MYH9蛋白在胃癌中的表達(dá)及其臨床意義

劉曉平+吳平輝+周小青

【摘要】 目的：探討MYH9蛋白在胃癌組織中的表達(dá)及其臨床意義。方法：應(yīng)用免疫組化及Western blot法檢測(cè)胃癌及癌旁組織中MYH9蛋白的表達(dá)水平，分析其臨床病理參數(shù)之間的關(guān)系。結(jié)果：MYH9蛋白在胃癌組織中的表達(dá)顯著高于癌旁組織（P<0.05）。胃癌組織MYH9蛋白的表達(dá)在Ⅲ～Ⅳ期明顯高于Ⅰ～Ⅱ期（P=0.009），淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移胃癌的MYH9蛋白表達(dá)明顯高于無(wú)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移 （P=0.019）。結(jié)論：MYH9蛋白在胃癌組織中表達(dá)增高，參與了腫瘤的轉(zhuǎn)移過(guò)程。

【關(guān)鍵詞】 胃癌； MYH9； 免疫組化

【Abstract】 Objective：To investigate the expression and clinical significance of MYH9 protein in human gastric carcinoma.Method：The expression of MYH9 in gastric carcinoma and paraneoplastic were evaluated by immunohistochemical and Western blot，then analyzed its association with clinical pathology.Result：The expression of MYH9 in gastric carcinoma was higher than paraneoplastic（P<0.05）.The expression of MYH9 protein in stage Ⅲ-Ⅳ of gastric cancer tissues was significantly higher than that of stage Ⅰ-Ⅱ（P=0.009） and the expression of MYH9 protein in lymph node metastasis of gastric cancer was significantly higher than that of without lymph node metastasis （P=0.019）.Conclusion：Higher expression of MYH9 in gastric carcinoma may play an important role in tumor metastasis.

【Key words】 Gastric carcinoma； MYH9； Immunohistochemical

First-authors address：The First Affiliated Hospital of Gannan Medical University，Ganzhou 341000，China

doi：10.3969/j.issn.1674-4985.2017.29.010

胃癌是全球最常見的腫瘤之一，我國(guó)是胃癌的高發(fā)區(qū)，發(fā)病率和死亡率居第二位和第三位，明顯高于世界平均水平[1-3]。目前胃癌的診斷和治療已經(jīng)取得很大進(jìn)步，而其發(fā)病率和死亡率仍無(wú)明顯降低，主要原因是胃癌常發(fā)生侵襲和轉(zhuǎn)移，且治療后容易復(fù)發(fā)。胃癌發(fā)生轉(zhuǎn)移的病因受環(huán)境因素及多種分子基因的調(diào)控。非肌性肌球蛋白重鏈-9基因（myosin heavy chain 9，nonmuscle，MYH9）定位于人染色體22q13.1，表達(dá)產(chǎn)物是非肌性肌球蛋白Ⅱ（non-muscle myosin Ⅱ，NMⅡ），屬于肌球蛋白（myosin）超家族[4]。MYH9在細(xì)胞極化、遷移、粘附中均有重要作用[5-8]。為了解MYH9在腫瘤的發(fā)生發(fā)展過(guò)程中的作用，本文初步探討了MYH9蛋白在胃癌組織中的表達(dá)，以判斷MYH9蛋白在胃癌侵襲轉(zhuǎn)移中發(fā)揮的作用?，F(xiàn)報(bào)道如下

1 資料與方法

1.1 標(biāo)本收集與試劑 2013年12月-2015年6月贛南醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院手術(shù)切除并經(jīng)病理證實(shí)為胃癌的石蠟包埋標(biāo)本86例?；颊咝g(shù)前均未接受放療和化療，均經(jīng)病變組織活檢，診斷為胃癌。男55例，女31倒；平均年齡（59.0±4.8）歲。其中高、中分化腺癌57例，低分化腺癌29例；有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移者36例，無(wú)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移者50例；TNM分期：Ⅰ～Ⅱ期44例，Ⅲ～Ⅳ期42例。同時(shí)取距癌組織邊緣5 cm以上的癌旁胃組織20例作為對(duì)照組?？谷薓YH9多克隆抗體購(gòu)于Sigma公司，PV-9000試劑盒購(gòu)自武漢博士德生物工程有限公司。

