外周血p73基因聯(lián)合CEA檢測在結(jié)直腸癌早期篩查中的意義

龍海華　賈安平　尹琦　龐麗萍　劉振鵬

【摘要】 目的：探討外周血p73基因甲基化聯(lián)合CEA檢測在結(jié)直腸癌早期篩查中的臨床意義。方法：選取2013年6月-2017年3月本院住院患者142例，將其分為結(jié)直腸癌組64例和結(jié)直腸瘤組78例，另選取健康體檢者142例為健康對照組。采用甲基化特異性PCR（MSP）對所有受檢者行血漿p73基因甲基化檢測，并測定血清CEA。比較單獨(dú)與聯(lián)合檢測聯(lián)合血漿p73基因甲基化及血清CEA對結(jié)直腸癌的診斷準(zhǔn)確性、陰性預(yù)測值、敏感性及特異性。結(jié)果：結(jié)直腸癌組血漿p73基因甲基化、血清CEA和聯(lián)合檢測的陽性率均明顯高于結(jié)直腸瘤組和健康對照組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.001）；且結(jié)直腸瘤組均明顯高于健康對照組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.001）。聯(lián)合血漿p73基因甲基化測定和血清CEA對結(jié)直腸癌的診斷敏感性優(yōu)于單獨(dú)檢測（ 字2=9.581、16.762，P<0.01）；陰性預(yù)測值高于單獨(dú)檢測，特異性低于單獨(dú)檢測，但差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）。結(jié)論：聯(lián)合血漿p73基因甲基化測定及血清CEA對結(jié)直腸癌的早期篩查有重要的臨床意義。

【關(guān)鍵詞】 p73基因； 甲基化； 結(jié)直腸癌； 聯(lián)合檢測

Diagnostic Value of Peripheral Blood p73 Gene Methylation Combined with CEA in Early Screening of Colorectal Cancer/LONG Hai-hua，JIA An-ping，YIN Qi，et al.//Medical Innovation of China，2017，14（27）：119-122

【Abstract】 Objective：To explore the diagnostic value of peripheral blood p73 gene methylation combined with CEA in early screening of colorectal cancer.Method：142 cases of hospitalized from June 2013 to March 2017 were selected，they were divided into colorectal cancer group（64 cases） and colorectal tumor group（78 cases），another 142 healthy subjects were selected as healthy control group.The methylation specific PCR（MSP） was used to detect plasma p73 gene methylation in all subjects，and the serum CEA was determined.The diagnostic accuracy，negative predictive value，sensitivity and specificity of the single and combined plasma p73 gene methylation positive rate and serum CEA of colorectal cancer were compared.Result：The positive rate of p73 gene methylation，serum CEA and joint detection in colorectal cancer group were significantly higher than those in colorectal tumor group and healthy control group，the differences were statistically significant （P<0.001）；and the colorectal tumor group was significantly higher than the healthy control group，the difference was statistically significant（P<0.001）.Joint p73 gene methylation determination of plasma and serum CEA was superior to the single detection for diagnosis of colorectal cancer susceptibility（ 字2=9.581，16.762，P<0.01）；the negative predictive value was higher than that of the individual，and the specificity was lower than that of the individual，but the differences were not statistically significant（P>0.05）.Conclusion：Plasma p73 gene methylation measurement combined with of serum CEA has important clinical significance for early screening of colorectal cancer.

【Key words】 p73 gene； Methylation； Colorectal cancer； Combination of detecting

First-authors address：Liutie Central Hospital of Liuzhou City，Liuzhou 545007，Chinaendprint

doi：10.3969/j.issn.1674-4985.2017.27.034

結(jié)直腸癌（Colorectal cancer，CRC）是消化道常見的惡性腫瘤，2015年我國CRC發(fā)病率呈明顯上升趨勢[1-2]，早期診斷CRC的患者5年生存率可達(dá)90%[3]。p73基因啟動子甲基化的異常與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān)[4-7]，而CEA是消化道腫瘤的重要腫瘤標(biāo)準(zhǔn)物[8-11]。本研究對外周血p73基因甲基化狀態(tài)及血清CEA進(jìn)行檢測，觀察聯(lián)合兩種檢測對CRC早期篩查的臨床意義，現(xiàn)報(bào)道如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選取2013年6月-2017年3月本院住院患者142例，患者均無明確惡性腫瘤疾病史，未接受放療、化療及免疫抑制等治療。以組織病理學(xué)為依據(jù)，將其分為結(jié)直腸癌組64例，男36例，女

