黃腫樹(shù)JcFATA基因原核表達(dá)載體構(gòu)建及表達(dá)體系優(yōu)化

劉穎++劉國(guó)選++黃川騰++楊亞利++唐家年++周開(kāi)源++林詩(shī)婉++高美芳++吳東霖++陳建平

摘要 植物脂酰-?；d體蛋白硫酯酶A（fatty acyl acyl carrier protien thioesterase，F(xiàn)ATA）是脂肪酸積累過(guò)程中的關(guān)鍵酶，直接調(diào)控脂肪酸的含量與組成。目前有關(guān)黃腫樹(shù)脂酰-ACP硫酯酶A基因（JcFATA）（GenBank登陸號(hào)：EU267122.2）的功能研究還未見(jiàn)報(bào)道。對(duì)JcFATA基因進(jìn)行原核表達(dá)是研究JcFATA基因功能的一種重要手段，而開(kāi)展這項(xiàng)研究的前提是構(gòu)建原核表達(dá)載體。因此，本研究以黃腫樹(shù)cDNA為模板克隆出JcFATA基因原核表達(dá)片段，將其連接到帶有His標(biāo)簽的原核表達(dá)載體pCold I上，將所構(gòu)建的重組載體pCold I-JcFATA轉(zhuǎn)入大腸桿菌Rosseta。為了表達(dá)更多的可溶性His-JcFATA融合蛋白，本文還探討了不同IPTG濃度（0.1、0.5、1.0 mmol/L）、不同誘導(dǎo)溫度（15、25、37 ℃）和不同誘導(dǎo)時(shí)間（0、15、30 h）對(duì)蛋白表達(dá)的影響，誘導(dǎo)產(chǎn)物經(jīng)超聲波裂解破碎后，利用SDS-PAGE比較分析融合蛋白表達(dá)量，從而確定最佳的表達(dá)體系。結(jié)果表明，當(dāng)添加誘導(dǎo)劑IPTG的濃度為0.5 mmol/L，誘導(dǎo)時(shí)間為15 h，培養(yǎng)溫度為25 ℃時(shí)，可以獲得較多的可溶性融合蛋白（His-JcFATA）。此外，進(jìn)行蛋白純化時(shí)發(fā)現(xiàn)，在鎳柱上進(jìn)行第5次洗脫時(shí)所獲得純化蛋白質(zhì)量最佳。本研究的結(jié)果可為進(jìn)一步研究JcFATA基因的功能奠定基礎(chǔ)。

關(guān)鍵詞 黃腫樹(shù)；JcFATA基因；原核表達(dá)；蛋白純化

中圖分類(lèi)號(hào) S72；Q75；Q78 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼 A 文章編號(hào) 1007-5739（2017）19-0136-04

Abstract The fatty acyl carrier protien thioesterase（FATA） is a key enzyme in the accumulation of fatty acids，which directly regulates the content and composition of fatty acids.The function of the acyl-ACP thioesterase A gene（GenBank accession number：EU267122.2） in Jatropha curcas has not been reported before.An important method to analyze the function of JcFATA gene is the prokaryotic expression，and the prerequisite of which is to construct prokaryotic expression vector.The JcFATA gene was cloned from J.curcas cDNA and inserted into the prokaryotic expression vector pCold I with His-tag.The recombinant vector pCold I-JcFATA was transformed into Escherichia coli Rosseta.In order to express more soluble fusion proteins His-JcFATA，different IPTG concentrations（0.1，0.5 and 1.0 mmol/L），different induction temperatures（15，25 and 37 ℃） and different induction times（0，15 and 30 h） were investigated on the protein expression.After the cells were disrupted by ultrasound，the expression of the fusion protein was analyzed by 12% SDS-PAGE to determine the optimal expression condition.The results showed that the soluble fusion protein（His-JcFATA） could be obtained better when the concentration of the inducer IPTG was 0.5 mmol/L，the induction time was 15 h，and the culture temperature was 25 ℃.In addition，the study also showed that the fifth elution for protein purification on the nickel column might obtain the best quality of purified protein.The results of this study can lay a foundation for the further analyzing functions of JcFATA gene.

