miRNA—133b—3p對(duì)PC12細(xì)胞P2rx4的表達(dá)調(diào)控及細(xì)胞鈣活動(dòng)的實(shí)驗(yàn)觀察

何則平+高楊+王銳

【摘要】 目的：從離體細(xì)胞水平觀察miRNA-133b-3p調(diào)控P2rx4表達(dá)對(duì)神經(jīng)元鈣活動(dòng)的影響。方法：用轉(zhuǎn)染試劑將miRNA-133b-3p mimic和miRNA-133b-3p inhibitor轉(zhuǎn)入PC12細(xì)胞中。轉(zhuǎn)染48 h后，用熒光定量PCR的方法檢測(cè)PC12細(xì)胞中miRNA-133b-3p的含量，P2rx4 mRNA的表達(dá)變化；用免疫印跡的方法檢測(cè)P2rx4受體蛋白的表達(dá)變化；用胞內(nèi)鈣成像技術(shù)檢測(cè)ATP孵育后細(xì)胞中鈣離子濃度的變化。結(jié)果：轉(zhuǎn)染48 h后，與陰性對(duì)照組相比，加入miRNA-133b-3p mimic后PC12細(xì)胞中miRNA-133b-3p的含量明顯增加，P2rx4 mRNA和P2rx4蛋白的表達(dá)減少，ATP孵育后細(xì)胞中鈣離子濃度的升高明顯減弱。轉(zhuǎn)染inhibitor后，細(xì)胞內(nèi)miRNA-133b-3p的含量明顯減少，P2rx4 mRNA和P2rx4蛋白的表達(dá)增加，ATP孵育后胞內(nèi)鈣離子濃度的升高明顯增強(qiáng)。結(jié)論：miRNA-133b-3p通過(guò)負(fù)向調(diào)控P2rx4的表達(dá)來(lái)影響細(xì)胞鈣活動(dòng)。

【關(guān)鍵詞】 PC12細(xì)胞； miRNA-133b-3p； P2rx4； 鈣活動(dòng)； 表達(dá)調(diào)控

【Abstract】 Objective：To observe the effect of miRNA-133b-3p on the calcium mobilization of neurons by regulating the expression of P2rx4.Method：Transfection reagents and miRNA-133b-3p mimic or inhibitor were added into the culture medium of PC12 cell.After 48 hours of transfection，the expression of miRNA-133b-3p

and P2rx4 mRNA were measured by real-time PCR.Western blot method was used for quantitative analysis on P2rx4 protein.The mobilization of intracellular calcium was measured with calcium imaging technique.Result：After 48 hours of transfection，compared with the negative control group，after adding miRNA-133b-3p mimic，the expression of miRNA-133b-3p in PC12 cells was significantly increased， the expressions of P2rx4 mRNA and P2rx4 protein were significantly decreased，and calcium ion concentration increase induced by ATP was decreased obviously.After adding miRNA-133b-3p inhibitor，the expression of miRNA-133b-3p was decreased significantly，and the expressions of P2rx4 mRNA and P2rx4 protein were significantly increased，the calcium ion concentration increase induced by ATP was enhanced obviously.Conclusion：miRNA-133b-3p downregulation of P2rx4 affectes intracellular calcium activity and is involved in chronic pain.

【Key words】 PC12 cell； miRNA-133b-3p； P2rx4； Calcium mobilization； Regulation of expression

First-authors address：Shanxi Medical University，Taiyuan 030001，China

doi：10.3969/j.issn.1674-4985.2017.29.006

疼痛是大多數(shù)疾病共有的癥狀，慢性疼痛及嚴(yán)重疼痛已經(jīng)構(gòu)成一個(gè)單獨(dú)的疾病[1]。不同類(lèi)型疼痛的共同過(guò)程主要包括痛刺激對(duì)傷害性感受器的激活，傷害性信息的傳遞，痛信息在不同中樞的處理，并最終產(chǎn)生痛覺(jué)[2-3]。在這個(gè)過(guò)程發(fā)揮最基本、最重要作用的因素是各種痛相關(guān)的神經(jīng)活性物質(zhì)的產(chǎn)生。因此，探討不同條件下痛相關(guān)物質(zhì)的產(chǎn)生以及表達(dá)調(diào)控是疼痛尤其是慢性疼痛機(jī)制研究中最有可能獲得具有應(yīng)用價(jià)值成果的領(lǐng)域。

