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    DSC和同步輻射寬角XRD法研究丹皮酚在脂質(zhì)體疏水尾鏈區(qū)的包封位置及對膜流動(dòng)性的影響

    2017-11-16 07:36:25魏田田郭皓月周洪偉鄔瑞光
    中醫(yī)藥信息 2017年6期
    關(guān)鍵詞:添加物丹皮X光

    魏田田,郭皓月,周洪偉,鄔瑞光*

    (1.北京中醫(yī)藥大學(xué)中藥學(xué)院,北京 100102;2.清華大學(xué)化學(xué)系,生命有機(jī)磷化學(xué)與化學(xué)生物學(xué)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,北京 100084;3.中國中醫(yī)科學(xué)院,中醫(yī)臨床基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)研究所,北京 100700)

    中藥研究

    DSC和同步輻射寬角XRD法研究丹皮酚在脂質(zhì)體疏水尾鏈區(qū)的包封位置及對膜流動(dòng)性的影響

    魏田田1,郭皓月2,周洪偉3,鄔瑞光1*

    (1.北京中醫(yī)藥大學(xué)中藥學(xué)院,北京 100102;2.清華大學(xué)化學(xué)系,生命有機(jī)磷化學(xué)與化學(xué)生物學(xué)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,北京 100084;3.中國中醫(yī)科學(xué)院,中醫(yī)臨床基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)研究所,北京 100700)

    目的:研究丹皮酚在脂質(zhì)體疏水尾鏈區(qū)的包封位置及對膜流動(dòng)性的影響,進(jìn)而探討其抗氧化作用機(jī)制。方法:薄膜分散法制備丹皮酚脂質(zhì)體,采用差示掃描量熱法(DSC)研究丹皮酚對脂質(zhì)體膜主相變的影響,進(jìn)而探討丹皮酚在脂質(zhì)體疏水尾鏈的包封位置,采用同步輻射寬角X光衍射法(XRD)研究丹皮酚對液晶態(tài)的脂質(zhì)體膜疏水尾鏈間距的影響,進(jìn)而探討其對膜流動(dòng)性的影響及與抗氧化作用機(jī)制的關(guān)聯(lián)。結(jié)果:DSC結(jié)果表明,隨著丹皮酚濃度的增大,脂質(zhì)體的主相變溫度逐漸降低,半峰寬逐漸增大,同步輻射寬角X光衍射結(jié)果表明與液晶態(tài)的空白脂質(zhì)體相比,丹皮酚的包封增大了磷脂分子疏水尾鏈之間的距離。結(jié)論:丹皮酚分子主要作用在磷脂分子疏水尾鏈的C1~C9的位置;丹皮酚的包封可以增加液晶態(tài)膜尾鏈的無序度,從而提高膜的流動(dòng)性,這是其發(fā)揮抗氧化作用可能的作用機(jī)制。

    差示掃描量熱;同步輻射寬角X光衍射;丹皮酚;脂質(zhì)體;包封位置;膜流動(dòng)性;抗氧化

    丹皮酚(結(jié)構(gòu)式見圖1)又稱牡丹酚,是中藥牡丹皮和徐長卿的主要活性成分,其藥理活性廣泛,臨床多用于心、腦血管、腫瘤、炎癥、變態(tài)反應(yīng)和免疫系統(tǒng)等疾病[1]。但丹皮酚在水中溶解度很低且易揮發(fā),見光易氧化分解,在臨床應(yīng)用中受到制約[2],將其制成脂質(zhì)體不僅可以提高丹皮酚的生物利用度,還可以提高其靶向性,增強(qiáng)療效。

    脂質(zhì)體是脂質(zhì)分子分散在水中自組裝形成的囊泡,主要組成成分是磷脂,脂質(zhì)體膜中常用的磷脂是二棕櫚酰磷脂酰膽堿(DPPC,結(jié)構(gòu)式見圖1),磷脂雙分子層構(gòu)成了細(xì)胞膜的基本支架,因此,脂質(zhì)體可以用作生物膜的模型膜[3]。Nunes[4]等以脂質(zhì)體模擬細(xì)胞膜研究了五種非甾體抗炎藥對細(xì)胞膜的擾動(dòng)作用,揭示了非甾體抗炎藥可能的作用機(jī)制。脂質(zhì)體膜隨著溫度的變化可能呈現(xiàn)晶體相、層狀凝膠相、波動(dòng)凝膠相和液晶相等不同的相態(tài)[5],外源物質(zhì)的加入將影響脂質(zhì)體的相轉(zhuǎn)變,使膜的流動(dòng)性發(fā)生改變。細(xì)胞膜的流動(dòng)性是細(xì)胞膜重要的生物物理特征,膜流動(dòng)性的改變將影響各種膜功能,如物質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)、信息傳遞及膜上酶的活性等[6]。

