹皮酚濃度增加,DSC曲線中主相變的峰形變寬,峰尖位置發(fā)生了移動(dòng),根據(jù)Jain探索的規(guī)律,丹皮酚應(yīng)主要作用在DPPC尾鏈的C1~C9的位置,如圖4所示。

    圖4 丹皮酚分子在脂質(zhì)體疏水尾鏈中的包封位置示意圖

    3.2 丹皮酚對膜流動(dòng)性的影響與其抗氧化性的關(guān)聯(lián)

    在脂質(zhì)過氧化過程中,自由基氧化多不飽和脂肪酸為飽和脂肪酸,降低了細(xì)胞膜的流動(dòng)性。Wassall等的研究表明,脂質(zhì)過氧化作用更容易發(fā)生在流動(dòng)性較低(有序度較大)的模型膜[13]。磷脂膜的流動(dòng)性的增加將使之不易被氧化[14]。本實(shí)驗(yàn)同步輻射寬角X光衍射結(jié)果表明丹皮酚的包封可以增加處于液晶相的脂質(zhì)體膜中磷脂分子尾鏈的流動(dòng)性,據(jù)此推測丹皮酚可能通過提高細(xì)胞膜的流動(dòng)性發(fā)揮抗氧化作用。

    包封率是脂質(zhì)體制劑的關(guān)鍵指標(biāo)之一。搞清楚藥物與脂質(zhì)分子的相互作用機(jī)制及藥物在脂質(zhì)體中的作用位置對于開發(fā)具有高包封率的脂質(zhì)體意義重大。本研究對于進(jìn)一步深入探索藥物在脂質(zhì)體中與輔料分子的作用位點(diǎn)、對于設(shè)計(jì)具有高包封率的含藥脂質(zhì)體具有重要的意義。

    [1] 郭齊,李貽奎,王志國,等.丹皮酚藥理研究進(jìn)展[J].中醫(yī)藥信息,2009,26(1):20-22.

    [2] 閆軍,賈獻(xiàn)慧,唐文照.丹皮酚脂質(zhì)體的制備及質(zhì)量控制方法研究[J].中國藥房,2010,21(35):3299-3301.

    [3] 鄔瑞光,周洪偉,張小華,等.DSC和XRD法研究丹皮酚和脂質(zhì)體的相互作用[J].中醫(yī)藥信息,2011,28(5):10-13.

    [4] Nunes C,Brezesinski G,Lima JLFC,et al.Synchrotron SAXS and WAXS study of the interactions of NSAIDs with lipid membranes[J].J Phys Chem B,2011,115(24):8024-8032.

    [5] Koynova R,Caffrey M.Phase and phase transitions of the phosphatidylcholines[J].Biochim Biophys Acta,1998,1376(1):91-145.

    [6] 郝艷紅,李慶章.細(xì)胞膜流動(dòng)性與藥物作用[J].黑龍江畜牧獸醫(yī),2001,18(2):26-28.

    [7] 鄔瑞光,孫海源,周洪偉,等.DSC和XRD法研究丹皮酚與脂質(zhì)體的相互作用Ⅱ[J].中醫(yī)藥信息,2015,32(3):14-16.

    [8] Jain MK,Wu NM.Effect of small molecules on the dipalmitoyl lecithin liposomal bilayer[J].J Membrane Bio,1977,34(1):157-201.

    [9] Bakonyi M,Berkó S,Budai-Sz cs M,et al.Differential scanning calorimetry for evaluating the encapsulation efficiency of lidocaine loaded liposomes compared to the ultracentrifugation method[J].J Therm Anal Calorim,2017, doi:10.1007/s10973-017-6394-1.

    [10] Goodwin GC,Hammond K,Lyle I,et al.Lectin-mediated agglutination of liposomes containing glycophorin. Effects of acyl chain length[J].Biochim Biophys Acta,1982,689(1): 80-88.

    [11] Wu RG,Chen L,Yu ZW,et al.Phase diagram of stigmasterol-dipalmitoylphosphatidylcholine mixtures dispersed in excess water[J].Biochim Biophys Acta,2006,1758(6):764-771.

    [12] 寧美英,郭穎志,顧忠偉.差示掃描量熱法在脂質(zhì)體研究中的應(yīng)用[J].國外醫(yī)學(xué)·藥學(xué)分冊,2005,32(1):56-61.

