CFA誘導(dǎo)的大鼠條件位置逃避模型的觀察

馬洋+秦國(guó)華+王銳

【摘要】 目的：大鼠后腳掌注射完全弗氏佐劑（complete freunds adjuvant，CFA）可誘導(dǎo)產(chǎn)生條件位置回避（conditioned place avoidance，C-CPA）反應(yīng)，大鼠經(jīng)過(guò)“非痛環(huán)境”/“痛環(huán)境”適應(yīng)后，檢測(cè)形成的C-CPA行為反應(yīng)可持續(xù)多長(zhǎng)時(shí)間。方法：（1）根據(jù)后腳掌注射CFA后觀察痛行為的時(shí)間，將大鼠隨機(jī)分為Day3組、Day5組、Day7組、Day10組、Day14組共五個(gè)實(shí)驗(yàn)組；（2）建立CFA誘導(dǎo)的CPA模型；（3）檢測(cè)各組大鼠CPA反應(yīng)；（4）Western-blot檢測(cè)rACC腦區(qū)痛情緒相關(guān)NMDA受體亞基NR1及磷酸化（p-NR1）的表達(dá)水平。結(jié)果：大鼠后腳掌注射CFA后五組大鼠熱痛行為反應(yīng)隨時(shí)間無(wú)明顯變化；CPA反應(yīng)在Day3組、Day5組、Day7組、Day10組大鼠與注射CFA前相比產(chǎn)生了明顯的CPA反應(yīng)，而Day14組的CPA反應(yīng)明顯減弱；同步Western-blot檢測(cè)的p-NR1表達(dá)也呈現(xiàn)了與行為反應(yīng)一致的變化趨勢(shì)。結(jié)論：CFA一次注射與環(huán)境條件化適應(yīng)建立的C-CPA模型建成后可維持至少10 d的時(shí)間，之后CPA反應(yīng)逐漸消失，且NMDA受體NR1亞基磷酸化水平與CPA反應(yīng)的形成有關(guān)。

【關(guān)鍵詞】 完全弗氏佐劑； 環(huán)境適應(yīng)； 條件位置逃避； 前扣帶皮層； NR1磷酸化

【Abstract】 Objective：Rats injected subcutaneously into the hind paw with complete freunds adjuvant（CFA） were acclimated to one side of cage apparatus to induce conditioned place avoidance（CPA） responses.Then we examined how long C-CPA response was sustained.Method：（1）According to the observation time of CFA-injection into the hind paw，the rats were randomly divided into five groups，such as Day3 group，Day5 group，Day7 group，Day10 group and Day14 group.（2）To establish CFA-induced conditioned place avoidance（C-CPA）.（3）Conditioned place avoidance responses were detected in each group.（4） The expression of NR1 subunits and its phosphorylation were measured by Western-blot.Result：CFA-injection into the hind paw induced nociceptive behaviors and CPA responses.The nociceptive behavior had no obvious change in the course of experiment，and the CPA responses in Day3 group，Day5 group，Day7 group and Day10 group compared with the control group，whereas the responses in Day10 group gradually disappeared.The expressions of the phosphorylation of NR1 measured synchronously presented the same trends with CPA responses.Conclusion：C-CPA responses can stably maintain 10 days，then gradually disappeare.And the expression of p-NR1 relates to the formation of CPA responses.

【Key words】 Complete freunds adjuvant； Acclimation； Conditioned place avoidance； Anterior cingulate cortex； Phosphorylation of NR1 subunits