    課題組前期已經(jīng)用差示掃描量熱(DSC)法及同步輻射小角X光衍射法研究了丹皮酚和DPPC的相互作用[3]以及丹皮酚、膽固醇與DPPC之間的競爭性相互作用[7]。藥物在脂質(zhì)體中可能包封于DPPC分子的膽堿部位、甘油骨架部位及疏水尾鏈部位,疏水尾鏈區(qū)又分為C1~C9區(qū)和C10~C16區(qū)[8]。包封于磷脂分子的不同位置對膜流動(dòng)性的影響也不同。本文采用差示掃描量熱(DSC)法結(jié)合同步輻射寬角X光衍射方法研究丹皮酚在脂質(zhì)體疏水尾鏈區(qū)中的包封部位及對液晶態(tài)膜流動(dòng)性的影響,并探討其與丹皮酚抗氧化作用的關(guān)聯(lián)性。

    圖1 丹皮酚和DPPC的結(jié)構(gòu)式

    1 儀器與試藥

    1.1 儀器

    821e型差示掃描量熱儀 (瑞士梅特勒-托利多公司);同步輻射X光衍射實(shí)驗(yàn)裝置(北京同步輻射國家實(shí)驗(yàn)室1W2A站);XSE105DU型電子天平(瑞士梅特勒-托利多公司);EHEIM型變溫附件(英國Linkam公司);RE-52AA型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀(上海亞榮);DZF6050型真空干燥設(shè)備(上海一恒)。

    1.2 試藥

    二棕櫚酰磷脂酰膽堿(DPPC,美國Sigma公司,純度>99%);丹皮酚(美國Sigma公司,純度>99%);其他國產(chǎn)試劑均為分析純。

    2 方法與結(jié)果

    2.1 丹皮酚脂質(zhì)體的制備

    參照文獻(xiàn)[9]的方法制備脂質(zhì)體:按計(jì)量比例稱取DPPC和丹皮酚,溶解于氯仿中,通過旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)以除去氯仿至燒瓶內(nèi)壁形成薄膜,真空干燥箱中過夜以除去殘留的有機(jī)溶劑;加入過量的Tris-HCl(pH=7.4)緩沖溶液,置于60℃水浴1 h,旋渦混合1 min,室溫20 min,旋渦混合1 min,如此反復(fù)3次,至體系均勻分散。

    2.2 差示掃描量熱實(shí)驗(yàn)

    采用高靈敏度傳感器HSS7,實(shí)驗(yàn)氣氛為 N2,以空白坩堝做參比。為了保證樣品在升溫過程中處于相平衡的狀態(tài),選擇較低的升溫速率1 ℃/min。實(shí)驗(yàn)結(jié)果見圖2與表1。

    圖2 含不同摩爾百分比丹皮酚的脂質(zhì)體的DSC曲線

    丹皮酚摩爾百分比主相變相變溫度(℃)半峰寬(℃)相變焓(J/g)042.80.642.181040.71.342.722040.41.945.242539.82.143.90

    圖2所示為空白DPPC和丹皮酚含量不同的DPPC脂質(zhì)體膜的DSC曲線。空白DPPC脂質(zhì)體膜的DSC曲線顯示兩個(gè)峰,第一個(gè)峰峰形平緩且峰面積小,相變溫度為36.6℃,對應(yīng)預(yù)相變(Lβ′to Pβ′);第二個(gè)峰峰形尖銳且峰面積較大,相變溫度為42.8℃,對應(yīng)主相變(Pβ′to Lα)。這一結(jié)果與文獻(xiàn)報(bào)導(dǎo)的空白DPPC脂質(zhì)體的相變溫度一致[10-11]。由表1可知,與空白脂質(zhì)體相比,隨著丹皮酚濃度的增大,含藥脂質(zhì)體主相變溫度逐漸減小,半峰寬ΔT1/2逐漸增大,相變焓先增大后減小。

    2.3 同步輻射寬角XRD實(shí)驗(yàn)

    在實(shí)驗(yàn)過程中使用可以程序控溫的Linkam變溫附件(英國Linkam公司)對樣品進(jìn)行溫度控制。衍射波長為1.54 ?,樣品與檢測器的距離為246 mm,曝光時(shí)間為120 s。衍射圖像用Fit2D軟件(http://www.esrf.eu/computing/scientific/FIT2D/)處理以得到衍射強(qiáng)度與倒置距離s之間的二維衍射曲線,由倒置間距s可求得反映磷脂分子尾鏈有序度的尾鏈間距d(d=1/s)。