    [13] Wassall SR,Thewalt JL,Wong L,et al.deuterium NMR study of the Interaction of alpha-Tocopherol with a phospholipid model membrane[J].Biochemistry,1986,25(2):319-326.

    [14] Nunes C,Brezesinski G,Lima JLFC,et al.Effects of non-steroidal anti-inflammatory drugs on the structure of lipid bilayers:therapeutical aspects[J].Soft Matter,2011,7(6):3002-3010.

    EncapsulatingLocationofPaeonolinHydrophobicTailChainofLiposomesandItsEffectontheMembraneFluidity:StudywithDSCandSynchrotronWide-angleXRDMethods

    WEI Tian-tian1, GUO Hao-yue2, ZHOU Hong-wei3, WU Rui-guang1*

    (1.SchoolofChineseMateriaMedica,BeijingUniversityofChineseMedicine,Beijing100102,China; 2.KeyLaboratoryofBio-organicPhosphorousChemistryandChemicalBiology(MinistryofEducation),TsinghuaUniversity,Beijing100084,China; 3.InstituteofBasicResearchinClinicalMedicine,ChinaAcademyofChineseMedicalSciences,Beijing100700,China)

    Objective: To study the encapsulating location of paeonol in hydrophobic tail chain of liposomes and its effect on membrane fluidity to disclose the mechanism of the antioxidant effect of paeonol. Methods: Liposomes were prepared by film dispersion method. Differential scanning calorimetry(DSC) was employed to investigate the effect of paeonol on the main transition of liposomes and to disclose the encapsulating location of paeonol in liposomes. Synchrotron wide-angle X-ray diffraction(XRD) technique was employed to investigate the effect of paeonol on the distance between hydrophobic tail chain and its effect on the membrane fluidity of liposomes existing as liquid-crystalline phase. Furthermore, the relationship between XRD results and the mechanism of the antioxidant effect of paeonol was investigated. Results: The DSC results showed that the temperature of main transition decreases and the half-height width of DSC peaks increased with increased concentration of paeonol. The wide-angle X-ray diffraction results showed that the distance between hydrophobic chains of phospholipid molecules of paeonol encapsulated liposomes was larger than that of blank liposome. Conclusion: The location site of paeonol at the tail chains of DPPC was C1~C9. The incorporation of paeonol into liposomes can increase the disorder of the tail chains of DPPC and improve the fluidity of the membrane, which may be one of the mechanisms of the antioxidant effect of paeonol.

    DSC; Synchrotron wide-angle XRD; Paeonol; Liposomes; Encapsulating location; Membrane fluidity; Antioxidant effect

    R28

    A

    1002-2406(2017)06-0001-04

    國家自然科學(xué)基金項(xiàng)目(No.81773916);北京市自然科學(xué)基金項(xiàng)目(No.7153171);北京中醫(yī)藥大學(xué)基本科研業(yè)務(wù)費(fèi)資助項(xiàng)目(No.2017-JYB-JS-155,2017-JYB-XS-093)

