南極適冷菌Psychrobacter sp.G假定蛋白基因PSYCG_10180對(duì)溫度和鹽度脅迫的應(yīng)答特征分析

張 良,李 陽(yáng),張 政,林學(xué)政*

(1.國(guó)家海洋局第一海洋研究所,山東青島266061;2.國(guó)家海洋局海洋生物活性物質(zhì)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,山東青島266061)

南極適冷菌Psychrobacter sp.G假定蛋白基因PSYCG_10180對(duì)溫度和鹽度脅迫的應(yīng)答特征分析

張 良1,2,李 陽(yáng)1,2,張 政1,2,林學(xué)政1,2*

(1.國(guó)家海洋局第一海洋研究所,山東青島266061;2.國(guó)家海洋局海洋生物活性物質(zhì)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,山東青島266061)

根據(jù)南極適冷菌Psychrobacter sp.G的基因組完成圖,對(duì)其假定蛋白基因PSYCG_10180全長(zhǎng)進(jìn)行了基因克隆、序列分析與異源表達(dá),并利用qRT-PCR和western blotting技術(shù)對(duì)其在不同溫度/鹽度脅迫條件下的表達(dá)特征進(jìn)行了研究。序列分析表明,與蛋白PSYCG_10180相似性較高的均為假定蛋白;相似性最高的已知功能蛋白為藍(lán)光傳感蛋白(WP_010201745.1),二者的相似性?xún)H有37%。在m RNA水平上,基因PSYCG_10180的表達(dá)被低溫(0℃)顯著誘導(dǎo),在2,12 h均被不同鹽度顯著抑制;在溫度/鹽度協(xié)同脅迫下,2 h內(nèi)低溫均能誘導(dǎo)其表達(dá),而高溫低鹽(30℃,15)則抑制其表達(dá)。在蛋白水平上,不同溫度脅迫下,蛋白PSYCG_10180的表達(dá)量在2 h變化不大,12 h時(shí)均被誘導(dǎo);在不同鹽度脅迫下,該蛋白的表達(dá)在12 h均被誘導(dǎo);在溫/鹽協(xié)同脅迫下,除在2 h被高溫低鹽(30℃,15)誘導(dǎo)外,其余條件下該蛋白的表達(dá)均被抑制。比較分析表明,在m RNA水平上,基因PSYCG_10180的表達(dá)更容易受溫度的影響;在蛋白水平上,鹽度對(duì)該基因表達(dá)的影響則要大于溫度;在溫鹽協(xié)同脅迫時(shí),鹽度起主導(dǎo)作用。凍融試驗(yàn)表明,表達(dá)該假定蛋白可顯著提高重組菌株的凍融存活率。本研究表明,假定蛋白基因PSYCG_10180可能在菌株P(guān)sychrobacter sp.G的低溫等環(huán)境適應(yīng)性中起著重要作用。

Psychrobacter;PSYCG_10180;脅迫表達(dá);qRT-PCR;western blotting

假定蛋白通常是指那些未知結(jié)構(gòu)和功能的蛋白質(zhì)[1]。任何測(cè)序的基因組中至少包含25%的假定蛋白,即使像簡(jiǎn)單的模式生物如大腸桿菌、枯草芽孢桿菌和釀酒酵母也不例外[2]。假定蛋白可能在微生物細(xì)胞生理中起著重要作用,假定蛋白基因及其ORFs的預(yù)測(cè)有助于蛋白質(zhì)組學(xué)及表達(dá)分析的研究[3]。隨著測(cè)序技術(shù)的快速發(fā)展,越來(lái)越多的基因組序列可以在GenBank等數(shù)據(jù)庫(kù)中找到,尤其是全基因組序列的測(cè)通對(duì)生命科學(xué)有著根本意義上的改變[2]。到目前為止,GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)已有超過(guò)10 000株細(xì)菌的基因組序列;然而,這些基因組中有高達(dá)50%的基因被標(biāo)記為“未知”,“未表征”或“假定”,這極大地限制了我們對(duì)其功能的理解[4-5],也限制了對(duì)這些數(shù)據(jù)的利用,使得數(shù)據(jù)豐富而信息量差。因此,后基因組時(shí)代的主要任務(wù)是對(duì)基因組的注釋,通過(guò)氨基酸序列的分析和實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證其基因產(chǎn)物的功能,然而對(duì)假定蛋白的生物學(xué)功能注釋仍然是一個(gè)巨大的挑戰(zhàn),這是因?yàn)槠渑c已知功能蛋白的氨基酸序列只有較低的相似性[6]。