    脂質(zhì)體可以用作細(xì)胞膜的模型膜。細(xì)胞膜適當(dāng)?shù)牧鲃?dòng)性是保證細(xì)胞功能的關(guān)鍵。生理溫度下的細(xì)胞膜是液晶態(tài)的,因此在模擬細(xì)胞膜時(shí)應(yīng)使脂質(zhì)體處于液晶態(tài)。根據(jù)圖2和表1所示,空白脂質(zhì)體和各含藥脂質(zhì)體在45℃時(shí)都處于液晶相。因此本實(shí)驗(yàn)進(jìn)行了45℃下各樣品的同步輻射寬角X光衍射實(shí)驗(yàn)。 結(jié)果見圖3及表2。

    圖3 45℃含不同摩爾百分比丹皮酚的脂質(zhì)體的同步輻射寬角衍射曲線

    丹皮酚摩爾百分比倒置間距(nm-1)尾鏈間距(nm)02.28180.438102.20230.454202.20230.454252.20230.454

    由表2的數(shù)據(jù)可知,與空白脂質(zhì)體相比,各含藥脂質(zhì)體的磷脂分子尾鏈間距都有明顯增加,說明丹皮酚的包封可以增加處于液晶相的脂質(zhì)體膜中磷脂分子尾鏈排列的無序度,磷脂分子尾鏈排列無序度的提高將使其流動(dòng)性增加。

    3 討論

    在空白DPPC脂質(zhì)體的DSC曲線上通??梢钥吹絻蓚€(gè)吸熱峰,峰形平緩且峰面積較小的是預(yù)相變,反映了層狀凝膠相到波動(dòng)凝膠相(Lβ′to Pβ′)的轉(zhuǎn)變,來源于磷脂分子中極性端的熱運(yùn)動(dòng);峰形尖銳且峰面積較大的是主相變,反映了波動(dòng)凝膠相到液晶相(Pβ′to Lα)的轉(zhuǎn)變,來源于磷脂分子中碳?xì)滏湹娜廴赱12]。DSC曲線的主相變溫度、相變焓、半峰寬的增減變化可以用于推測脂質(zhì)體膜結(jié)構(gòu)性質(zhì)的改變及藥物在脂質(zhì)體中的包封位置。

    同步輻射寬角X光衍射實(shí)驗(yàn)可以得到脂質(zhì)體中磷脂分子疏水尾鏈之間的距離,而疏水尾鏈距離的增大可以表征磷脂分子尾鏈無序度的增大,從而反映脂質(zhì)體膜流動(dòng)性的增大。

    3.1 丹皮酚對脂質(zhì)體膜主相變的影響及藥物的包封位置

    主相變來源于磷脂分子中碳?xì)滏湹娜廴赱12],表1表明丹皮酚脂質(zhì)體主相變溫度隨丹皮酚濃度的增大整體呈下降的趨勢,說明丹皮酚進(jìn)入脂質(zhì)體膜的疏水區(qū)。脂質(zhì)體的DSC曲線是外源物質(zhì)對磷脂影響的宏觀表現(xiàn),Jain等研究了多種脂溶性添加物對DPPC脂質(zhì)體的DSC曲線的影響,總結(jié)了根據(jù)加入添加物后脂質(zhì)體主相變的DSC吸熱峰的變化來推測添加物在脂質(zhì)體中包封位置的規(guī)律[8]:若半峰寬增大,峰尖移動(dòng),則添加物主要作用于DPPC分子的C1~C9位置;若峰形上出現(xiàn)小臺(tái)階,且小臺(tái)階下的面積隨添加物濃度的增加而增加(但總面積不變),則添加物主要作用于DPPC分子的甘油骨架位置;若峰尖不發(fā)生移動(dòng),但峰的起始溫度和終止溫度發(fā)生變化,則添加物主要作用于DPPC分子的C10~C16位置;若加入添加物后DSC曲線出現(xiàn)新的峰,且新峰的面積隨添加物濃度的增加而增加,則添加物主要作用于DPPC分子的膽堿位置。在本實(shí)驗(yàn)中,隨著脂質(zhì)體中丹皮酚濃度增加,DSC曲線中主相變的峰形變寬,峰尖位置發(fā)生了移動(dòng),根據(jù)Jain探索的規(guī)律,丹皮酚應(yīng)主要作用在DPPC尾鏈的C1~C9的位置,如圖4所示。