Key words Jatropha curcas；JcFATA gene；prokaryotic expression；protein purification

黃腫樹(shù)（Jatropha curcas）是大戟科（Euphorbiaceae）麻瘋樹(shù)屬（Jatropha）多年生木本植物，也是世界公認(rèn)的一種非常具有開(kāi)發(fā)潛能的能源植物，其種子油被認(rèn)為是生產(chǎn)“生物柴油”的優(yōu)良原料[1-2]。目前，雖然黃腫樹(shù)的種植面積還在不斷擴(kuò)大，同時(shí)基礎(chǔ)研究也在逐漸深入，但還存在一些限制其產(chǎn)業(yè)化發(fā)展的問(wèn)題，如種子油的總產(chǎn)量過(guò)低和油脂的質(zhì)量不佳等[3-5]。Qu等[1]的研究結(jié)果表明，黃腫樹(shù)中脂肪酸的含量和組成比例，可能會(huì)直接影響黃腫樹(shù)種子油的質(zhì)量和總含油量。而植物種子油的生成和脂肪酸的積累都是由相關(guān)功能基因來(lái)調(diào)控，如甘油-3-磷酸?；D(zhuǎn)移酶（glycerol phosphate acyltransferase，GPAT）、ω-3脂肪酸去飽和酶（ω-3 fatty acid desaturase，F(xiàn)AD）、磷脂酶D（Phospholipase D，PLD）等，這些基因都參與油脂的合成，并在脂肪酸合成代謝中起重要的調(diào)節(jié)作用[6-8]。因此，為了培育高產(chǎn)優(yōu)質(zhì)黃腫樹(shù)新品種，有必要對(duì)其脂肪酸積累相關(guān)功能基因進(jìn)行研究。

植物脂酰-?；d體蛋白硫酯酶A（Fatty acyl acyl carrier protien thioesterase，F(xiàn)ATA）是一類(lèi)由細(xì)胞核基因編碼的，主要是以二聚體的形式存在質(zhì)體球蛋白，其主要功能可能是在脂肪酸合成代謝過(guò)程中催化?；?ACP水解，對(duì)游離脂肪酸的釋放起重要調(diào)控作用，直接影響脂肪酸的含量與組成[9-10]。目前，有關(guān)黃腫樹(shù)JcFATA基因的功能研究還未見(jiàn)報(bào)道。對(duì)JcFATA基因進(jìn)行原核表達(dá)是研究JcFATA基因功能的一種重要手段，為進(jìn)一步分析黃腫樹(shù) JcFATA蛋白結(jié)構(gòu)和功能的關(guān)系提供了試驗(yàn)基礎(chǔ)，而開(kāi)展這些研究的前提是構(gòu)建原核表達(dá)載體并獲取純化的目的蛋白。因此，本研究擬從黃腫樹(shù)中克隆JcFATA蛋白的編碼基因，并構(gòu)建JcFATA基因的原核表達(dá)載體，將其導(dǎo)入大腸桿菌中進(jìn)行表達(dá)；為能誘導(dǎo)表達(dá)出較大量的可溶性蛋白，還將對(duì)表達(dá)和純化體系進(jìn)行優(yōu)化，為進(jìn)一步開(kāi)展該基因的功能研究奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 供試菌株與載體

大腸桿菌菌株（Escherichia coli）DH5α和Rosseta以及農(nóng)桿菌菌株（Agrobacterium tumefaciens）EHA105由廣東海洋大學(xué)農(nóng)學(xué)院植物生物技術(shù)與分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)室保存。原核表達(dá)載體pCold Ⅰ載體（His標(biāo)簽），由華南農(nóng)業(yè)大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院實(shí)驗(yàn)室惠贈(zèng)。