microRNA（miRNA）是一類(lèi)單鏈非編碼RNA，可以對(duì)基因組的大部分進(jìn)行轉(zhuǎn)錄后調(diào)節(jié)[4]。哺乳動(dòng)物體內(nèi)超過(guò)60%的基因是miRNAs的靶基因，miRNAs在轉(zhuǎn)錄后水平調(diào)節(jié)蛋白質(zhì)的表達(dá)，在疼痛信號(hào)產(chǎn)生與傳遞過(guò)程發(fā)揮了重要作用[5]。課題組在前期工作中，利用miRNA芯片，初步明確了CFA致大鼠慢性炎性疼痛模型DRG中miRNAs的表達(dá)譜。綜合多個(gè)生物信息學(xué)數(shù)據(jù)庫(kù)的預(yù)測(cè)，得到

22種與疼痛有關(guān)的靶基因，并從中篩選出已知與疼痛形成密切相關(guān)的P2rx4。

P2rx4基因編碼的蛋白是P2X4受體，P2X4受體是疼痛遞質(zhì)ATP的受體之一，與痛覺(jué)調(diào)制密切相關(guān)[6-7]。生物信息學(xué)的分析結(jié)果提示P2rx4可能受3個(gè)差異表達(dá)miRNA調(diào)控。采用雙熒光素酶報(bào)告基因法對(duì)P2rx4和3個(gè)差異表達(dá)的miRNA進(jìn)行了靶結(jié)合實(shí)驗(yàn)，最后證實(shí)P2rx4的mRNA只與miRNA-133b-3p發(fā)生了結(jié)合。endprint

前期的在體的研究發(fā)現(xiàn)，慢性炎性疼痛大鼠背根神經(jīng)節(jié)內(nèi)miRNA-133b-3p與P2rx4之間可能存在負(fù)相關(guān)關(guān)系。提示miRNA-133b-3p可能通過(guò)調(diào)節(jié)P2rx4的表達(dá)來(lái)調(diào)控疼痛的發(fā)展變化。P2X4是ATP門(mén)控的離子通道（Ca2+通道），因此在本研究中筆者采用高分化型的雄性大鼠腎上腺嗜鉻細(xì)胞瘤細(xì)胞株P(guān)C12，在細(xì)胞水平外源性的干預(yù)miRNA-133b-3p的表達(dá)，觀察miRNA-133b-3p對(duì)P2rx4 mRNA和蛋白表達(dá)的調(diào)控作用以及該調(diào)控作用對(duì)ATP孵育后細(xì)胞鈣活動(dòng)的影響，最終證實(shí)miRNA-133b-3p可通過(guò)調(diào)控P2X4受體的表達(dá)，進(jìn)而影響神經(jīng)元的鈣活動(dòng)以及慢性疼痛的發(fā)生?，F(xiàn)報(bào)道如下。

1 材料與方法

1.1 分組 將PC12細(xì)胞分四組：Mimic組、Mimic陰性對(duì)照組（NCM組）、Inhibitor組、Inhibitor陰性對(duì)照組（NCI組）。

1.2 轉(zhuǎn)染 細(xì)胞按每皿3×106/mL的密度接種。轉(zhuǎn)染按riboFECTTM說(shuō)明書(shū)轉(zhuǎn)染。mimic和inhibitor的終濃度分別為100、150 nM。

1.3 鈣離子成像 每皿加入500 μL Fura 2-AM工作液，孵育20 min，洗滌三次；加入任氏液孵育10 min，用MetaFlour系統(tǒng)記錄熒光強(qiáng)度的變化。記錄基線(xiàn)2 min，加入2 μM ATP，記錄3 min，至熒光強(qiáng)度回到基線(xiàn)水平后，再加入16 μM的ATP，記錄2 min。