First-authors address：Shanxi Medical University，Taiyuan 030001，China

doi：10.3969/j.issn.1674-4985.2017.29.002

國(guó)際疼痛研究會(huì)（IASP）將疼痛定義為：“一種不愉快的感覺(jué)和情緒體驗(yàn)，其發(fā)生與實(shí)際或潛在的組織損傷有關(guān)或這類(lèi)損傷的相關(guān)描述?！笨梢?jiàn)，疼痛包含兩種成分：即痛的感覺(jué)分辨（sensory-discriminative）和痛的情緒反應(yīng)（emotional-affective dimensions）[1-2]。前者主要感受和編碼刺激的屬性，如刺激的性質(zhì)、強(qiáng)度、定位等；后者指痛的情緒、情感反應(yīng)，涉及編碼傷害性刺激所引發(fā)的厭惡、焦慮、恐懼等負(fù)性情緒。神經(jīng)傳導(dǎo)疼痛的情緒和感覺(jué)成分時(shí)有著不同的通路和機(jī)制。有研究表明，ACC和疼痛的情緒方面密切相關(guān)，在ACC內(nèi)，N-甲基-D-天冬氨酸（N-methyl-D-aspartic acid receptor，NMDA）受體是由NR1、NR2及NR3三種不同的亞基構(gòu)成的異四聚體復(fù)合物，并參與中樞神經(jīng)系統(tǒng)多種功能，包括學(xué)習(xí)記憶和痛覺(jué)調(diào)制等[3]，基本亞基NR1參與NMDA受體活性的調(diào)節(jié)，并通過(guò)自身磷酸化過(guò)程異化突觸傳遞[4]，因此上調(diào)NR1亞基的磷酸化（P-NR1）水平可使突觸傳遞的可塑性增強(qiáng)，進(jìn)一步導(dǎo)致痛覺(jué)過(guò)敏及異常疼痛[5-7]。endprint

完全弗氏佐劑（complete freunds adjuvant，CFA）常被用在持續(xù)性炎性疼痛的模型中，本實(shí)驗(yàn)室在痛情緒機(jī)制的研究中將CFA慢性炎性痛模型和條件位置回避結(jié)合起來(lái)，利用可產(chǎn)生持續(xù)性炎性痛的CFA作為致痛物質(zhì)，建立了簡(jiǎn)便、有效、實(shí)驗(yàn)周期更短的CFA誘導(dǎo)的CPA反應(yīng)（C-CPA）模型[8]，該模型完成baseline測(cè)試、條件化適應(yīng)和CPA反應(yīng)檢測(cè)只需3 d時(shí)間[9-10]，很好地模擬并量化了大鼠的痛情緒反應(yīng)，并對(duì)此進(jìn)行相關(guān)機(jī)制的研究。但是該模型建立的CPA反應(yīng)究竟能持續(xù)多長(zhǎng)時(shí)間還不清楚，本實(shí)驗(yàn)將利用C-CPA反應(yīng)結(jié)合ACC腦區(qū)NMDA受體亞基NR1磷酸化的表達(dá)，對(duì)該反應(yīng)模型做一時(shí)效性觀察?，F(xiàn)報(bào)道如下。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及材料 雄性Sprague-Dawley（SD）大鼠30只，體重250～270 g，由北京海淀興旺實(shí)驗(yàn)動(dòng)物養(yǎng)殖場(chǎng)供應(yīng)。完全弗氏佐劑（CFA，sigma）、熱板刺激儀（life science）、條件位置回避裝置（自制）、嚙齒類(lèi)動(dòng)物固定裝置、NeuroMotive軟件（USA）、ANY-maze軟件（USA）

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 建立慢性持續(xù)性炎性動(dòng)物模型 將完全弗氏佐劑（CFA）原液與0.9%氯化鈉溶液按1∶1混合，振蕩混勻?yàn)槿榛癄顟B(tài)，抽取0.08 mL注射于大鼠左側(cè)腳掌皮下。注射完后一只手摁壓針眼處，另一只手輕柔注射部位片刻，利于CFA吸收并防止出血。之后，大鼠左側(cè)腳掌會(huì)出現(xiàn)一個(gè)較長(zhǎng)時(shí)間的炎癥痛，即紅、腫、熱、痛，對(duì)熱刺激或機(jī)械刺激敏感的基本炎癥反應(yīng)狀態(tài)。

1.2.2 大鼠痛情緒的測(cè)量方法

1.2.2.1 條件位置回避（CPA）裝置[8]的介紹 CPA為一無(wú)頂無(wú)底的有機(jī)玻璃材質(zhì)的長(zhǎng)盒，中間有一可抽取的有機(jī)玻璃擋板阻隔，將長(zhǎng)盒平均分成兩個(gè)匹配室，一個(gè)室四面內(nèi)側(cè)貼有間隔一致的紅色水平條帶，底部為3 mm×3 mm孔徑的鋼絲網(wǎng)眼，另一室貼有藍(lán)色垂直條帶，底部為6 mm×6 mm孔徑的鋼絲網(wǎng)眼。將一個(gè)小LED燈掛在貼有藍(lán)色條帶室的外側(cè)，光強(qiáng)度為能使相應(yīng)室有亮度，但不影響另外一個(gè)室，達(dá)到使兩室明暗程度不一的目的。由此形成的兩個(gè)獨(dú)立匹配室對(duì)大鼠有視覺(jué)和觸覺(jué)的差別。