1.2 主要試劑

RNA抽提試劑盒購(gòu)自Solar公司（美國(guó)），進(jìn)行目的片段PCR擴(kuò)增的高保真酶KOD-plus試劑盒購(gòu)自TOYOBO公司（日本），總DNA提取試劑盒、質(zhì)粒提取試劑盒和DNA凝膠回收試劑盒均購(gòu)自TIANGEN公司（北京），普通Taq酶、各種限制性內(nèi)切酶、T4 DNA連接酶、反轉(zhuǎn)錄試劑盒和Mighty Amp DNA polymarase試劑盒為T(mén)aKaRa公司產(chǎn)品（日本），PCR引物由廣州捷瑞公司合成（廣州），低分子量蛋白質(zhì)Marker（14.4～97.4 kD）購(gòu)自貝斯特公司（中國(guó)），其余常規(guī)試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 總RNA提取及cDNA的合成。黃腫樹(shù)總RNA提取采用Solar公司的RNA抽提試劑盒進(jìn)行，具體操作步驟依據(jù)試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。從黃腫樹(shù)幼嫩的葉片中提取總RNA，根據(jù)TaKaRa反轉(zhuǎn)錄試劑盒說(shuō)明書(shū)將總RNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA。

1.3.2 黃腫樹(shù)JcFATA基因的克隆及回收。根據(jù)美國(guó)國(guó)立生物技術(shù)信息中心（National Center for Biotechnology Information，NCBI）所提供的黃腫樹(shù)JcFATA基因序列（NCBI Genbank登陸號(hào)為EU267122.2，1 110 bp），用Primer 5.0軟件設(shè)計(jì)特異引物，上游引物序列為F1：5′-AAAAGGATCCATGATGTTGAA GGTACCGTG-3′（劃線處為BamH I酶切位點(diǎn)），下游引物序列為F2：5′-AAAACTGCAGTCATCTGGAGGGCTTCTTTC-3′（劃線處為PstI酶切位點(diǎn)）。以黃腫樹(shù)cDNA為模板，采用引物F1和F2進(jìn)行PCR擴(kuò)增。25 μL PCR擴(kuò)增體系：2.5 μL 10×KOD Buffer、1 μL MgSO4（25 mmol/L）、2.5 μL dNTP（2 mmol/L）、引物F1/F2（10 μmol/L）各0.5 μL、0.5 μL KOD-plus酶（5 U/μL）、0.5 μL黃腫樹(shù)cDNA和17 μL無(wú)菌去離子水。PCR反應(yīng)程序：94 ℃ 4 min；94 ℃ 30 s，54 ℃ 30 s，68 ℃ 1∶20 min，35個(gè)循環(huán)；最后68 ℃ 10 min，25 ℃ 1 min。采用DNA凝膠回收試劑盒回收目的條帶，-20 ℃保存回收產(chǎn)物。

1.3.3 JcFATA基因原核表達(dá)載體的構(gòu)建。對(duì)pCold Ⅰ質(zhì)粒和JcFATA基因分別用BamH Ⅰ和Pst Ⅰ進(jìn)行雙酶切，回收雙酶切后的質(zhì)粒和目的片段，用T4 DNA連接酶連接。將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化至DH5α感受態(tài)細(xì)胞中，涂板培養(yǎng)后進(jìn)行搖菌、雙酶切鑒定（BamH Ⅰ和Pst Ⅰ）和菌液PCR鑒定。進(jìn)行菌液PCR鑒定時(shí)以pCold Ⅰ質(zhì)粒為陽(yáng)性對(duì)照，水為陰性對(duì)照。PCR檢測(cè)反應(yīng)體系：采用15 μL反應(yīng)體系，其中7.5 μL 2×Mighty Amp Buffer Ver.2、引物F1/F2（10 μmol/L）各0.2 μL、一點(diǎn)菌液為檢測(cè)對(duì)象、0.2 μL Mighty Amp DNApolymarase和6.9 μL無(wú)菌去離子水。PCR檢測(cè)反應(yīng)程序：98 ℃ 2 min；98 ℃ 10 s，60 ℃ 15 s，68 ℃ 1：20 min，30個(gè)循環(huán)；最后68 ℃ 10 min，25 ℃ 1 min，采用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)PCR產(chǎn)物。將雙酶切和菌液PCR檢測(cè)均為陽(yáng)性的克隆命名為pCold Ⅰ-JcFATA，最后對(duì)重組質(zhì)粒進(jìn)行測(cè)序，將測(cè)序正確的重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)入大腸桿菌菌株Rosseta感受態(tài)細(xì)胞中，形成表達(dá)菌株pCold Ⅰ-JcFATA-Rosseta。