1.2 免疫組織化學(xué)法 所有標(biāo)本應(yīng)用SP法進(jìn)行免疫組織化學(xué)染色，對(duì)證實(shí)為胃癌石蠟包埋的標(biāo)本行4 ?m厚切片，每例連續(xù)作3張切片。一張行HE染色，以觀察細(xì)胞分化程度等病理特征。一張作陰性對(duì)照，用PBS溶液代替一抗。另一張行MYH9免疫組化染色。病理特征和免疫組化的結(jié)果由兩位病理科醫(yī)師獨(dú)立單盲閱片。隨機(jī)選取5個(gè)視野，MYH9免疫組化染色陽(yáng)性物質(zhì)主要定位于細(xì)胞漿內(nèi)，呈棕黃色細(xì)顆粒狀。蛋白表達(dá)評(píng)估標(biāo)準(zhǔn)為：（1）按陽(yáng)性染色細(xì)胞百分率計(jì)分：陽(yáng)性細(xì)胞百分率≤5%為0分，5%～25%為1分，26%～50%為2分，>50%為3分；（2）按染色強(qiáng)度計(jì)分：0分為無(wú)色，1分為淡黃色為弱表達(dá)，2分為黃色為中表達(dá)，3分為棕黃色或黃褐色為強(qiáng)表達(dá)。免疫染色指數(shù)（staining index，SI）=陽(yáng)性染色細(xì)胞百分率×染色強(qiáng)度。在本研究中，設(shè)定SI≤6分為低表達(dá)，SI>6分為高表達(dá)。

1.3 Western blot法 取術(shù)后新鮮病理標(biāo)本，在腫瘤組織和癌旁組織進(jìn)行取材，通過(guò)BCA法測(cè)定蛋白水平。SDS-PAGE凝膠電泳分離蛋白后， 將獲得樣品加入SDS緩沖液中，上樣，待溴酚藍(lán)跑至底部，進(jìn)行轉(zhuǎn)膜后封閉、免疫反應(yīng)觀察MYH9蛋白表達(dá)情況，以β-actin為內(nèi)參。照相后行圖像分析。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS 19.0軟件對(duì)所得數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，計(jì)數(shù)資料以率（%）表示，比較采用 字2檢驗(yàn)及列連表相關(guān)分析。以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。endprint

2 結(jié)果

2.1 MYH9蛋白在胃癌及癌旁組織中的表達(dá) 免疫組化結(jié)果顯示：MYH9主要在胃癌細(xì)胞的胞漿中表達(dá)（圖1）。86例胃癌組織，39例（45.3%）低表達(dá)，47例（54.7%）高表達(dá)；20例癌旁組織，15例（75.0%）低表達(dá)，5例（25.0%）高表達(dá)。MYH9在胃癌組織中的表達(dá)明顯高于癌旁組織，差 異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P=0.017）。Western blot結(jié)果顯示，對(duì)20組胃癌組織及癌旁組織進(jìn)行了Western blot檢測(cè)，其中13組癌組織比癌旁組織蛋白表達(dá)量高（圖2），7組癌組織MYH9蛋白表達(dá)不高于癌旁組。進(jìn)一步用秩和檢驗(yàn)進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)胃癌組織中MYH9蛋白的表達(dá)高于癌旁組織（15.68% vs 7.19%），差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。

2.2 MYH9蛋白在胃癌中的表達(dá)與臨床病理參數(shù)之間的關(guān)系 MYH9蛋白表達(dá)與胃癌患者的年齡、性別、腫瘤直徑、腫瘤分化程度無(wú)關(guān)（P>0.05），胃癌組織MYH9蛋白的表達(dá)在Ⅲ～Ⅳ期明顯高于Ⅰ～Ⅱ期（P=0.009），淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移胃癌的MYH9蛋白表達(dá)明顯高于無(wú)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移（P=0.019），見表1。

3 討論

胃癌是消化系統(tǒng)最常見的惡性腫瘤。由于各種因素，我國(guó)大部分胃癌診斷時(shí)已是中晚期，目前的治療方式主要是以手術(shù)治療為主的綜合治療，然而仍有60%的患者依然出現(xiàn)復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移[9]。因此，了解胃癌的侵襲轉(zhuǎn)移的分子機(jī)制，是胃癌研究者面臨的重大課題[10-11]。Liang等[12]通過(guò)體內(nèi)和體外實(shí)驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn)Let-7f 通過(guò)介導(dǎo)MYH9基因從而抑制胃癌細(xì)胞GC9811的侵襲與轉(zhuǎn)移，這為胃癌侵襲轉(zhuǎn)移的機(jī)制研究又提供了一關(guān)聯(lián)基因。為此，本文初步探討MYH9蛋白在胃癌組織中的表達(dá)，用以明確MYH9蛋白在胃癌侵襲轉(zhuǎn)移中發(fā)揮的作用。