    魏田田(1991-),女,北京中醫(yī)藥大學(xué)2015級碩士研究生。

    鄔瑞光*(1975-),男,博士,副教授,碩士研究生導(dǎo)師,主要研究方向:中藥制劑新技術(shù)與新劑型。

    2017-09-13

    修回日期:2017-10-01

    猜你喜歡
    添加物丹皮X光
    食品級再生聚對苯二甲酸乙二醇酯中非有意添加物的風(fēng)險(xiǎn)
    包裝工程(2023年19期)2023-10-16 05:41:58
    外源添加物對自制生物有機(jī)肥保存期的影響
    仿生武器大揭秘
    給動(dòng)物拍張X光片
    人眼X光
    快樂語文(2019年9期)2019-06-22 10:00:38
    鳳丹愈傷組織中丹皮酚含量的測定
    3種丹皮酚凝膠經(jīng)皮滲透性能的比較
    中成藥(2018年1期)2018-02-02 07:19:51
    保健食品非法添加物檢測技術(shù)探討
    還在喂奶,能照X光嗎?
    媽媽寶寶(2017年2期)2017-02-21 01:21:28
    加味桂枝茯苓湯I(xiàn)中丹皮酚的含量測定
    热99国产精品久久久久久7| 好男人视频免费观看在线| 国产 精品1| 亚洲精品一区蜜桃| 成人亚洲欧美一区二区av| 午夜日本视频在线| 国产亚洲欧美精品永久| 欧美日韩国产mv在线观看视频| 99热全是精品| 午夜免费男女啪啪视频观看| 大香蕉久久网| 婷婷色综合大香蕉| 国产av国产精品国产| a 毛片基地| 免费黄频网站在线观看国产| 免费女性裸体啪啪无遮挡网站| 精品国产一区二区久久| 欧美变态另类bdsm刘玥| 男女下面插进去视频免费观看 | xxxhd国产人妻xxx| 亚洲国产欧美日韩在线播放| av有码第一页| 亚洲国产av影院在线观看| 日本av手机在线免费观看| 少妇熟女欧美另类| 日韩在线高清观看一区二区三区| 这个男人来自地球电影免费观看 | 欧美日韩成人在线一区二区| 免费大片18禁| 丝袜在线中文字幕| 国产成人一区二区在线| 视频在线观看一区二区三区| 18禁裸乳无遮挡动漫免费视频| 大片免费播放器 马上看| 黄色 视频免费看| 国产伦理片在线播放av一区| 五月伊人婷婷丁香| 最近中文字幕高清免费大全6| 国产69精品久久久久777片| 久久毛片免费看一区二区三区| 亚洲av日韩在线播放| 搡女人真爽免费视频火全软件| 国产av国产精品国产| 国产一级毛片在线| 深夜精品福利| 国产国语露脸激情在线看| av在线播放精品| 国产成人欧美| 亚洲经典国产精华液单| 七月丁香在线播放| 我要看黄色一级片免费的| 新久久久久国产一级毛片| 免费av不卡在线播放| 亚洲av成人精品一二三区| 最近中文字幕高清免费大全6| 国产无遮挡羞羞视频在线观看| 欧美老熟妇乱子伦牲交| 欧美亚洲 丝袜 人妻 在线| av一本久久久久| 97人妻天天添夜夜摸| 成年动漫av网址| 亚洲国产精品一区二区三区在线| 色哟哟·www| 久久久久网色| 热99久久久久精品小说推荐| 这个男人来自地球电影免费观看 | 成人国语在线视频| 99久国产av精品国产电影| 国产精品麻豆人妻色哟哟久久| 国产av精品麻豆| 美女国产视频在线观看| 99久久综合免费| 国产深夜福利视频在线观看| 日本黄大片高清| 欧美精品国产亚洲| a级毛片黄视频| 国产淫语在线视频| 只有这里有精品99| 午夜福利视频精品| 高清在线视频一区二区三区| 制服丝袜香蕉在线| 亚洲av电影在线观看一区二区三区| 亚洲欧美日韩另类电影网站| 亚洲在久久综合| 国产 一区精品| 日本爱情动作片www.