角質(zhì)細(xì)胞生長(zhǎng)因子對(duì)人齦上皮細(xì)胞在鈦金屬表面附著的影響

劉延豐　李艷娥

【摘要】 目的：探討角質(zhì)細(xì)胞生長(zhǎng)因子（KGF）對(duì)人齦上皮細(xì)胞在鈦金屬表面附著的影響效果。方法：取阻生牙拔除術(shù)患者的健康齦組織塊，經(jīng)過(guò)相關(guān)處理獲取齦上皮細(xì)胞，將該細(xì)胞在純鈦片表面接種，在重組KGF濃度調(diào)配下處理，進(jìn)而計(jì)數(shù)純鈦片表面附著的細(xì)胞數(shù)，測(cè)定純鈦片表面細(xì)胞的粘附力，比較接種后6 h、1 d、5 d、10 d、15 d時(shí)不同KGF濃度下純鈦片表面附著的齦上皮細(xì)胞數(shù)目，記錄KGF濃度1 ng/mL與5 ng/mL在培養(yǎng)1 d、10 d時(shí)齦上皮細(xì)胞在純鈦片表面粘附力與平均熒光強(qiáng)度（AFI）。結(jié)果：接種后同一時(shí)間點(diǎn)，隨著KGF濃度升高，齦上皮細(xì)胞數(shù)目明顯增多（P<0.05），同一KGF濃度下，隨著接種時(shí)間延長(zhǎng)，齦上皮細(xì)胞數(shù)目明顯增多（P<0.05）；KGF濃度1 ng/mL與5 ng/mL時(shí)，培養(yǎng)1 d與10 d時(shí)齦上皮細(xì)胞在純鈦片表面粘附力與AFI比較，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05），培養(yǎng)10 d時(shí)更高。結(jié)論：隨著KGF濃度升高、接種與培養(yǎng)時(shí)間延長(zhǎng)，齦上皮細(xì)胞數(shù)目明顯增加，而且附著力也會(huì)隨著KGF濃度升高而升高，在時(shí)間-濃度變化中，AFI也呈現(xiàn)隨之增高趨勢(shì)，可見(jiàn)KGF對(duì)人齦上皮細(xì)胞在鈦金屬表面附著影響較大，需加強(qiáng)重視。

【關(guān)鍵詞】 角質(zhì)細(xì)胞生長(zhǎng)因子； 人齦上皮細(xì)胞； 鈦金屬； 表面附著； 接種

Effects of Keratinocyte Growth Factor on Adhesion of Human Gingival Epithelial Cells on Titanium Surface/LIU Yan-feng，LI Yan-e.//Medical Innovation of China，2017，14（30）：051-054

【Abstract】 Objective：To investigate the effect of keratinocyte growth factor（KGF） on adhesion of human gingival epithelial cells on titanium surface.Method：The gingival epithelial cells were obtained from the patients with impacted teeth，and the gingival epithelial cells were obtained by related treatment，they were inoculated on the surface of pure titanium sheets，processed under the concentration of recombinant KGF，the number of cells attached to the surface of pure titanium sheets was counted，and the adhesion force of the cells on the surface of pure titanium sheets was measured.The number of gingival epithelial cells adhered to pure titanium slices at different concentrations of KGF at 6 h，1 d，5 d，10 d and 15 d after inoculation were compared，the adhesive force and average fluorescence intensity（AFI） of gingival epithelial cells on pure titanium sheets at l ng/mL and 5 ng/mL of KGF concentration at 1 d and 10 d were recorded.Result：At the same time point after inoculation，the number of gingival epithelial cells increased significantly with the increase of KGF concentration（P<0.05）.At the same KGF concentration，the data of gingival epithelial cells increased significantly with the extension of inoculation time（P<0.05）.When the concentration of KGF was 1 ng/mL and 5 ng/mL，the adhesion force and AFI of gingival epithelial cells on pure titanium surface were compared at 1 d and 10 d，the differences were statistically significant（P<0.05），and the higher at 10 d.Conclusion：With the increase of KGF concentration，inoculation and incubation time，the number of gingival epithelial cells increased significantly，and the adhesion also increased with the increase of KGF concentration，in the time-concentration change，AFI also showed a trend of increasing，it showed that KGF had a great influence on the attachment of human gingival epithelial cells on the surface of titanium，so we should pay more attention to it.endprint

【Key words】 Keratinocyte growth factor； Human gingival epithelial cell； Titanium； Surface attachment； Inoculation