肌球蛋白（myosin）超家族可與肌動(dòng)蛋白相結(jié)合，利用ATP水解的能量，沿著微絲移動(dòng)，參與細(xì)胞內(nèi)的各種功能都相關(guān)[13]。研究發(fā)現(xiàn)，MYH9特異的存在于血小板、淋巴細(xì)胞和中性粒細(xì)胞中，參與了細(xì)胞的運(yùn)動(dòng)和趨化。它還與其他蛋白相互作用，促進(jìn)細(xì)胞定向的運(yùn)動(dòng)，調(diào)節(jié)腫瘤細(xì)胞的遷移和血管的生成[14-15]。而這些作用主要是由MYH9基因編碼的NMIIA族分子完成的。NMIIA通過(guò)組裝成肌球蛋白牽引整個(gè)細(xì)胞，形成類蜂窩結(jié)構(gòu)，收縮細(xì)胞體向前運(yùn)動(dòng)，解離附著在細(xì)胞后部的尾巴，從而達(dá)到細(xì)胞的收縮和前行運(yùn)動(dòng)[16]。是否MYH9在腫瘤的發(fā)生發(fā)展過(guò)程中也是通過(guò)NMIIA族分子發(fā)揮作用的仍不清楚。目前MYH9基因與腫瘤的生物學(xué)行為研究一直是熱點(diǎn)之一。MYH9蛋白是表達(dá)兒童間變性大細(xì)胞淋巴瘤激酶的融合基因[17]，在乳癌和黑色素瘤細(xì)胞系中MYH9蛋白又是依賴其他因子的表達(dá)[18]。進(jìn)一步研究顯示，MYH9是腫瘤的候選癌基因，在肺癌和大腸癌的侵襲轉(zhuǎn)移中發(fā)揮重要的作用[19-21]。

本課題中對(duì)胃癌及癌旁組織中進(jìn)行MYH9的免疫組化檢測(cè)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)MYH9在胃癌組織中的表達(dá)明顯高于癌旁組織。Western blot法是分子生物學(xué)和生物化學(xué)等領(lǐng)域研究中常用的一種實(shí)驗(yàn)方法，常用來(lái)分析基因在蛋白水平的表達(dá)情況。筆者進(jìn)一步通過(guò)Western blot的方法驗(yàn)證在胃癌組織和癌旁組織中MYH9蛋白的表達(dá)情況，結(jié)果也表明MYH9蛋白在胃癌組織中的表達(dá)是上調(diào)的，從另一個(gè)角度也驗(yàn)證了蛋白質(zhì)組學(xué)結(jié)果的可靠性和準(zhǔn)確性。同時(shí)筆者還分析了MYH9蛋白在胃癌中的表達(dá)與臨床病理參數(shù)之間的關(guān)系，統(tǒng)計(jì)學(xué)分析提示MYH9蛋白表達(dá)與胃癌患者的年齡、性別、腫瘤直徑、腫瘤分化程度無(wú)關(guān)，而與臨床分期及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有相關(guān)性。同時(shí)也發(fā)現(xiàn)在轉(zhuǎn)移性淋巴結(jié)胃癌組織中，高表達(dá)的MYH9蛋白有69.4%，預(yù)示著MYH9蛋白可能在胃癌的淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移過(guò)程發(fā)揮著重要作用。MYH9在胃癌組織中的表達(dá)可作為腫瘤診斷和判斷預(yù)后的標(biāo)志物之一，但其作用機(jī)制是否也是通過(guò)結(jié)合NMIIA族分子，這也是醫(yī)務(wù)工作者進(jìn)一步亟待研究的。

腫瘤的侵襲轉(zhuǎn)移是一個(gè)多步驟的復(fù)雜過(guò)程，本研究通過(guò)免疫組織方法初步探討了MYH9在胃癌侵襲和轉(zhuǎn)移中發(fā)揮了作用。下一步，還將采用多種實(shí)驗(yàn)方法進(jìn)一步研究MYH9蛋白在胃癌侵襲和轉(zhuǎn)移中的作用機(jī)制。期待能夠找到一種有效判斷進(jìn)展期胃癌轉(zhuǎn)移相關(guān)基因的靶標(biāo)，對(duì)于預(yù)測(cè)胃癌侵襲轉(zhuǎn)移的診治及預(yù)后具有非常重要的意義，為指導(dǎo)胃癌亞臨床轉(zhuǎn)移的合理防治提供理論依據(jù)。

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（收稿日期：2017-08-10） （本文編輯：程旭然）endprint