南極適冷菌Psychrobacter sp.G的全基因組為3.11 M,G+C含量為42.44%,由1條環(huán)形染色體(CP006265)和3個(gè)質(zhì)粒(CP006266,CP006267,CP006268)組成,假定蛋白分別占染色體和質(zhì)粒開(kāi)放閱讀框(Open Reading Frame,ORF)的26.3%和72.2%[7],可能在菌株的環(huán)境適應(yīng)性中發(fā)揮著重要作用[8-9],需要利用多種手段對(duì)其功能進(jìn)行預(yù)測(cè)及驗(yàn)證[10]。

對(duì)假定蛋白的功能預(yù)測(cè)可以結(jié)合多種方法。Retief[11]和Hall[12]發(fā)現(xiàn),可以通過(guò)構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)的方法來(lái)預(yù)測(cè)假定蛋白的可能功能,同時(shí)可以用Tree View和PhyloDraw兩種軟件對(duì)系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)進(jìn)行直觀化視圖,以期更好地預(yù)測(cè)假定蛋白的功能[13-14]。Oany等[10]對(duì)菌株Alteromonas macleodii AltDE1的假定蛋白amad1_06475的氨基酸序列分析表明,該蛋白與冷激蛋白和RNA分子伴侶有很高的同源性,并通過(guò)多序列比對(duì)分析確定了該假定蛋白中冷激蛋白保守區(qū)域的存在;同時(shí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)也表明該假定蛋白具有冷激蛋白和RNA伴侶的蛋白結(jié)構(gòu)特征。Kanayama等[15]對(duì)從桃樹(shù)中克隆的基因Pp AKR1進(jìn)行了氨基酸序列分析,并通過(guò)構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(shù),發(fā)現(xiàn)該基因?qū)儆谌┩€原酶家族,進(jìn)一步通過(guò)實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證發(fā)現(xiàn)其可參與非生物脅迫耐受性過(guò)程。Rajnish等[16]通過(guò)同源性比對(duì)發(fā)現(xiàn)Zymomonas mobilis中的一種假定內(nèi)切葡聚糖酶(ZMO1086)與已知的內(nèi)切葡聚糖酶的相似度雖僅為40%,但通過(guò)異源表達(dá)證實(shí)了其具有內(nèi)切葡聚糖酶的活性。

已有的轉(zhuǎn)錄組比較分析表明,南極適冷菌Psychrobacter sp.G經(jīng)冷激(0℃,2 h)后,假定蛋白基因PSYCG_10180的表達(dá)量顯著上升,其表達(dá)量的log2FC(L/C)值為對(duì)照的4.1倍[17]。本文對(duì)其進(jìn)行了基因克隆和蛋白結(jié)構(gòu)分析,并利用q RT-PCR和Western blotting技術(shù)分別從mRNA水平和蛋白水平研究了其在不同溫度、鹽度以及溫鹽協(xié)同脅迫下的表達(dá)情況,以期探討該基因在菌株G環(huán)境適應(yīng)性中的作用。

1 材料和方法

1.1 菌株、培養(yǎng)基及生長(zhǎng)條件

南極適冷菌Psychrobacter sp.G分離自南極喬治王島西南部的海水并保存于本實(shí)驗(yàn)室。感受態(tài)細(xì)胞Escherichia coli DH5α(D9057),克隆載體p MD18-T(D101A)均購(gòu)買(mǎi)于TaKaRa(大連)。其最適生長(zhǎng)溫度是20℃,最適生長(zhǎng)NaCl濃度是45‰(w/v);最適鹽度培養(yǎng)基:胰蛋白胨5 g,酵母粉1 g,NaCl 14 g,溶解于1 L過(guò)濾后的青島近海海水(鹽度約為31)中,并于1×105Pa下濕熱滅菌20 min,所使用不同鹽度培養(yǎng)基的成分參照文獻(xiàn)[17]。

1.2 假定蛋白基因PSYCG_10180原核表達(dá)體系的構(gòu)建

1.2.1 基因PSYCG_10180的克隆及生物信息學(xué)分析

根據(jù)菌株G的基因組完成圖,選取目的基因的ORF序列,利用Primer 5.0軟件設(shè)計(jì)特異性引物,在引物5'端分別引入相應(yīng)的限制性?xún)?nèi)切酶Nde I和Xho I的酶切位點(diǎn)(表1)。

表1 擴(kuò)增假定蛋白基因PSYCG_10180全長(zhǎng)的特異性引物Table 1 Specific primers used to amplify the full length of the hypothetical protein gene PSYCG_10180