    圖4 丹皮酚分子在脂質(zhì)體疏水尾鏈中的包封位置示意圖

    3.2 丹皮酚對膜流動(dòng)性的影響與其抗氧化性的關(guān)聯(lián)

    在脂質(zhì)過氧化過程中,自由基氧化多不飽和脂肪酸為飽和脂肪酸,降低了細(xì)胞膜的流動(dòng)性。Wassall等的研究表明,脂質(zhì)過氧化作用更容易發(fā)生在流動(dòng)性較低(有序度較大)的模型膜[13]。磷脂膜的流動(dòng)性的增加將使之不易被氧化[14]。本實(shí)驗(yàn)同步輻射寬角X光衍射結(jié)果表明丹皮酚的包封可以增加處于液晶相的脂質(zhì)體膜中磷脂分子尾鏈的流動(dòng)性,據(jù)此推測丹皮酚可能通過提高細(xì)胞膜的流動(dòng)性發(fā)揮抗氧化作用。

    包封率是脂質(zhì)體制劑的關(guān)鍵指標(biāo)之一。搞清楚藥物與脂質(zhì)分子的相互作用機(jī)制及藥物在脂質(zhì)體中的作用位置對于開發(fā)具有高包封率的脂質(zhì)體意義重大。本研究對于進(jìn)一步深入探索藥物在脂質(zhì)體中與輔料分子的作用位點(diǎn)、對于設(shè)計(jì)具有高包封率的含藥脂質(zhì)體具有重要的意義。

    [1] 郭齊,李貽奎,王志國,等.丹皮酚藥理研究進(jìn)展[J].中醫(yī)藥信息,2009,26(1):20-22.

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    EncapsulatingLocationofPaeonolinHydrophobicTailChainofLiposomesandItsEffectontheMembraneFluidity:StudywithDSCandSynchrotronWide-angleXRDMethods

    WEI Tian-tian1, GUO Hao-yue2, ZHOU Hong-wei3, WU Rui-guang1*

    (1.SchoolofChineseMateriaMedica,BeijingUniversityofChineseMedicine,Beijing100102,China; 2.KeyLaboratoryofBio-organicPhosphorousChemistryandChemicalBiology(MinistryofEducation),TsinghuaUniversity,Beijing100084,China; 3.InstituteofBasicResearchinClinicalMedicine,ChinaAcademyofChineseMedicalSciences,Beijing100700,China)

    Objective: To study the encapsulating location of paeonol in hydrophobic tail chain of liposomes and its effect on membrane fluidity to disclose the mechanism of the antioxidant effect of paeonol. Methods: Liposomes were prepared by film dispersion method. Differential scanning calorimetry(DSC) was employed to investigate the effect of paeonol on the main transition of liposomes and to disclose the encapsulating location of paeonol in liposomes. Synchrotron wide-angle X-ray diffraction(XRD) technique was employed to investigate the effect of paeonol on the distance between hydrophobic tail chain and its effect on the membrane fluidity of liposomes existing as liquid-crystalline phase. Furthermore, the relationship between XRD results and the mechanism of the antioxidant effect of paeonol was investigated. Results: The DSC results showed that the temperature of main transition decreases and the half-height width of DSC peaks increased with increased concentration of paeonol. The wide-angle X-ray diffraction results showed that the distance between hydrophobic chains of phospholipid molecules of paeonol encapsulated liposomes was larger than that of blank liposome. Conclusion: The location site of paeonol at the tail chains of DPPC was C1~C9. The incorporation of paeonol into liposomes can increase the disorder of the tail chains of DPPC and improve the fluidity of the membrane, which may be one of the mechanisms of the antioxidant effect of paeonol.

    DSC; Synchrotron wide-angle XRD; Paeonol; Liposomes; Encapsulating location; Membrane fluidity; Antioxidant effect

    R28

    A

    1002-2406(2017)06-0001-04

    國家自然科學(xué)基金項(xiàng)目(No.81773916);北京市自然科學(xué)基金項(xiàng)目(No.7153171);北京中醫(yī)藥大學(xué)基本科研業(yè)務(wù)費(fèi)資助項(xiàng)目(No.2017-JYB-JS-155,2017-JYB-XS-093)

    魏田田(1991-),女,北京中醫(yī)藥大學(xué)2015級碩士研究生。

    鄔瑞光*(1975-),男,博士,副教授,碩士研究生導(dǎo)師,主要研究方向:中藥制劑新技術(shù)與新劑型。

    2017-09-13

    修回日期:2017-10-01

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