1.2.2.2 CPA的訓(xùn)練過(guò)程 由CFA誘導(dǎo)的條件位置回避實(shí)驗(yàn)過(guò)程分為三個(gè)階段每個(gè)階段之前都要打開(kāi)暗室的15 W燈，讓大鼠適應(yīng)30 min，第一階段：Pre-conditioning test（Day1）將兩匹配室中間的隔板取出，讓大鼠自由活動(dòng)10 min，記錄大鼠活動(dòng)行為，并分析大鼠在兩室的停留時(shí)間。第二階段：Conditioning test（Day2）將兩室中間的隔板插入，形成兩個(gè)相對(duì)獨(dú)立的室。將大鼠任意放入其中一個(gè)室自由活動(dòng)30 min，規(guī)定此室為非CFA匹配室，即“非痛環(huán)境”。之后將大鼠放回飼養(yǎng)籠，30 min后給大鼠左側(cè)腳掌皮下注射0.08 mL配好的弗氏完全佐劑（CFA）注射液。2 h后，將大鼠放入另外一個(gè)室自由活動(dòng)30 min，規(guī)定此室為CFA匹配室，即“痛環(huán)境”。之后將大鼠放回籠中飼養(yǎng)。第三階段：Post-conditioning test分別在3、5、7、10、14 d將兩匹配室中間的隔板取出，讓大鼠自由活動(dòng)10 min，記錄大鼠活動(dòng)行為，并分析大鼠在“非痛環(huán)境”和“痛環(huán)境”中停留的時(shí)間。用大鼠第三階段在“痛環(huán)境”匹配室停留的時(shí)間減去第一階段在該室停留的時(shí)間，差值稱(chēng)為回避分?jǐn)?shù)（CPA Score）。CAP的訓(xùn)練過(guò)程，見(jiàn)圖1。

1.2.3 大鼠熱縮足潛伏期（PWL）的測(cè)量方法 將大鼠放在罩有有機(jī)玻璃盒且未加熱的熱板上適應(yīng)

30 min，隨后取出大鼠，調(diào)節(jié)熱板加熱到50 ℃后保持溫度恒定。計(jì)時(shí)顯示歸零時(shí)，將大鼠再次放入熱板上，立即蓋上蓋子，同時(shí)踩下踏板開(kāi)始計(jì)時(shí)，當(dāng)大鼠舔或者抬起后肢時(shí)立即踩踏踏板，停止計(jì)時(shí)，并迅速將大鼠取出放回籠中。熱縮足潛伏期為大鼠放入熱板到后肢抬起的時(shí)間。正常大鼠的PWL應(yīng)保持在10～15 s，如果沒(méi)有現(xiàn)象，在超過(guò)20 s后將大鼠取出，避免組織損傷。每只大鼠測(cè)量三次后求均值作為最后結(jié)果，每隔15 min測(cè)量一次。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用GraphPad Prism6軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析和作圖，計(jì)量資料以（x±s）表示，大鼠在“痛環(huán)境”匹配室的第一、三階段停留時(shí)間進(jìn)行配對(duì)t檢驗(yàn)，組間比較進(jìn)行非配對(duì)t檢驗(yàn)，多組比較采用單因素方差分析，以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 大鼠后腳掌注射CFA可誘導(dǎo)產(chǎn)生C-CPA反應(yīng) 各組大鼠條件適應(yīng)前后在“疼痛環(huán)境”中停留的時(shí)間，Day3組[Pre（323.80±12.95）s vs Post（178.70±27.25）s，n=7]，Day5組[Pre（291.80±16.49）s vs Post（176.30±42.95）s，n=9]，Day7組[Pre（336.80±23.08）s vs Post（246.30±30.90）s，n=8]，Day10組[Pre（316.30±20.44）s vs Post（199.50±27.97）s，n=8]，Day14組[Pre（307.30±16.27）s vs Post（270.70±21.99）s，n=9]，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。各組大鼠逃避分?jǐn)?shù)比較：NS組（9.96±29.80）s，Day3組（-145.10±22.13）s，Day5組（-115.50±44.45）s，Day7組（-90.46±28.93）s，Day10組（-61.43±58.00）s，Day14組（-36.56±25.69）s，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。大鼠后腳掌注射CFA后，通過(guò)比較各組大鼠處理前后在“疼痛環(huán)境”中停留的時(shí)間可知，Day3組、Day5組、Day7組和Day10組大鼠在“疼痛環(huán)境”匹配室的時(shí)間和第1天相比差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05），Day14組大鼠在“疼痛環(huán)境”匹配室的時(shí)間和第1天相比差異無(wú)統(tǒng)計(jì)意義（P>0.05），各組回避分?jǐn)?shù)和正常組相比，Day3組、Day5組、Day7組和Day10組差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05），Day14組差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05），見(jiàn)圖2。endprint