1.4 實(shí)時(shí)熒光定量PCR 用miRNeasy Mini Kit試劑盒（Qiagen）來(lái)抽提細(xì)胞中的總RNA。用miScript? Ⅱ RT Kit試劑盒（Qiagen），將RNA溶液反轉(zhuǎn)錄為cDNA。以cDNA為模板，U6作為內(nèi)參，用miScript SYBR? Green PCR Kit試劑盒（TaKaRa）檢測(cè)miRNA-133b-3p的表達(dá)。用PrimeScriptTM RT reagent Kit with gDNA Eraser試劑盒（TaKaRa），將RNA溶液反轉(zhuǎn)錄為cDNA，以cDNA為模板，以大鼠的β-actin為內(nèi)參，用SYBR? Premix Ex TaqTM Ⅱ試劑盒（TaKaRa）檢測(cè)P2rx1-7 mRNA的表達(dá)量。

1.5 蛋白印跡 裂解細(xì)胞，提取蛋白。檢測(cè)蛋白濃度，用10%SDS-聚丙烯酰胺凝膠分離總蛋白，并轉(zhuǎn)移到PVDF膜上。封閉1 h，漂洗，P2rx4兔一抗（1∶500，Abcam）孵育過(guò)夜。山羊抗兔HRP-IgG（1∶3000，生工）孵育1 h，凝膠成像儀成像。用蛋白印跡膜再生液洗脫已經(jīng)結(jié)合的一抗和二抗，孵育GAPDH（1∶1000，生工）一抗，用內(nèi)參基因來(lái)標(biāo)準(zhǔn)化P2rx4蛋白的表達(dá)水平。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS 17.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件分析，計(jì)量資料且符合正態(tài)分布用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)誤（Mean±SEM）表示。兩組間比較采用兩獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)，多組間比較用單因素方差分析。檢驗(yàn)水準(zhǔn)α=0.05，P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 P2rx4在PC12細(xì)胞鈣活動(dòng)中的作用觀察 P2rx有P2rx1～P2rx7七種亞型，qPCR檢測(cè)其表達(dá)。與P2rx1相比，其中P2rx4在PC12細(xì)胞中的相對(duì)表達(dá)量最高（P<0.01），見(jiàn)圖1A。向PC12細(xì)胞中分別加入P2XR受體的激動(dòng)劑和抑制劑（10 ?M IVE，2 ?M PPAD，2 ?M 5BDBD）。其中IVE是P2rx4的激動(dòng)劑，PPADs是P2XR（P2rx1、P2rx2、P2rx3、P2rx5）的拮抗劑，5BDBD是P2rx4的拮抗劑。鈣成像結(jié)果顯示：與ATP組（0.449 00±0.020 92）相比，IVE組鈣離子濃度明顯增加（0.651 30±0.027 46，P<0.01）；5BDBD組鈣離子濃度明顯降低（0.256 10±0.026 29，P<0.01）；PPADs組鈣離子濃度明顯減少（0.256 10±0.026 29，P<0.01）；PPADs+5BDBD組鈣離子濃度明顯降低（0.096 97±0.016 60，P<0.01）。見(jiàn)圖1B。

2.2 轉(zhuǎn)染miRNA-133b-3p mimic對(duì)PC12細(xì)胞的影響 轉(zhuǎn)染miRNA-133b-3p mimic 48 h后，檢測(cè)miRNA-133b-3p的相對(duì)含量，P2rx4 mRNA和蛋白的表達(dá)變化，以及細(xì)胞內(nèi)鈣活動(dòng)。結(jié)果顯示：與NCM組（1.505 00±0.510 70）相比，轉(zhuǎn)染mimic后，miRNA-133b-3p的含量明顯上升（11 450±1079，P<0.01），見(jiàn)圖3A；與NCM組（1.015 00±0.079 43）相比，Mimic組P2rx4 mRNA的表達(dá)明顯降低（0.492 50±0.049 96，P<0.01），見(jiàn)圖3B；與NCM組（0.814 50±0.042 20）相比，Mimic組PC12細(xì)胞中P2rx4蛋白的表達(dá)明顯降低（0.367 90±0.017 79，P<0.01），見(jiàn)圖3C；與NCM陰性對(duì)照組（0.282 80±0.007 62）相比，Mimic組ΔRatio值明顯降低（0.219 00±0.010 17，P<0.01），見(jiàn)圖3D。