28例，年齡31～85歲，中位年齡52歲；結(jié)直腸瘤組78例，男43例，女35例，年齡27～88歲，中位年齡47歲；另選取健康體檢者142例為健康對照組，男67例，女75例，年齡25～89歲，中位年齡42歲。本研究經(jīng)醫(yī)院倫理委員會審核批準(zhǔn)，在采集外周血及組織標(biāo)本前宣教本研究目的及意義，取得受檢者的知情同意。

1.2 方法

1.2.1 治療方法 病理活檢確診結(jié)直腸癌患者均行外科手術(shù)治療，包括根治術(shù)加周圍淋巴結(jié)清掃及姑息手術(shù)；確診結(jié)直腸瘤患者行腸鏡下息肉切除術(shù)或黏膜剝離術(shù)，病理提示切緣無癌細(xì)胞者予臨床隨訪，病理提示找到癌細(xì)胞則追加手術(shù)，納入結(jié)直腸癌組。

1.2.2 標(biāo)本處理 治療前受檢者均空腹抽取外周靜脈血10 mL，其中5 mL全血靜止分層后，3000 r/min，離心5 min分離血漿，置于-20 ℃冰箱保存，使用時(shí)將冷凍血漿置于室溫30 min后利用血清/血漿游離DNA提取試劑盒（北京天根生化科技，貨號：DP339）對DNA進(jìn)行裂解、磁珠結(jié)合、洗滌、洗脫等處理，獲得DNA洗脫液，保存于-20 ℃冰箱中；另5 mL全血送生化室進(jìn)行血清CEA檢測。

1.2.3 亞硫酸鹽轉(zhuǎn)化 按照DNA重亞硫酸鹽轉(zhuǎn)化試劑盒（北京天根生化科技，貨號：DP215-02）說明書進(jìn)行操作，經(jīng)3次洗滌及1次洗脫后回收亞硫酸鹽轉(zhuǎn)化的DNA洗脫液，封存于96孔板，置于-80 ℃保存。

1.2.4 p73基因甲基化特異性PCR（MSP） 將符合要求的血漿標(biāo)本送本院生化免疫室，按甲基化特異性PCR試劑盒（北京天根生化科技，貨號：EM101-01）說明書進(jìn)行操作。PCR條件：94 ℃熱啟動20 min，62 ℃ 5 s，56 ℃ 35 s，93 ℃ 30 s，45個(gè)循環(huán)，40 ℃ 5 s。電泳蒼梧行4%瓊脂糖電泳，使用Bio-Rad公司Gel DoTM XR凝膠成像系統(tǒng)分析后進(jìn)行測序。引物序列參照文獻(xiàn)[12]，由北京天根生化科技公司合成，非甲基化引物（p73-U），F(xiàn)：5-AGGGGATGTAGTGAAATTGGGGTTT-，R：5-CCATCACAACCCCAAACATCA-3，擴(kuò)增產(chǎn)物69 bp；甲基化引物（p73-M），F(xiàn)：5-GGACGTAGCGAAATCGGGGTTC-3，R：5-ACCCCGAACATCGACGTCCG-3，擴(kuò)增產(chǎn)物60 bp。