2.2 大鼠后腳掌注射CFA可誘導(dǎo)rACC神經(jīng)元NMDA受體NR1發(fā)生磷酸化 如圖3所示，Day3組、Day5組、Day7組和Day10組大鼠rACC區(qū)NR1的磷酸化表達(dá)水平和正常組相比差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（n=3，P<0.05），Day14組無(wú)明顯變化（n=4，P>0.05）。

2.3 大鼠后腳掌注射CFA引起熱痛行為發(fā)生變化 Day3組[Pre（11.9±1.1）s vs Post（8.9±1.3）s，P<0.05，n=7]，Day5組[Pre（13.9±0.7）s vs Post（8.8±1.0）s，P<0.05，n=9]，Day7組[Pre（12.2±1.2）s vs Post（8.5±0.9）s，P<0.05，n=8]，Day10組[Pre（14.07±1.0）s vs Post（8.7±0.4）s，P<0.05，n=8]，Day14組[Pre（14.27±2.7）s vs Post（8.9±0.6）s，P<0.05，n=9]。后腳掌注射CFA后，各組大鼠PWL與第1天基礎(chǔ)值相比明顯縮短，各組大鼠PWL比較差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05），見(jiàn)圖4。

3 討論

疼痛是一種包含感受、情緒和認(rèn)知的多維度體驗(yàn)，也是人們?nèi)メt(yī)院就醫(yī)的最主要起始原因。在過(guò)去，人們對(duì)痛感覺(jué)成分的研究獲得了巨大的進(jìn)展。近些年的臨床觀察顯示，慢性痛患者所遭受的惡性情緒遠(yuǎn)比疼痛本身更為嚴(yán)重。目前研究者們利用CPA模型對(duì)痛情緒進(jìn)行深入研究[11-14]，那么在動(dòng)物模型中以炎性致痛物質(zhì)CFA誘導(dǎo)的CPA反應(yīng)究竟能持續(xù)多長(zhǎng)時(shí)間呢？

為此，在實(shí)驗(yàn)過(guò)程中，與足底注射生理鹽水對(duì)照組相比，給大鼠后腳掌注射CFA可以成功誘導(dǎo)出CPA反應(yīng)，通過(guò)給大鼠足底注射CFA所產(chǎn)生的自發(fā)性、持續(xù)性疼痛與環(huán)境相耦合，使動(dòng)物產(chǎn)生明顯的厭惡“疼痛環(huán)境”的痛情緒反應(yīng)[15]。大鼠腳掌注射CFA后，實(shí)驗(yàn)者分別在第3、5、7、10和14天檢測(cè)各組大鼠的CPA反應(yīng)和PWL變化。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在檢測(cè)CPA反應(yīng)過(guò)程中，Day3組、Day5組、Day7組和Day10組大鼠條件適應(yīng)后，在“疼痛環(huán)境”中停留的時(shí)間明顯小于適應(yīng)之前在此環(huán)境中停留的時(shí)間，各自的回避分?jǐn)?shù)和正常組相比差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05），說(shuō)明大鼠產(chǎn)生了明顯的CPA反應(yīng)；而Day14組卻均無(wú)顯著變化，沒(méi)有產(chǎn)生CPA反應(yīng)，說(shuō)明大鼠在第14天痛情緒得到緩解。此外，與正常組相比，各組大鼠的熱縮足潛伏期明顯縮短，說(shuō)明大鼠慢性炎性痛持續(xù)存在。以上結(jié)果表明，該模型中大鼠產(chǎn)生的CPA反應(yīng)在第14天得到緩解，而炎性痛感受依然存在。之前的研究發(fā)現(xiàn)疼痛的兩種成分分別是通過(guò)不同的機(jī)制來(lái)發(fā)揮作用的[16]，通過(guò)本實(shí)驗(yàn)也證明了這種現(xiàn)象。