在线观看| 成人二区视频| 香蕉丝袜av| 亚洲成国产人片在线观看| 99久久精品国产国产毛片| 国产精品久久久av美女十八| 午夜福利网站1000一区二区三区| 精品第一国产精品| 久久久久久久大尺度免费视频| 亚洲国产日韩一区二区| 七月丁香在线播放| 久久久久国产精品人妻一区二区| 国产午夜精品一二区理论片| 香蕉国产在线看| av在线播放精品| 黑人巨大精品欧美一区二区蜜桃 | 国产精品99久久99久久久不卡 | 亚洲欧美色中文字幕在线| 满18在线观看网站| 免费大片18禁| 九九爱精品视频在线观看| 欧美最新免费一区二区三区| 国产激情久久老熟女| 97人妻天天添夜夜摸| 国产不卡av网站在线观看| av在线观看视频网站免费| 人人妻人人添人人爽欧美一区卜| 极品少妇高潮喷水抽搐| 亚洲第一区二区三区不卡| 2018国产大陆天天弄谢| 热re99久久精品国产66热6| 精品少妇黑人巨大在线播放| 我的女老师完整版在线观看| 免费黄色在线免费观看| 在线精品无人区一区二区三| 国产 一区精品| 欧美国产精品一级二级三级| 国产免费一区二区三区四区乱码| 婷婷成人精品国产| 久久久久久久久久人人人人人人| 国产精品人妻久久久影院| 久久久久精品性色| 欧美老熟妇乱子伦牲交| 欧美人与性动交α欧美精品济南到 | 热re99久久精品国产66热6| 免费大片黄手机在线观看| 搡女人真爽免费视频火全软件| 又黄又粗又硬又大视频| 亚洲欧美成人精品一区二区| 日韩制服骚丝袜av| 亚洲欧美日韩另类电影网站| 免费高清在线观看日韩| 一级毛片电影观看| 国产深夜福利视频在线观看| 亚洲精品自拍成人| 18禁在线无遮挡免费观看视频| 免费黄频网站在线观看国产| 日韩av不卡免费在线播放| 国产日韩一区二区三区精品不卡| 亚洲国产欧美日韩在线播放| 最近中文字幕2019免费版| 有码 亚洲区| 国产成人aa在线观看| 欧美老熟妇乱子伦牲交| 搡女人真爽免费视频火全软件| 中文字幕精品免费在线观看视频 | 色视频在线一区二区三区| 久久久久久人妻| 国产精品.久久久| av免费在线看不卡| 国产黄色视频一区二区在线观看| 久久女婷五月综合色啪小说| 久久久久人妻精品一区果冻| av在线app专区| 天天操日日干夜夜撸| 夫妻午夜视频| 自线自在国产av| 日本-黄色视频高清免费观看| 色哟哟·www| 婷婷成人精品国产| 边亲边吃奶的免费视频| 免费大片18禁| 亚洲国产看品久久| 久久精品久久久久久噜噜老黄| 亚洲av免费高清在线观看| kizo精华| 国产国语露脸激情在线看| 日本欧美国产在线视频| 伦精品一区二区三区| 国产成人91sexporn| 中文乱码字字幕精品一区二区三区| kizo精华| av又黄又爽大尺度在线免费看| 亚洲精品成人av观看孕妇| 成人免费观看视频高清| 成人18禁高潮啪啪吃奶动态图| 18禁观看日本| 18在线观看网站| 一二三四中文在线观看免费高清| 成人午夜精彩视频在线观看| 亚洲欧美成人综合另类久久久| 日本欧美国产在线视频| 国产一区二区激情短视频 | 国产精品久久久久成人av| 少妇被粗大的猛进出69影院 | 99热6这里只有精品| 国产欧美亚洲国产| 午夜久久久在线观看| 超碰97精品在线观看| 99视频精品全部免费 在线| √禁漫天堂资源中文www| 丝袜在线中文字幕| 亚洲激情五月婷婷啪啪| 热re99久久国产66热| 男人添女人高潮全过程视频| 亚洲美女视频黄频| 久久99热6这里只有精品| 亚洲成色77777| 少妇的逼好多水| 超碰97精品在线观看| 香蕉丝袜av| 美女xxoo啪啪120秒动态图| 老熟女久久久| 成人手机av| 最后的刺客免费高清国语| 国产精品国产av在线观看| 亚洲美女视频黄频| 妹子高潮喷水视频| 国产精品 国内视频| 91精品伊人久久大香线蕉| 人妻 亚洲 视频| 99热国产这里只有精品6| 色婷婷久久久亚洲欧美| 成人亚洲精品一区在线观看| 