2.3 轉(zhuǎn)染miRNA-133b-3p inhibitor對(duì)PC12細(xì)胞的影響 轉(zhuǎn)染miRNA-133b-3p inhibitor 48 h后，檢測(cè)miRNA-133b-3p的相對(duì)含量，P2rx4 mRNA和蛋白的表達(dá)變化，以及細(xì)胞內(nèi)鈣活動(dòng)。結(jié)果顯示：轉(zhuǎn)染48 h后，與NCI組（1.394 00±0.070 86）相比，轉(zhuǎn)染150 nM miRNA-133b-3p inhibitor后，PC12細(xì)胞中miRNA-133b-3p的含量降低（0.434 40±0.082 28，P<0.01），見(jiàn)圖4A；與NCI組（1.007 00±0.042 50）相比，Inhibitor組P2rx4 mRNA的表達(dá)明顯升高（1.506 00±0.306 80，P<0.01）見(jiàn)圖4B；與NCI組（0.726 60±0.031 06）相比，Inhibitor組P2rx4蛋白的表達(dá)增高（0.843 60±0.041 72，P<0.05），見(jiàn)圖4C；與NCI組（0.330 80±0.007 47）相比，Inhibitor組PC12細(xì)胞中ΔRatio值升高（0.368 50±0.009 08），（P<0.01），即細(xì)胞內(nèi)流的鈣離子濃度增加，見(jiàn)圖4D。endprint

3 討論

課題組之前研究發(fā)現(xiàn)慢性炎性痛大鼠背根神經(jīng)節(jié)內(nèi)miRNA-133b-3p與P2rx4的表達(dá)可能存在負(fù)相關(guān)關(guān)系。且體外實(shí)驗(yàn)也證實(shí)miRNA-133b-3p可與P2rx4 mRNA的3-非編碼區(qū)發(fā)生結(jié)合。因此本研究在PC12細(xì)胞內(nèi)干預(yù)miRNA-133b-3p的表達(dá)，觀察P2rx4 mRNA和蛋白的表達(dá)情況以及PC12細(xì)胞鈣活動(dòng)的改變，以期證實(shí)miRNA-133b-3p確實(shí)可以調(diào)控P2rx4的表達(dá)，并且參與細(xì)胞功能改變。

選用大鼠腎上腺髓質(zhì)嗜鉻細(xì)胞瘤PC12細(xì)胞株，研究表明，在PC12細(xì)胞系可以很好觀察到ATP誘導(dǎo)的鈣內(nèi)流[8]。此外，該細(xì)胞的來(lái)源也是大鼠，因此PC12細(xì)胞為此次功能驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)提供了一個(gè)細(xì)胞模型。

P2X嘌呤受體有七個(gè)亞型（P2X1～P2X7），是一類(lèi)可以被細(xì)胞外的ATP激活的配體門(mén)控離子通道家族[9-10]。它們?cè)谔弁葱盘?hào)的產(chǎn)生和傳遞過(guò)程中發(fā)揮的作用[11-12]。筆者檢測(cè)了PC12細(xì)胞中P2X各種亞型的基礎(chǔ)表達(dá)量，結(jié)果顯示，PC12細(xì)胞中的P2rx4在鈣內(nèi)流過(guò)程中發(fā)揮著顯著的作用。P2rx4的表達(dá)水平最高，且激活P2rx4通道后，細(xì)胞內(nèi)的鈣內(nèi)流明顯增加。以上結(jié)果表明，PC12細(xì)胞是研究P2rx4表達(dá)量和功能變化的很好的模型。