1.3.4 JcFATA基因原核表達(dá)。進(jìn)行JcFATA基因原核表達(dá)主要參考Cheng等[11]報(bào)道的方法。將上述測(cè)序正確的重組質(zhì)粒（pCold Ⅰ-JcFATA）轉(zhuǎn)化大腸桿菌菌株Rosseta，在陽(yáng)性克隆中挑取單菌落至3 mL含100 mg/L氨芐青霉素（Ampicillin，Amp）的Lysogeny Broth（LB）液體培養(yǎng)基[12]中，恒溫?fù)u床上（37 ℃，200 r/min）振蕩培養(yǎng)過(guò)夜；將200 μL過(guò)夜菌接種至20 mL含100 mg/L Amp的LB液體培養(yǎng)基中，恒溫?fù)u床上（37 ℃，200 r/min）振蕩培至OD600=0.4～0.6，用含100 mg/L Amp的LB液體培養(yǎng)基調(diào)節(jié)菌液OD600=0.4，將菌液在冰上放置10～15 min，再分別對(duì)異丙基-β-D-硫代半乳糖苷（Isopropyl β-D-1-thiogalactopyranoside，IPTG）濃度、誘導(dǎo)溫度及誘導(dǎo)時(shí)間3種條件進(jìn)行探討，IPTG終濃度分別設(shè)定為0、0.1、0.5、1.0 mmol/L，誘導(dǎo)溫度設(shè)定為15、25、37 ℃，誘導(dǎo)時(shí)間分別為0、15、30 h，最后取樣品進(jìn)行十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠（Sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis，SDS-PAGE）電泳（具體方法見(jiàn)1.3.5），通過(guò)分析蛋白表達(dá)量確定最佳表達(dá)體系。

1.3.5 SDS-PAGE檢測(cè)JcFATA蛋白的表達(dá)情況。利用SDS-PAGE檢測(cè)JcFATA蛋白的表達(dá)情況主要參照Bi等[13]報(bào)道的方法。先將10% SDS-PAGE分離膠緩慢倒入膠板中，直至距離梳子約0.5 cm，凝膠約3 h后再將4% SDS-PAGE積層膠緩慢倒入膠板中，插入梳子，凝膠約1 h，即制成目的蛋白電泳檢測(cè)所需的SDS-PAGE。將菌液轉(zhuǎn)移到1.5 mL離心管，12 000 r/min離心2 min收集菌體，向其加入0.5 mL Lysis Buffer懸浮細(xì)胞，冰水浴中采用240 W超聲波破碎3次，每次5 min，4 ℃ 12 000 r/min離心2 min，取上清液進(jìn)行SDS-PAGE電泳。電泳完成后將凝膠取出，用雙蒸水沖洗2～3次，然后在考馬斯亮藍(lán)R-250染色液中振蕩染色2～3 h，用脫色液脫色2～3次，檢測(cè)目的蛋白的表達(dá)情況。