特異性引物由博尚生物技術(shù)有限公司合成。以菌株G的基因組為模板,進(jìn)行PCR擴(kuò)增。PCR條件如下:95℃5 min;95℃45 s,52℃30 s,72℃20 s,35個(gè)循環(huán);72℃延伸10 min。PCR產(chǎn)物經(jīng)純化后連接到p MD18-T載體上,轉(zhuǎn)入大腸桿菌DH5α感受態(tài)細(xì)胞,挑取單克隆經(jīng)PCR初步驗(yàn)證后送交南京金斯瑞有限公司測(cè)序。

測(cè)序結(jié)果通過(guò)EditSeq軟件查找該序列的開(kāi)放閱讀框,通過(guò)Basic Local Alignment Search Tool(BLAST)(http:∥www.ncbi.nlm.nih.gov)與GenBank中已有的序列進(jìn)行比對(duì)分析。啟動(dòng)子序列(-35區(qū)、-10區(qū))、核糖體結(jié)合位點(diǎn)(ribosome binding sequence,RBS)由Softberry網(wǎng)站(http:∥linux1.softberry.com/berry.phtml)分析獲得[18]。氨基酸多序列比對(duì)采用DNAMAN軟件;蛋白等電點(diǎn)(pI)、分子量(MW)由Lasergene-EditSeq(v.1.02;DNASTAR Inc.)計(jì)算得出;系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)通過(guò)軟件Mega 5.1中的鄰接法(Neighbor-Joining Method,NJ)構(gòu)建。

1.2.2 表達(dá)載體的構(gòu)建

將重組質(zhì)粒p MD18-T-PSYCG_10180與表達(dá)質(zhì)粒p ET22b同時(shí)用NdeI和XhoI進(jìn)行雙酶切并純化目的片段,并使用T4 DNA連接酶于16℃連接過(guò)夜,隨后轉(zhuǎn)化感受態(tài)細(xì)胞E.coli BL21(DE3),用終濃度為100μg/m L Amp的LB培養(yǎng)基篩選陽(yáng)性克隆并經(jīng)PCR初步驗(yàn)證后送交南京金斯瑞有限公司測(cè)序。

1.2.3 假定蛋白的表達(dá)與多克隆抗體的制備

將經(jīng)測(cè)序驗(yàn)證正確的表達(dá)菌E.coli BL21(DE3)-p ET22b+PSYCG_10180進(jìn)行培養(yǎng),并用終濃度為1 mmol/L的異丙基-β-D-硫代吡喃半乳糖苷(Isopropylβ-D-Thiogalactoside,IPTG)對(duì)重組菌進(jìn)行了誘導(dǎo)表達(dá)。重組后的表達(dá)型載體p ET22b+PSYCG_10180表達(dá)出的目的蛋白主要在包涵體中,由于該蛋白C端帶有較強(qiáng)的疏水區(qū)域并且有明顯的跨膜區(qū)域,因此其并不適合使用Ni+親和層析的方法純化。我們將表達(dá)出的包涵體直接送至南京鐘鼎生物公司進(jìn)行切膠純化獲得目的蛋白,利用此目的蛋白制備多克隆抗體。

1.3 脅迫處理

參照文獻(xiàn)[19],對(duì)菌株G進(jìn)行培養(yǎng)和脅迫處理,以進(jìn)行m RNA水平和蛋白水平上的差異表達(dá)分析。

1.4 qRT-PCR分析

利用RNA提取試劑盒(DP430,天根,北京)提取經(jīng)不同脅迫處理與不同脅迫時(shí)間的菌株G的總RNA,其質(zhì)量通過(guò)測(cè)定其A260/A280值確定。利用反轉(zhuǎn)錄試劑盒PrimeScript RT Reagent Kit(RR047A,Takara,大連)將得到的1 000 ng RNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA,使用SYBR Premix Ex Taq TM II試劑盒(RR820A,Takara,大連)進(jìn)行q RT-PCR分析。

利用軟件Primer 5.0設(shè)計(jì)獲得假定蛋白基因PSYCG_10180進(jìn)行qRT-PCR的引物(F:5'-CCAGTAATGCCAGATCTATG-3';R:5'-TTCTGCGATATCATTAAGAGCG-3'),內(nèi)參基因?yàn)镚APDH(F:5'-AGTCAGGCACATTTAGCG-3';R:5'-GGCATAGCCCCATTCATT-3')[20-21]。qRT-PCR條件:95℃3 min;95℃30 s,退火溫度(PSYCG_10180:55℃,GAPDH:52℃)20 s,72℃20 s,40個(gè)循環(huán)。所有實(shí)驗(yàn)均重復(fù)3次?；谂R界循環(huán)值(C t)對(duì)基因PSYCG_10180的mRNA進(jìn)行定量,采用相對(duì)C t值法(2-ΔΔCt)處理所得數(shù)據(jù),對(duì)照組基因表達(dá)量標(biāo)準(zhǔn)化為1,并對(duì)樣本的重復(fù)性以及樣本間的差異進(jìn)行方差分析、顯著性差異分析[22]。