欧美日韩视频高清一区二区三区二| 国产日韩欧美亚洲二区| 哪个播放器可以免费观看大片| 亚洲av免费高清在线观看| 国产在线视频一区二区| 中文字幕最新亚洲高清| 夜夜爽夜夜爽视频| 精品一区二区免费观看| 国产精品久久久久久精品古装| 香蕉丝袜av| 日韩成人av中文字幕在线观看| 国产xxxxx性猛交| 亚洲天堂av无毛| 国内精品宾馆在线| 免费av不卡在线播放| 成人影院久久| 精品视频人人做人人爽| av片东京热男人的天堂| 欧美日韩亚洲高清精品| 视频在线观看一区二区三区| 欧美人与性动交α欧美软件 | 日韩欧美精品免费久久| 国产成人一区二区在线| av一本久久久久| 国产亚洲精品第一综合不卡 | 国产亚洲av片在线观看秒播厂| 免费人妻精品一区二区三区视频| 欧美日韩av久久| 波野结衣二区三区在线| 免费观看性生交大片5| 日韩电影二区| 精品一区二区三区四区五区乱码 | 寂寞人妻少妇视频99o| 久久99热这里只频精品6学生| 日韩精品免费视频一区二区三区 | 国产乱来视频区| 免费女性裸体啪啪无遮挡网站| 免费观看性生交大片5| 在线观看免费视频网站a站| 亚洲av成人精品一二三区| 亚洲精品第二区| 人体艺术视频欧美日本| 91精品伊人久久大香线蕉| a级片在线免费高清观看视频| 18禁裸乳无遮挡动漫免费视频| 欧美亚洲日本最大视频资源| 这个男人来自地球电影免费观看 | 一二三四中文在线观看免费高清| 高清视频免费观看一区二区| 黑人猛操日本美女一级片| 亚洲精品一区蜜桃| 日韩不卡一区二区三区视频在线| 美女视频免费永久观看网站| 国产精品 国内视频| 性色avwww在线观看| 国产探花极品一区二区| 欧美精品av麻豆av| 秋霞伦理黄片| 亚洲成国产人片在线观看| 女的被弄到高潮叫床怎么办| 在线观看免费日韩欧美大片| 少妇人妻精品综合一区二区| 亚洲av欧美aⅴ国产| 欧美日韩国产mv在线观看视频| 99re6热这里在线精品视频| 一级a做视频免费观看| 久久精品国产鲁丝片午夜精品| 国产精品偷伦视频观看了| 美女国产高潮福利片在线看| 天堂中文最新版在线下载| 久久 成人 亚洲| 国产成人一区二区在线| 成人18禁高潮啪啪吃奶动态图| 日韩视频在线欧美| 日韩三级伦理在线观看| 一个人免费看片子| 色婷婷av一区二区三区视频| 99久久人妻综合| 99精国产麻豆久久婷婷| 大片免费播放器 马上看| 国产探花极品一区二区| 色视频在线一区二区三区| 少妇被粗大的猛进出69影院 | 高清毛片免费看| 久久99蜜桃精品久久| 日韩 亚洲 欧美在线| 你懂的网址亚洲精品在线观看| 91在线精品国自产拍蜜月| 宅男免费午夜| 欧美国产精品一级二级三级| 久久狼人影院| 中文精品一卡2卡3卡4更新| 亚洲图色成人| 亚洲欧洲国产日韩| 免费黄网站久久成人精品| 国产一区二区三区av在线| 黄色视频在线播放观看不卡| 高清黄色对白视频在线免费看| 午夜老司机福利剧场| 看免费成人av毛片| xxxhd国产人妻xxx| 亚洲国产日韩一区二区| 一区二区三区四区激情视频| 亚洲,欧美,日韩| 国产片内射在线| 日韩视频在线欧美| 国产国拍精品亚洲av在线观看| 高清在线视频一区二区三区| av片东京热男人的天堂| 乱码一卡2卡4卡精品| 亚洲欧美成人综合另类久久久| 美女视频免费永久观看网站| 日本午夜av视频| 建设人人有责人人尽责人人享有的| 一级,二级,三级黄色视频| 亚洲国产色片| 精品福利永久在线观看| 男人爽女人下面视频在线观看| 插逼视频在线观看| 性色avwww在线观看| 成人亚洲精品一区在线观看| 大片免费播放器 马上看| 亚洲中文av在线| 一区二区三区四区激情视频| 女人久久www免费人成看片| 91在线精品国自产拍蜜月| 高清视频免费观看一区二区| 校园人妻丝袜中文字幕| 