1.3 觀察指標(biāo)與判定標(biāo)準(zhǔn) p73甲基化及非甲基化預(yù)測的目標(biāo)片段大小分別為60、69 bp。將擴(kuò)增產(chǎn)物條帶的大小與預(yù)測的目標(biāo)片段大小進(jìn)行比對，特異性擴(kuò)增產(chǎn)物中出現(xiàn)大小為60 bp的擴(kuò)增片段，無論是否含有69 bp大小的擴(kuò)增片段，均判為p73甲基化陽性，特異性擴(kuò)增片段只有大小為69 bp的擴(kuò)增片段，則判為p73甲基化陰性。血清CEA>5 μg/L為陽性標(biāo)準(zhǔn)。聯(lián)合檢測時(shí)，如有1項(xiàng)檢測結(jié)果陽性即判為聯(lián)合檢測陽性，檢測結(jié)果均陰性才判為聯(lián)合檢測陰性。敏感性=結(jié)直腸癌組中陽性例數(shù)/結(jié)直腸癌總例數(shù)×100%；特異性=非結(jié)直腸癌組中陰性例數(shù)/非結(jié)直腸癌組總例數(shù)×100%；陽性預(yù)測值=[結(jié)直腸癌組中陽性例數(shù)/（結(jié)直腸癌組中陽性例數(shù)+非結(jié)直腸癌組中假陽性例數(shù)）]×100%；陰性預(yù)測值=[非結(jié)直腸癌組中真陰性例數(shù)/（結(jié)直腸癌組中假陰性例數(shù)+非結(jié)直腸癌組中真陰性例數(shù)）]×100%。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS 13.0軟件對所得數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，計(jì)量資料用（x±s）表示，比較采用t檢驗(yàn)；計(jì)數(shù)資料以率（%）表示，比較采用 字2檢驗(yàn)或Kruskal-Wallis檢驗(yàn)。以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 三組的血漿p73基因甲基化及血清CEA陽性率比較 結(jié)直腸癌組血漿p73基因甲基化、血清CEA和聯(lián)合檢測陽性率均明顯高于結(jié)直腸瘤組和健康對照組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（ 字2=16.473、18.192、33.199，P<0.001； 字2=83.700、68.700、129.633，P<0.001）；且結(jié)直腸瘤組均明顯高于健康對照組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（ 字2=24.957、13.958、33.956，P<0.001）；結(jié)直腸癌組中聯(lián)合血漿p73基因甲基化測定和血清CEA的陽性率均高于單獨(dú)檢測，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（ 字2=14.083、9.524，P<0.01）；結(jié)直腸瘤組中，聯(lián)合血漿p73基因甲基化測定和血清CEA的陽性率高于單獨(dú)檢測血清CEA的陽性率，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（ 字2=7.692，P<0.01），與單獨(dú)檢測血漿p73基因甲基化的陽性率比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（ 字2=1.973，P>0.05）；健康對照組中，聯(lián)合血漿p73基因甲基化測定和血清CEA的陽性率與單獨(dú)檢測比較，差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（ 字2=0.851、0.890，P>0.05）。見表1。

2.2 血漿p73基因甲基化及血清CEA對CRC診斷的陽性預(yù)測值、陰性預(yù)測值、敏感性及特異性比較 血漿p73基因甲基化+血清CEA聯(lián)合檢測對結(jié)直腸癌的診斷敏感性高于單獨(dú)檢測，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（ 字2=9.581、16.762，P<0.01）；對診斷結(jié)直腸癌的陰性預(yù)測值高于單獨(dú)檢測，特異性低于單獨(dú)檢測，但差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05），見表2。endprint

3 討論

隨著分子生物學(xué)的發(fā)展，人們發(fā)現(xiàn)在腫瘤發(fā)展出現(xiàn)形態(tài)改變之前，往往先有癌基因的激活和抑癌基因的失活，對這些基因進(jìn)行檢測，將有助于結(jié)直腸癌（Colorectal cancer，CRC）的早期診斷[13]。CRC發(fā)生發(fā)展是內(nèi)外環(huán)境的多種因素共同參與、多階段變化積累的過程，目前仍未明確其確切的發(fā)病機(jī)制。選擇檢測哪種基因，從什么標(biāo)本中獲取該基因才能最有效地協(xié)助CRC的早期診斷和篩查已成為人們關(guān)注的焦點(diǎn)。由于外周血及糞便中檢測基因甲基化的可行性強(qiáng)，目前外周血基因檢測SEPT9基因已作為CRC早期診斷的檢測指標(biāo)進(jìn)入臨床運(yùn)用階段并納入指南[14]。隨著科學(xué)技術(shù)不斷發(fā)展，更多的甲基化標(biāo)志物將不斷被發(fā)現(xiàn)并與基因進(jìn)行聯(lián)合檢測，有助于CRC的早期診斷及有效治療[15]。