1.3.6 可溶性蛋白的純化。進(jìn)行可溶性蛋白的純化主要參照Z(yǔ)hu等[14]報(bào)道的方法。分別接種表達(dá)菌株和空白對(duì)照菌株于5 mL含100 mg/L Amp的LB液體培養(yǎng)基（種子液）中，37 ℃ 200 r/min振蕩培養(yǎng)過(guò)夜，再將其接種至添加了0.5 mmol/L IPTG的100 mL上述液體培養(yǎng)基中，在培養(yǎng)溫度為25 ℃的條件下，振蕩培養(yǎng)15 h進(jìn)行蛋白誘導(dǎo)，8 000 r/min離心5 min收集菌體，置于-20 ℃冷凍過(guò)夜，加入5 mL Lysis Buffer懸浮細(xì)胞，240 W超聲波冰水浴破碎3次，每次5 min，4 ℃ 12 000 r/min離心10 min，取上清液備用；取帶有6×His標(biāo)簽的鎳（Ni）純化柱（康為世紀(jì)，北京）（30%乙醇保存），將其活化后置于4 ℃ 冰箱中進(jìn)行預(yù)冷處理，向其加入上述上清液，4 ℃ 條件下緩慢搖動(dòng)1 h，收集排出液F，再向Ni柱分2次分別加4 mL Wash Buffer，依次收集排出液W1和W2；再向Ni柱分7次分別加0.5 mL Elution Buffer，依次收集洗脫液E1、E2、E3、E4、E5、E6和E7。將上述收集液進(jìn)行SDS-PAGE電泳分析，將經(jīng)過(guò)電泳檢測(cè)的純化目的蛋白置于15 mL超濾離心管（截留分子量為30 KD），4 ℃ 3 000 r/min離心5 min，最后向濃縮后的目的蛋白中加入等體積30%甘油，混勻后，置于 -70 ℃保存。

2 結(jié)果與分析

2.1 JcFATA基因原核表達(dá)片段擴(kuò)增

以黃腫樹(shù)cDNA為模板，設(shè)計(jì)特異性的引物F1和F2進(jìn)行PCR擴(kuò)增，獲得了JcFATA基因原核表達(dá)片段，經(jīng)過(guò)凝膠電泳檢測(cè)后發(fā)現(xiàn)擴(kuò)增片段大小與預(yù)期符合（1 110 bp）（圖1）。

2.2 JcFATA基因原核表達(dá)載體構(gòu)建和轉(zhuǎn)化

用BamHⅠ和PstⅠ將pCold Ⅰ質(zhì)粒和JcFATA基因原核表達(dá)片段進(jìn)行雙酶切，接著將酶切后的目的片段和載體進(jìn)行連接，然后轉(zhuǎn)化大腸桿菌，經(jīng)過(guò)平板篩選后，對(duì)陽(yáng)性克隆進(jìn)行培養(yǎng)并提取質(zhì)粒，最后進(jìn)行酶切檢測(cè)（BamHⅠ和PstⅠ）（圖2）和菌液PCR檢測(cè)（圖3），結(jié)果均顯示片段大小與預(yù)期符合（1 110 bp）。將陽(yáng)性克隆進(jìn)一步測(cè)序檢測(cè)，結(jié)果顯示pCold Ⅰ-JcFATA載體已經(jīng)構(gòu)建成功。將測(cè)序完全準(zhǔn)確地克隆轉(zhuǎn)入大腸桿菌Rosseta感受態(tài)細(xì)胞，產(chǎn)生重組菌株pCold Ⅰ-JcFATA-Rosseta。

2.3 JcFATA基因原核表達(dá)體系優(yōu)化體系優(yōu)化

2.3.1 誘導(dǎo)時(shí)間和IPTG濃度對(duì)融合蛋白His-JcFATA誘導(dǎo)的影響。由于在預(yù)試驗(yàn)中重組pCold Ⅰ-JcFATA-Rosseta菌液在通常的表達(dá)體系中難以大量表達(dá)出可溶性蛋白，不利于后續(xù)蛋白分離和純化，因而有必要對(duì)其原核表達(dá)體系進(jìn)行優(yōu)化。本研究在誘導(dǎo)溫度都為25 ℃的條件下，分別對(duì)誘導(dǎo)時(shí)間和IPTG濃度進(jìn)行了探討，優(yōu)化His-Tag融合蛋白His-JcFATA誘導(dǎo)表達(dá)體系。不同誘導(dǎo)體系的超聲破碎產(chǎn)物上清液經(jīng)SDS-PAGE電泳分析，從而確定最佳條件，試驗(yàn)結(jié)果如圖4所示。