研究發(fā)現(xiàn)，miRNA通過(guò)抑制或降解靶基因發(fā)揮調(diào)控作用的[13-14]。在本研究中，筆者發(fā)現(xiàn)，

100 nM miRNA-133b-3p mimic的轉(zhuǎn)染能明顯增加PC12細(xì)胞中miRNA-133b-3p的含量，P2rx4 mRNA和P2rx4蛋白的表達(dá)在細(xì)胞中miRNA-133b-3p的含量增加后明顯降低。而150 nM miRNA-133b-3p inhibitor的轉(zhuǎn)染能明顯降低PC12細(xì)胞中miRNA-133b-3p的含量，能夠模擬細(xì)胞內(nèi)miRNA的低表達(dá)。P2rx4 mRNA和P2rx4蛋白的表達(dá)在細(xì)胞中miRNA-133b-3p的表達(dá)受到抑制后明顯增加。結(jié)果表明，PC12細(xì)胞轉(zhuǎn)染miRNA-133b-3p mimic后，細(xì)胞內(nèi)miRNA-133b-3p的含量增加，P2rx4 mRNA水平和蛋白水平的表達(dá)均降低；而轉(zhuǎn)染miRNA-133b-3p inhibitor后，細(xì)胞內(nèi)miRNA-133b-3p的含量減少，P2rx4 mRNA水平和蛋白水平的表達(dá)均升高。所以，這部分結(jié)果充分證實(shí)了miRNA-133b-3p確實(shí)是可以負(fù)向調(diào)控P2rx4的表達(dá)的。

在證實(shí)miRNA-133b-3p確實(shí)可以負(fù)向調(diào)控P2rx4的表達(dá)之后，筆者對(duì)細(xì)胞的功能變化進(jìn)行了觀察。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，miRNA-133b-3p模擬物可以減弱PC12細(xì)胞內(nèi)ATP誘導(dǎo)的鈣離子的內(nèi)流。而 miRNA-133b-3p抑制劑可以增加PC12細(xì)胞內(nèi)ATP誘導(dǎo)的鈣離子內(nèi)流。因此，結(jié)果表明，轉(zhuǎn)染miRNA-133b-3p mimic降低P2rx4蛋白的表達(dá)之后，細(xì)胞在受到ATP刺激后，細(xì)胞鈣內(nèi)流減少；此外，在轉(zhuǎn)染miRNA-133b-3p inhibitor增加P2rx4蛋白的表達(dá)后，ATP誘導(dǎo)的細(xì)胞鈣內(nèi)流增加。本實(shí)驗(yàn)對(duì)miRNA-133b-3p通過(guò)調(diào)控P2rx4蛋白表達(dá)影響PC12細(xì)胞鈣活動(dòng)提供了正反兩個(gè)方面的證據(jù)。

背根神經(jīng)節(jié)內(nèi)神經(jīng)元胞內(nèi)Ca2+信號(hào)與慢性疼痛的發(fā)展發(fā)展密切相關(guān)[15-17]。外周組織受到強(qiáng)烈的傷害性刺激導(dǎo)致受刺激細(xì)胞或神經(jīng)末梢釋放致痛物質(zhì)ATP，ATP可與外周傷害性信息傳入初級(jí)感覺(jué)神經(jīng)元上的P2受體結(jié)合，使神經(jīng)元細(xì)胞內(nèi)Ca2+濃度升高，激活ERK-CREB信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，從而激活轉(zhuǎn)錄因子CREB啟動(dòng)轉(zhuǎn)錄，誘導(dǎo)背根神經(jīng)元疼痛相關(guān)基因蛋白的表達(dá)，最終增強(qiáng)初級(jí)感覺(jué)神經(jīng)元的興奮性[18-20]。

綜上，本實(shí)驗(yàn)證實(shí)miRNA-133b-3p通過(guò)負(fù)向調(diào)控P2rx4基因的表達(dá)，影響神經(jīng)元鈣活動(dòng)及其興奮性，最終參與慢性疼痛的形成。

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（收稿日期：2017-05-17） （本文編輯：程旭然）endprint