p73是抑癌基因p53家族中的成員，它的缺失或失活可活化癌基因，使細(xì)胞生長失控，導(dǎo)致惡性腫瘤的發(fā)生和發(fā)展[16]。因?yàn)槟[瘤細(xì)胞DNA可釋放入外周血，因此在患者血清和血漿內(nèi)可以檢測到的較高濃度的DNA異常甲基化[17]，腫瘤組織中DNA異常甲基化發(fā)生更早、準(zhǔn)確性更高，但組織學(xué)標(biāo)本相對較難留取，主要受內(nèi)鏡檢查條件、患者接受程度等客觀條件影響，而內(nèi)鏡檢查本身又受到患者腸道準(zhǔn)備情況、病灶所處部位、檢查者技術(shù)水平及檢查時(shí)間等因素的影響，而且還存在出血、穿孔等內(nèi)鏡檢查并發(fā)癥，患者依從性差。外周血的標(biāo)本取材更簡單、方便、快捷、微創(chuàng)，尋找外周血結(jié)直腸癌特異性分子標(biāo)志物對提高CRC的早期診斷有重要意義。本研究中，p73基因甲基化陽性率在結(jié)直腸癌組外周血中表達(dá)最高，其次為結(jié)直腸瘤組，健康對照組中p73基因甲基化陽性率較低。由此可見，在癌前病變時(shí)期就有一定的發(fā)現(xiàn)率，可作為報(bào)警指標(biāo)，利于早期發(fā)現(xiàn)瘤或癌的病變，幫助CRC的早診斷及早治療，但敏感性僅57.81%。將血漿p73基因甲基化測定與血清CEA聯(lián)合，其診斷結(jié)直腸癌的敏感性優(yōu)于單獨(dú)檢測（ 字2=9.581、16.762，P<0.01），體現(xiàn)了聯(lián)合檢測的優(yōu)勢。因此，血漿CEA聯(lián)合血清p73基因甲基化檢測可能更能適合CRC大范圍篩查的需要。

隨著科學(xué)技術(shù)不斷發(fā)展，更多的甲基化標(biāo)志物將不斷被發(fā)現(xiàn)[18-19]。這些標(biāo)志物不受性別、年齡、腫瘤部位的影響，聯(lián)合檢測將有助于CRC的早期診斷及有效治療。本研究中，血漿p73基因甲基化陽性率在健康對照組-結(jié)直腸瘤組-結(jié)直腸癌組中呈逐漸升高，提示p73基因與結(jié)直腸的發(fā)生、發(fā)展可能存在一定的相關(guān)性，將p73基因作為一個(gè)靶點(diǎn)進(jìn)行干預(yù)，或許可以成為CRC早期基因治療的一個(gè)理想方法，或?yàn)榻Y(jié)直腸癌的術(shù)后監(jiān)測提供有效的腫瘤標(biāo)志物。但目前研究所見，大規(guī)模無癥狀人群或輕微癥狀人群CRC篩查或早期診斷中，即使是已列入指南的血漿SEPT9基因甲基化檢測，其陽性率及敏感度仍偏低[20]?？紤]到相同分子標(biāo)志的甲基化情況在不同研究和不同人群之間也有一定的差異等因素[21-22]，進(jìn)一步明確血漿p73基因甲基化檢測在CRC診斷中的價(jià)值，有待進(jìn)行大樣本、多中心的前瞻性對照研究。

參考文獻(xiàn)

[1] Chen W，Zheng R，Baade P D，et al.Cancer statistics in China 2015[J].CA Cancer J Clin，2016，66（2）：115-132.

[2]陳辰，房靜遠(yuǎn).飲食因素影響結(jié)直腸癌發(fā)生的研究進(jìn)展[J].中華醫(yī)學(xué)雜志，2014，94（26）：2069-2072.

[3] Vugt J L V，Reidinger K W，Derikx J P，et al.Improving the outcomes in oncological surgery[J].World J Gastroenterol，2014，20（35）：12 445-12 457.

[4]史文靜，葉麗珍，周龍書.E-cad基因啟動子甲基化在子宮內(nèi)膜異位癥中的異常表達(dá)[J].中國醫(yī)學(xué)創(chuàng)新，2016，13（28）：11-14.