由圖4可知，3種對(duì)照組CK0（未添加IPTG的pCold Ⅰ-JcFATA-Rosseta菌液）、CK1（添加0.5 mmol/L IPTG的pCold I-Rosseta菌液）和CK2（pCold Ⅰ-Rosseta菌液），經(jīng)過(guò)誘導(dǎo)都不能表達(dá)目的蛋白，說(shuō)明IPTG是誘導(dǎo)目的蛋白His-JcFATA表達(dá)所必需的，同時(shí)不含目的基因JcFATA的菌液即使添加IPTG也不能產(chǎn)生目的蛋白。

由圖4還可知，在IPTG濃度相同條件下，誘導(dǎo)時(shí)間的不同，誘導(dǎo)產(chǎn)生的His-Tag融合蛋白His-JcFATA（約48 KD）的表達(dá)量也不同，當(dāng)誘導(dǎo)時(shí)間為15 h時(shí)，可以獲得最佳的誘導(dǎo)效果。在誘導(dǎo)時(shí)間相同的條件下，隨著IPTG濃度的增加，誘導(dǎo)產(chǎn)生的融合蛋白的表達(dá)量也會(huì)改變，當(dāng)IPTG濃度為0.5 mmol/L時(shí)，可以獲得最佳的融合蛋白表達(dá)量。

2.3.2 誘導(dǎo)溫度對(duì)His融合蛋白His-JcFATA誘導(dǎo)的影響。為了進(jìn)一步優(yōu)化His-Tag融合蛋白His-JcFATA誘導(dǎo)表達(dá)體系，本研究在誘導(dǎo)時(shí)間為15 h和添加0.5 mmol/L IPTG的條件下，對(duì)誘導(dǎo)溫度進(jìn)行了探討，進(jìn)一步優(yōu)化His-Tag融合蛋白His-JcFATA誘導(dǎo)表達(dá)體系。不同誘導(dǎo)體系的超聲破碎產(chǎn)物上清液經(jīng)SDS-PAGE電泳分析，從而確定最佳條件。由圖5可知，隨著誘導(dǎo)溫度的提高，目的蛋白的表達(dá)量也隨之增加，當(dāng)誘導(dǎo)溫度為25 ℃時(shí)，可以獲得最佳的誘導(dǎo)效果，而當(dāng)誘導(dǎo)溫度超過(guò)25 ℃時(shí)，誘導(dǎo)產(chǎn)生的His-Tag融合蛋白His-JcFATA表達(dá)量會(huì)有所減少。

2.4 His-Tag融合蛋白His-JcFATA純化

His-Tag融合蛋白是目前最常見(jiàn)、最成熟的表達(dá)方式，它的優(yōu)點(diǎn)是表達(dá)方便而且基本不影響蛋白的活性，無(wú)論是表達(dá)的蛋白是可溶性的或者包涵體都可以用固定金屬離子親和色譜法（Immobilized Metal-ion affinity chromatography，IMAC）來(lái)純化[15-16]。

本研究對(duì)純化體系進(jìn)行優(yōu)化，試驗(yàn)結(jié)果如圖6所示。由圖6可知，在進(jìn)行蛋白純化前，表達(dá)產(chǎn)物中有一些其他的蛋白成分（圖6中的15 h和上清條帶）；發(fā)現(xiàn)第3次洗脫（圖6中的E3條帶）時(shí)，可以獲得最多的His-Tag融合蛋白His-JcFATA，而從第5次（圖6中的E5條帶）洗脫開(kāi)始，可以獲得較為純凈的目的蛋白。綜上所述，收獲目的蛋白最好是在第5次洗脫時(shí)開(kāi)始收集。

3 討論與結(jié)論

3.1 討論

FATA是植物脂肪酸合成代謝中的關(guān)鍵酶，在游離脂肪酸的釋放過(guò)程中起核心調(diào)控的作用，可能直接影響脂肪酸的含量與組成[1，9-10]。本研究通過(guò)基因重組技術(shù)獲得了黃腫樹(shù)JcFATA基因的原核表達(dá)載體，并在大腸桿菌中成功表達(dá)了帶His標(biāo)簽的JcFATA融合蛋白；此外，還建立了較好的蛋白純化方法，獲得了較高純度的融合蛋白His-JcFATA。