First-authors address：Stomatological Hospital of Jiangmen City，Jiangmen 529000，China

doi：10.3969/j.issn.1674-4985.2017.30.015

種植體表面的上皮附著是種植牙成功的關(guān)鍵。阻生齒拔除后口腔表面上皮可能往牙面爬行生長(zhǎng)，而且重新分化結(jié)合生皮，或者出現(xiàn)新的結(jié)合上皮，并可分泌出基底膜，形成新的上皮附著，稱之為上皮再附著，組織主要源于口腔齦上皮[1-3]。隨著人們對(duì)齦上皮細(xì)胞的了解增多，臨床對(duì)其興趣也逐漸增加，尤其是其在鈦金屬表面的附著情況[4-6]。角質(zhì)細(xì)胞生長(zhǎng)因子（KGF）被證實(shí)有著促進(jìn)上皮細(xì)胞增生的效果[7-9]，為了進(jìn)一步探討KGF對(duì)人齦上皮細(xì)胞在鈦金屬表面附著的影響情況，本文進(jìn)行了如下研究，現(xiàn)報(bào)道如下。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞來(lái)源與鑒定

1.1.1 來(lái)源 選擇阻生齒拔除患者健康齦組織塊，利用4 ℃、0.25%分離酶進(jìn)行16 h作用，分離齦上皮組織及其下結(jié)締組織，采取0.125%胰酶消化上皮片形成一種單一的人齦上皮細(xì)胞單細(xì)胞懸液，進(jìn)行體外原代培養(yǎng)、傳代培養(yǎng)，每天利用倒置顯微鏡對(duì)其細(xì)胞形態(tài)實(shí)施觀察與記錄。

1.1.2 鑒定 傳代培養(yǎng)第10天，取長(zhǎng)齦上皮細(xì)胞的蓋玻片實(shí)施抗角蛋白免疫組化染色處理，其中一抗選擇1∶500的兔抗人角蛋白多克隆抗體，二抗體選擇生物素標(biāo)記的鼠抗兔IgG。此外，取分離酶處理前后的齦上皮組織實(shí)施HE染色，將分離酶作用后的組織采取抗角蛋白免疫組化染色。本次研究中染色必須按照細(xì)胞的形態(tài)與抗角蛋白處理，確認(rèn)最終培養(yǎng)所得的細(xì)胞為齦上皮細(xì)胞。

1.2 細(xì)胞接種與濃度調(diào)配

1.2.1 細(xì)胞接種 將純鈦片打磨成和ITI種植體頸部光滑度相似的情況，而且表面的粗糙程度也要和ITI種植體頸部表面粗糙程度相同（采取粗糙度測(cè)量?jī)x測(cè)定）。將消毒后備用的純鈦片放置在24孔板上進(jìn)行培養(yǎng)。

1.2.2 濃度調(diào)配 純鈦片上接種的細(xì)胞濃度初始為1×106/mL，每片純鈦片表面滴入100 μL細(xì)胞懸液，靜置2 h后將0.9 mL培養(yǎng)液加入其中，然后加入不同劑量的角質(zhì)細(xì)胞生長(zhǎng)因子，將細(xì)胞因子最終濃度控制在5個(gè)水平進(jìn)行常規(guī)培養(yǎng)，包括0、1、5、10、50 ng/mL。

1.3 細(xì)胞數(shù)計(jì)數(shù) 在細(xì)胞接種后6 h、1 d、5 d、10 d、15 d將純鈦片取出，進(jìn)行PBS沖洗，利用計(jì)算機(jī)圖像進(jìn)行系統(tǒng)分析，計(jì)算每平方毫米純鈦片表面黏附的細(xì)胞數(shù)目，各個(gè)時(shí)間點(diǎn)、不同的濃度情況下均抽取樣品15個(gè)進(jìn)行計(jì)數(shù)，最終數(shù)據(jù)為均值。

1.4 粘附力測(cè)定 從細(xì)胞接種開(kāi)始后第1天、第10天分別將培養(yǎng)液取出1 ng/mL與5 ng/mL濃度的角質(zhì)細(xì)胞生長(zhǎng)因子，進(jìn)行PBS沖洗后，利用細(xì)胞微管吸吮系統(tǒng)對(duì)單個(gè)齦上皮細(xì)胞在純鈦片上的粘附力進(jìn)行測(cè)定，不同濃度下取樣本5個(gè)，每個(gè)樣本進(jìn)行2個(gè)細(xì)胞測(cè)定。

1.5 熒光強(qiáng)度測(cè)定 接種第1天、第10天取培養(yǎng)液濃度1 ng/mL與5 ng/mL的純鈦片，實(shí)施PBS沖洗后以0.15%胰酶消化，收集細(xì)胞并調(diào)整其濃度到1×104/mL，將兔抗人層粘連蛋白單抗與鼠抗兔FITC標(biāo)記熒光抗體，測(cè)定平均熒光強(qiáng)度（AFI），不同濃度下取樣本10個(gè)。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS 19.0軟件對(duì)所得數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，計(jì)量資料用（x±s）表示，兩兩比較采用t檢驗(yàn)，多組比較采用F檢驗(yàn)；計(jì)數(shù)資料以率（%）表示，比較采用 字2檢驗(yàn)。以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 不同時(shí)間、不同KGF濃度下純鈦片表面人齦上皮細(xì)胞附著數(shù)目比較 接種后同一時(shí)間點(diǎn)，隨著KGF濃度升高，齦上皮細(xì)胞數(shù)目明顯增多（P<0.05），同一KGF濃度下，隨著接種時(shí)間延長(zhǎng)，齦上皮細(xì)胞數(shù)目明顯增多（P<0.05），見(jiàn)表1。