十八禁网站网址无遮挡| 久久久久久久精品精品| 国产在线视频一区二区| 久久国产亚洲av麻豆专区| 在线天堂中文资源库| 亚洲情色 制服丝袜| 国产又色又爽无遮挡免| 两个人看的免费小视频| 一本一本久久a久久精品综合妖精 国产伦在线观看视频一区 | 国产片内射在线| 人妻 亚洲 视频| 国产精品三级大全| 国产av一区二区精品久久| 色哟哟·www| 午夜福利乱码中文字幕| 亚洲精品国产色婷婷电影| h视频一区二区三区| 国产男女内射视频| 久久久欧美国产精品| 久久久久视频综合| 国产精品蜜桃在线观看| 男女边摸边吃奶| 咕卡用的链子| 看免费成人av毛片| 精品第一国产精品| 一区二区日韩欧美中文字幕 | 熟女人妻精品中文字幕| 国产av码专区亚洲av| 中文字幕av电影在线播放| 少妇的逼水好多| 2018国产大陆天天弄谢| 99热这里只有是精品在线观看| 午夜福利在线观看免费完整高清在| 又粗又硬又长又爽又黄的视频| 中文字幕免费在线视频6| 伊人亚洲综合成人网| 91精品伊人久久大香线蕉| 热99久久久久精品小说推荐| 精品久久久久久电影网| 国产成人欧美| 亚洲精品视频女| av不卡在线播放| 亚洲中文av在线| 久久人人爽av亚洲精品天堂| 日韩电影二区| 国产成人免费观看mmmm| 99热全是精品| 中文字幕人妻丝袜制服| 亚洲国产精品一区三区| 国产高清三级在线| 亚洲美女黄色视频免费看| 性色avwww在线观看| 久久亚洲国产成人精品v| 少妇人妻 视频| 国产片特级美女逼逼视频| 热99久久久久精品小说推荐| 伊人亚洲综合成人网| 国产成人免费无遮挡视频| 日韩欧美一区视频在线观看| 少妇人妻 视频| 国产乱来视频区| 国产熟女欧美一区二区| 美女xxoo啪啪120秒动态图| 精品亚洲乱码少妇综合久久| 日韩一本色道免费dvd| 欧美日韩国产mv在线观看视频| 久久亚洲国产成人精品v| 亚洲欧美成人综合另类久久久| 成年人午夜在线观看视频| 久久鲁丝午夜福利片| 久久久精品94久久精品| videos熟女内射| 精品国产乱码久久久久久小说| 丝瓜视频免费看黄片| 日日撸夜夜添| 精品一区二区三卡| 亚洲精品国产色婷婷电影| 人人妻人人爽人人添夜夜欢视频| 在线观看美女被高潮喷水网站| 免费大片黄手机在线观看| 亚洲婷婷狠狠爱综合网| 国产免费一级a男人的天堂| 一二三四在线观看免费中文在 | 老司机影院成人| 亚洲精品aⅴ在线观看| 亚洲五月色婷婷综合| 久久99精品国语久久久| 狠狠精品人妻久久久久久综合| 国产精品秋霞免费鲁丝片| 国产色爽女视频免费观看| 大片电影免费在线观看免费| 日韩成人伦理影院| 国精品久久久久久国模美| 大陆偷拍与自拍| 女性被躁到高潮视频| 日韩人妻精品一区2区三区| 少妇熟女欧美另类| 少妇被粗大猛烈的视频| 乱码一卡2卡4卡精品| 亚洲内射少妇av| 中国美白少妇内射xxxbb| xxxhd国产人妻xxx| 插逼视频在线观看| 欧美xxxx性猛交bbbb| 午夜av观看不卡| 九九爱精品视频在线观看| 久久久久视频综合| 亚洲精品一二三| 91在线精品国自产拍蜜月| 亚洲国产欧美在线一区| 久久久精品免费免费高清| 精品第一国产精品| 国产精品一区二区在线观看99| 久久国内精品自在自线图片| 男女边摸边吃奶| 国产精品久久久久久精品古装| 草草在线视频免费看| 夜夜爽夜夜爽视频| 青青草视频在线视频观看| 亚洲中文av在线| 欧美人与性动交α欧美软件 | 熟妇人妻不卡中文字幕| av片东京热男人的天堂| 新久久久久国产一级毛片| 免费在线观看黄色视频的| 成人二区视频| 男人操女人黄网站| 国产精品久久久久久久久免| 国产一区二区三区av在线| 麻豆精品久久久久久蜜桃| 男女边摸边吃奶| 欧美精品亚洲一区二区| 制服丝袜香蕉在线| 在线 av 中文字幕| 男女下面插进去视频免费观看 | 制服丝袜香蕉在线| 国产精品熟女久久久久浪| 国产精品久久久久久久电影| 青青草视频在线视频观看| a级片在线免费高清观看视频| 久久久精品94久久精品| 免费看不卡的av| 国产激情久久老熟女| 精品国产一区二区三区四区第35| 免费不卡的大黄色大毛片视频在线观看| 高清在线视频一区二区三区| 国产成人91sexporn| 乱人伦中国视频| 成人国产麻豆网| 久久久久久久国产电影| 久久精品久久久久久噜噜老黄| 如何舔出高潮| 看非洲黑人一级黄片| 国产精品蜜桃在线观看| 99热国产这里只有精品6| 久久久久久人人人人人| 婷婷色综合大香蕉| 妹子高潮喷水视频| 男人操女人黄网站| 久久久久久人人人人人| 又大又黄又爽视频免费| 纯流量卡能插随身wifi吗| 日韩伦理黄色片| 中文字幕亚洲精品专区| 26uuu在线亚洲综合色| 狠狠精品人妻久久久久久综合| 久久精品国产自在天天线| 久久久久久久国产电影| 久久久久视频综合| 一本一本久久a久久精品综合妖精 国产伦在线观看视频一区 | 咕卡用的链子| 亚洲一区二区三区欧美精品| 日韩制服丝袜自拍偷拍| 国产亚洲午夜精品一区二区久久| 国产一区二区激情短视频 | 午夜影院在线不卡| 制服人妻中文乱码| 老司机影院毛片| 少妇人妻精品综合一区二区| 久久这里只有精品19| 久久久精品免费免费高清| 国产成人免费无遮挡视频| 亚洲精品aⅴ在线观看| 飞空精品影院首页| 大码成人一级视频| 免费看光身美女| 2021少妇久久久久久久久久久| 免费高清在线观看视频在线观看| 国产日韩欧美亚洲二区| 在线观看国产h片| 亚洲成色77777| 51国产日韩欧美| 精品国产一区二区久久| 国产精品国产av在线观看| 亚洲高清免费不卡视频| 亚洲精品aⅴ在线观看| 97精品久久久久久久久久精品| 亚洲av国产av综合av卡| 国产无遮挡羞羞视频在线观看| 男人操女人黄网站| 国产无遮挡羞羞视频在线观看| 观看av在线不卡| 久久人人97超碰香蕉20202| 七月丁香在线播放| 一级爰片在线观看| 有码 亚洲区| 两个人免费观看高清视频| 精品久久国产蜜桃| 18禁国产床啪视频网站| 91在线精品国自产拍蜜月| 老司机影院毛片| 老司机影院成人| 久久久久久久久久久久大奶| 99热6这里只有精品| 亚洲av中文av极速乱| 美女视频免费永久观看网站| 人人妻人人澡人人看| av黄色大香蕉| 少妇的丰满在线观看| 久久国产精品男人的天堂亚洲 | 老女人水多毛片| 自拍欧美九色日韩亚洲蝌蚪91| 午夜福利乱码中文字幕| 欧美少妇被猛烈插入视频| 国产精品人妻久久久久久| 综合色丁香网| 国产白丝娇喘喷水9色精品| 亚洲综合精品二区| 成人毛片a级毛片在线播放| 最近的中文字幕免费完整| 中文欧美无线码| 免费黄网站久久成人精品| 日韩大片免费观看网站| 亚洲丝袜综合中文字幕| 久久久久人妻精品一区果冻| 国产一区二区三区综合在线观看 | 免费av不卡在线播放| 99久国产av精品国产电影| 亚洲精品自拍成人| 如何舔出高潮| 色吧在线观看| 日韩一区二区视频免费看| 人人澡人人妻人| videosex国产| 国产老妇伦熟女老妇高清| 1024视频免费在线观看| 如何舔出高潮| 日韩大片免费观看网站| 亚洲丝袜综合中文字幕| 天堂8中文在线网| 国产高清不卡午夜福利| 热re99久久精品国产66热6| 国产国拍精品亚洲av在线观看| 色94色欧美一区二区| 久久久精品区二区三区| 欧美精品国产亚洲| 亚洲经典国产精华液单| 激情视频va一区二区三区| 久久人人爽人人爽人人片va| 亚洲成色77777| 啦啦啦啦在线视频资源| 国产成人精品婷婷| 夫妻性生交免费视频一级片| 妹子高潮喷水视频| 国产精品三级大全| 美女脱内裤让男人舔精品视频| 国产精品久久久久久久久免| 丰满乱子伦码专区|