有資料表明ACC腦區(qū)神經(jīng)元上分布著大量的NMDA受體， NMDA受體包括NR1必需亞基和NR2A-D調(diào)節(jié)亞基[7]。在實(shí)驗(yàn)中，實(shí)驗(yàn)者檢測(cè)了CFA誘導(dǎo)痛情緒反應(yīng)時(shí)NR1亞基的磷酸化水平，結(jié)果顯示，與足底注射生理鹽水組相比，Day3組、Day5組、Day7組和Day10組大鼠rACC區(qū)NR1亞基的磷酸化水平顯著升高，而Day14組無(wú)明顯變化（P>0.05），說(shuō)明NMDA受體亞基NR1的磷酸化介導(dǎo)了CFA誘導(dǎo)大鼠產(chǎn)生CPA反應(yīng)。本研究通過(guò)C-CPA反應(yīng)在慢性炎癥痛大鼠模型中的持續(xù)時(shí)間和rACC區(qū)NMDA受體亞基NR1磷酸化的表達(dá)情況，明確了該動(dòng)物模型實(shí)驗(yàn)觀察的時(shí)效性，也證實(shí)了NR1磷酸化是形成并維持痛情緒反應(yīng)的重要基礎(chǔ)，這為今后利用該動(dòng)物模型深入研究痛情緒提供了實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

參考文獻(xiàn)

[1] Woolf C J，Mannion R J.Neuropathic pain：aetiology，symptoms，mechanisms，and management[J].Lancet，1999，353（9168）：1959-1964.

[2] Sato J，Suzuki S，Iseki T，et al.Adrenergic excitation of cutaneous nociceptors in chronically inflamed rats[J].Neurosci Lett，1993，164（1-2）：225-228.

[3] Ma J Y，Zhao Z Q.The involvement of glia in long-term plasticity in the spinal dorsal horn of the rat[J].Neuroreport，2002，13（14）：1781-1784.

[4] Bird G C，Lash L L，Han J S，et al.Protein kinase A-dependent enhanced NMDA receptor function in pain-related synaptic plasticity in rat amygdala neurones[J].J Physiol，2005，564（3）：907-921.

[5] Lei L G， Sun S，Gao Y J，et al.NMDA receptors in the anterior cingulate cortex mediate pain-related aversion[J].Exp Neurol，2004，189（2）：413-421.

[6] Zhang R X，Liu B，Wang L，et al.Spinal glial activation in a new rat model of bone cancer pain produced by prostate cancer cell inoculation of the tibia[J].Pain，2005，118（1-2）：125-136.endprint

[7] Loftis J M，Janowsky A.The N-methyl-D-aspartate receptor subunit NR2B：localization，functional properties，regulation，and clinical implications[J].Pharmacol Ther，2003，97（1）：55-85.

[8]張肖怡，蘭坤，馮曉璞，等.痛情緒反應(yīng)量化方法的探索[J].中國(guó)醫(yī)學(xué)創(chuàng)新，2014，11（18）：45-48.

[9]侯苗苗，楊洋，李振華，等.電針刺激環(huán)跳穴緩解大鼠炎癥性疼痛的方法[J].中國(guó)醫(yī)學(xué)創(chuàng)新，2015，12（19）：22-24.

[10] Li T T，Ren W H，Xiao X，et al.NMDA NR2A and NR2B receptors in the rostral anterior cingulate cortex contribute to pain-related aversion in male rats[J].Pain，2009，146（1-2）：183-193.

[11] Asmundson G J，Katz J.Understanding the co-occurrence of anxiety disorders and chronic pain： state-of-the-art[J].Depress Anxiety，2009，26（10）：888-901.

[12] Gureje O.Psychiatric aspects of pain[J].Curr Opin Psychiatry，2007，20（1）：42-46.

[13] Crombez G，Vlaeyen J W，Heuts P H，et al.Pain-related fear is more disabling than pain itself： evidence on the role of pain-related fear in chronic back pain disability[J].Pain，1999，80（1-2）：329-339.

[14]邵楓，林文娟，陳極寰.慢性情緒應(yīng)激對(duì)大鼠行為的影響及變化趨勢(shì)[J].中國(guó)行為醫(yī)學(xué)科學(xué)，2003，12（1）：5-17.

[15] Hummel M，Lu P，Cummons T A，et al.The persistence of a long-term negative affective state following the induction of either acute or chronic pain[J].Pain，2008，140（3）：436-445.

[16] Sewards T V，Sewards M.Separate，parallel sensory and hedonic pathways in the mammalian somatosensory system[J].Brain Res Bull，2002，58（3）：243-260.

（收稿日期：2017-05-18） （本文編輯：程旭然）endprint