[5]張永旺，武振華，馮少勇，等.GSTP1和RASSF1A在前列腺癌組織中的甲基化檢測及其表達(dá)研究[J].中國醫(yī)學(xué)創(chuàng)新，2014，11（13）：13-16.

[6]鄧菲丹，羅建業(yè).結(jié)腸癌組織IL-10和IFN-γ mRNA的表達(dá)及其臨床意義[J].中國醫(yī)學(xué)創(chuàng)新，2015，12（14）：60-63.

[7]張宇晴，徐優(yōu)慧，黎文婷，等.胃泌素及其受體拮抗劑作用下胃癌細(xì)胞DNMT-1與MMP-2＼E-Cadherin甲基化相關(guān)性研究[J].中國醫(yī)學(xué)創(chuàng)新，2013，10（36）：1-4.

[8]朱劍峰，李志輝，朱紅靜，等.CEA、CA199、CA724、CA242、CA125、CA50對消化道腫瘤的診斷價(jià)值[J].實(shí)用癌癥雜志，2014，29（5）：501-502.

[9]徐元兵，林源.癌胚抗原的測定在結(jié)直腸癌及其轉(zhuǎn)移診療中的進(jìn)展[J].中國癌癥防治雜志，2013，5（1）：73-75.

[10]蘇錫康，崔金環(huán)，區(qū)文華.CEA、CA199和CA242聯(lián)合檢測在消化道腫瘤篩查中的意義[J].重慶醫(yī)學(xué)，2013，42（30）：3683-3685.

[11]孫靜，勝照杰.消化道腫瘤患者血清CA199和CEA水平測定[J].腫瘤基礎(chǔ)與臨床，2014，27（4）：335-336.

[12] Saito M，Nishikawa J，Okada T，et al.Role of DNA methykation in the development of Epstein-Barr virus-associated gastriccarcinpma[J].J Med Virol，2013，85（1）：121-127.

[13] Tuve S，Wagner S N，Sehittek B，et al.Alterations of Delta-TA-p73 splice transcripts during melanoma development and progression[J].Int J Cancer，2004，108（1）：162-166.endprint

[14] Xue M，Lai S C，Xu Z P，et al.Noninvasive DNA methylation biomarkers in colorectal cancer：A systermatic review[J].J Dig Dis，2015，16（12）：699-712.

[15] Zhou Z，Zhang H，Lai J，et al.Relatlonships between P14ARF Gene Methylatlon and ClinicoPathological Features of Colorectal Cancer：A Meta-Analys[J].PLoS One，2016，11（3）：e0 152 050.

[16] Kokki I，Papana A，Campbell H，et al.Estimating the incidenceof colorectal cancer in South East Asia[J].Croat Med J，2013，54（6）：532-540.

[17] Jin P，Kang X.Performance of a second-generation methylated SEPT9 test in detecting colorectal neoplasm[J].J Gastroenterol Hepatol，2015，30（5）：830-833.

[18]涂小煌，黃少雄，李文生.胱硫醚-β-合酶基因啟動子區(qū)CpG島甲基化水平與結(jié)直腸癌患者臨床病理特征的關(guān)系[J].中華腫瘤雜志，2013，35（5）：351-353.

[19]王秀江，盧潤章，張肖潔，等.多基因甲基化檢測對結(jié)直腸癌早期診斷的意義[J].胃腸病學(xué)和肝病學(xué)雜志，2013，22（12）：1228-1230.

[20] Church T R，Wandell M，Lofton-Day C，et al.Prospective evaluation of methylated SEPT9 in plasma for detection of asymptomatic colorectal cancer[J].Gut，2014，63（2）：317-325.

[21] Shah R，Jones E，Vidart V，et al.Biomarkers for early detection of colorectal cancer and polyps：systematic review[J].Cancer Epidemiol Biomarkers Prev，2014，23（9）：1712-1728.

[22] Deng G，Kakar S，Okudiara K，et al.Unique methylation pattern of oncostatin receptor gene in cancers of colorectum and other digestive organs[J].Clin Cancer Res，2009，15（5）：1519-1526.

（收稿日期：2017-07-17） （本文編輯：張爽）endprint