2.2 齦上皮細(xì)胞在KGF濃度1 ng/mL與5 ng/mL時(shí)培養(yǎng)1 d與10 d時(shí)純鈦片表面粘附力與AFI比較 KGF濃度1 ng/mL與5 ng/mL時(shí)培養(yǎng)1 d與10 d時(shí)齦上皮細(xì)胞在純鈦片表面粘附力與AFI比較，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05），培養(yǎng)10 d時(shí)更高，見(jiàn)表2。

3 討論

1987年國(guó)外學(xué)者提出表面賽跑理論，指出組織細(xì)胞與細(xì)菌在生物材料表面會(huì)出現(xiàn)競(jìng)爭(zhēng)性附著，若組織細(xì)胞先附著在生物材料表面，則組織-材料界面則是由完整細(xì)胞膜、細(xì)胞活力、多糖、宿主功能性防御抵抗細(xì)菌進(jìn)行粘附，反之若細(xì)菌先附著，則會(huì)誘發(fā)感染，而且細(xì)胞難以再與生物材料附著[10-13]。牙科種植體屬于比較常用的方式，植入后，表面會(huì)有菌叢附著，若齦上皮細(xì)胞無(wú)法在種植體表面形成粘附，便可能造成周圍炎，甚至導(dǎo)致種植體失敗?？梢?jiàn)，齦上皮細(xì)胞在種植體表面早期粘附是種植體成功關(guān)鍵，研究發(fā)現(xiàn)，KGF特異刺激上皮細(xì)胞的增殖與分化可能會(huì)促進(jìn)其早期粘附[14-16]。

在本文中針對(duì)角質(zhì)細(xì)胞生長(zhǎng)因子對(duì)人齦上皮細(xì)胞在鈦金屬表面附著影響情況進(jìn)行了分析，取阻生牙拔除術(shù)患者的健康齦組織塊，經(jīng)過(guò)相關(guān)處理獲取齦上皮細(xì)胞，將該細(xì)胞在純鈦片表面接種與重組人角質(zhì)細(xì)胞生長(zhǎng)因子濃度調(diào)配下處理，進(jìn)而計(jì)數(shù)純鈦片表面附著的細(xì)胞數(shù)，測(cè)定純鈦片表面細(xì)胞的粘附力，本文研究結(jié)果顯示：接種后同一時(shí)間點(diǎn)，隨著KGF濃度升高，齦上皮細(xì)胞數(shù)目明顯增多（P<0.05），同一KGF濃度下，隨著接種時(shí)間延長(zhǎng)，齦上皮細(xì)胞數(shù)目明顯增多（P<0.05）；KGF濃度1 ng/mL與5 ng/mL時(shí)培養(yǎng)1 d與10 d時(shí)齦上皮細(xì)胞在純鈦片表面粘附力與AFI比較，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05），培養(yǎng)10 d時(shí)更高。角質(zhì)細(xì)胞生長(zhǎng)因子屬于成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子家族成員之一，有著163個(gè)氨基酸殘基的單鏈多肽，和靶細(xì)胞膜特異性受體結(jié)合后會(huì)發(fā)揮自身的生物學(xué)作用[17]。上皮細(xì)胞有合成與分泌角質(zhì)蛋白的作用，其鑒定方法之一為抗角蛋白免疫組化染色[18]。在本次研究中細(xì)胞抗角蛋白免疫組化染色結(jié)果為陽(yáng)性，細(xì)胞質(zhì)呈現(xiàn)棕黃色，在細(xì)胞內(nèi)的顆粒狀（陽(yáng)性）可認(rèn)為是齦上皮細(xì)胞，從而使得結(jié)果更可靠。本研究結(jié)果顯示，隨著時(shí)間推移、濃度升高，鈦金屬表面附著的KGF數(shù)目會(huì)明顯增多，而且附著粘附力也會(huì)增加，F(xiàn)AI也會(huì)升高。但在一些研究中指出，接種15 d時(shí)，隨著KGF濃度升高，附著的細(xì)胞數(shù)目略微增多，顯示有一定的維持增殖能力，但過(guò)度增殖會(huì)造成上皮細(xì)胞根向遷移，使得骨界面形成出現(xiàn)破壞，反而不利于種植體融合[19-20]。endprint

綜上所述，隨著KGF濃度升高、接種與培養(yǎng)時(shí)間延長(zhǎng)，齦上皮細(xì)胞數(shù)目明顯增加，而且附著力也會(huì)隨著KGF濃度升高而升高，在時(shí)間-濃度變化中，AFI也呈現(xiàn)隨之增高趨勢(shì)，可見(jiàn)KGF對(duì)人齦上皮細(xì)胞在鈦金屬表面附著影響較大，需加強(qiáng)重視。

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（收稿日期：2017-09-12） （本文編輯：董悅）endprint