誘導(dǎo)外源基因的原核表達(dá)受IPTG濃度、誘導(dǎo)時(shí)間和誘導(dǎo)溫度等因素的影響[17]。首先，誘導(dǎo)溫度的高低直接影響到蛋白表達(dá)成功與否，以及影響所表達(dá)蛋白的溶解性。前人的研究表明一般在37 ℃的溫度下最有利于大腸桿菌的快速增長(zhǎng)，蛋白表達(dá)速度最快，獲得的蛋白量最大[18-20]。然而，本研究的結(jié)果顯示25 ℃為最佳誘導(dǎo)溫度，這可能是由于本次研究所使用的原核表達(dá)載體為pCold Ⅰ，該載體具有冷休克蛋白基因（Cold shock protein A，CSPA）啟動(dòng)子，該啟動(dòng)子功能強(qiáng)大，能在較低溫度下高效的誘導(dǎo)目的基因表達(dá)；同時(shí)使用這種低溫高效表達(dá)載體還可以有效減少由于高溫條件下蛋白的快速合成從而導(dǎo)致形成較多的蛋白包涵體（包涵體不具有可溶性且蛋白的活性低）的現(xiàn)象發(fā)生。另外，IPTG濃度也會(huì)嚴(yán)重影響對(duì)蛋白的表達(dá)，IPTG濃度過(guò)高不利于大量目的蛋白的獲得，這可能是由于IPTG本身對(duì)菌株有一定的毒性，因而過(guò)高的IPTG誘導(dǎo)濃度反而會(huì)抑制目的蛋白的表達(dá)。

pCold Ⅰ載體含有的His標(biāo)簽可作為純化的標(biāo)記，經(jīng)誘導(dǎo)表達(dá)的重組蛋白經(jīng)過(guò)帶有His標(biāo)簽的鎳柱時(shí)會(huì)被選擇性吸附，再經(jīng)過(guò)洗脫后就可以獲得純化的目的蛋白。由于His標(biāo)簽很小、不帶電荷且沒(méi)有免疫原性，因而它不會(huì)影響融合蛋白在細(xì)胞內(nèi)的分泌和折疊，也不會(huì)對(duì)所純化蛋白的結(jié)構(gòu)與功能產(chǎn)生干擾作用[15-16]。

在蛋白純化過(guò)程中，可能由于一些非特性蛋白與目的融合蛋白His-JcFATA競(jìng)爭(zhēng)性的與His親和介質(zhì)結(jié)合，導(dǎo)致純化的目的蛋白純度不高。為了獲得高純度的His-JcFATA融合蛋白，本研究對(duì)蛋白的純化條件進(jìn)行了優(yōu)化，結(jié)果表明，洗脫次數(shù)非常關(guān)鍵，洗脫次數(shù)太少，所獲得的目的蛋白純度不夠，當(dāng)洗脫次數(shù)達(dá)到5次時(shí)可獲得較高純度的融合蛋白His-JcFATA。本研究的結(jié)果為進(jìn)一步分析JcFATA蛋白的結(jié)構(gòu)與功能奠定研究基礎(chǔ)。

3.2 結(jié)論

本研究將克隆的JcFATA基因表達(dá)片段插入到原核表達(dá)載體pCold Ⅰ中，將其轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α，經(jīng)過(guò)氨芐青霉素抗性篩選、酶切檢測(cè)和菌液PCR鑒定，確認(rèn)成功構(gòu)建了JcFATA基因原核表達(dá)載體（pCold Ⅰ-JcFATA），將pCold Ⅰ-JcFATA轉(zhuǎn)入大腸桿菌Rosseta，形成pCold Ⅰ-JcFATA-Rosseta原核表達(dá)菌株，對(duì)其進(jìn)行原核表達(dá)誘導(dǎo)并優(yōu)化了表達(dá)體系（最佳誘導(dǎo)條件：IPTG濃度為0.5 mmol/L，誘導(dǎo)時(shí)間為15 h，培養(yǎng)溫度為25 ℃）和純化條件（洗脫次數(shù)達(dá)到5次），為進(jìn)一步深入研究JcFATA基因和蛋白的功能奠定基礎(chǔ)。

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