1.5 Western blotting檢測(cè)

根據(jù)李陽(yáng)等[19]利用利用western blotting技術(shù)對(duì)假定蛋白基因PSYCG_10180不同脅迫條件下在翻譯水平上的表達(dá)情況進(jìn)行了檢測(cè)與分析。

1.6 重組菌株p ET22b+PSYCG_10180的抗凍融活性測(cè)定

將經(jīng)IPTG(終濃度為1 mmol/L)誘導(dǎo)的含p ET22b+PSYCG_10180的E.coli BL21菌液取1 m L裝于1.5 m L EP管中,于-20℃冷凍,2 h后取出放于冰上1 h使其融化,融化后再將其放于-20℃冷凍2 h,之后再取出放于冰上1 h使其溶化,之后按之前方法再重復(fù)凍融1次。分別將反復(fù)凍融0,1,2和3次的菌液以1%的接種量接種于5 m L含Amp的LB液體培養(yǎng)基中,37℃,150 r/min培養(yǎng)4 h后測(cè)OD600,重復(fù)3次。以?xún)H含質(zhì)粒p ET22b的E.coli BL21的存活率作為對(duì)照組(反復(fù)凍融處理同上)[23]。

2 結(jié)果與分析

2.1 假定蛋白基因PSYCG_10180的克隆及序列分析

根據(jù)菌株G基因組完成圖[7]和基因克隆測(cè)序結(jié)果分析表明,假定蛋白基因PSYCG_10180的ORF長(zhǎng)624 bp,編碼207個(gè)氨基酸,理論蛋白分子量為23.12 k Da,等電點(diǎn)(p I)值為4.80。啟動(dòng)子序列-35區(qū)(5'-TTTAAT-3')和-10區(qū)(5'-TTTTATTCT-3')分別位于起始密碼子ATG上游436 bp和415 bp處,轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)(transcription start site,TSS)位于-10區(qū)下游6 bp處;起始密碼子上游7 bp處有一個(gè)典型的核糖體結(jié)合位點(diǎn)(ribosome binding site(RBS),5'-GGAG-3'),長(zhǎng)14 bp的下游框(downstream box(DB),5'-ATTGATTCTACAAA-3')位于起始密碼子ATG下游10 bp處。

圖1 假定蛋白基因PSYCG_10180及調(diào)控序列分析Fig.1 Analysis of hypothetical protein gene PSYCG_10180 and its regulatory sequences

利用BLASTP對(duì)假定蛋白PSYCG_10180進(jìn)行了比對(duì)分析并構(gòu)建了系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)(圖2)。可以看出,檢索到了兩類(lèi)與假定蛋白PSYCG_10180相關(guān)的蛋白,一類(lèi)為假定蛋白,二者的相似性較高,與假定蛋白(WP_041753194.1,Psychrobacter cryohalolentis)的相似性可達(dá)97%;另一類(lèi)為藍(lán)光傳感蛋白,但二者的相似性均很低,如該假定蛋白與其中相似性最高的Psychrobacter sp.PRwf-1的藍(lán)光傳感蛋白(WP_010201745.1)的相似度也僅有37%。

圖2 假定蛋白PSYCG_10180的系統(tǒng)發(fā)育分析Fig 2 Phylogenetic analysis of hypothetical protein PSYCG_10180

2.2 對(duì)溫度脅迫的應(yīng)答

由圖3可見(jiàn),在m RNA水平上,假定蛋白基因PSYCG_10180的表達(dá)顯著被低溫(0℃)誘導(dǎo),該溫度下基因的表達(dá)于2 h表達(dá)量達(dá)到最大,約為對(duì)照組的12倍。高溫(30℃)條件下,其先被抑制,隨后(6 h)升高,之后表達(dá)量又顯著下降,于12 h時(shí)受到顯著的抑制,表達(dá)量?jī)H約為對(duì)照組的0.2倍。

圖3 假定蛋白基因PSYCG_10180對(duì)溫度脅迫的應(yīng)答特征Fig.3 Expression patterns of hypothetical protein gene PSYCG_10180 in response to temperature stress

Western blotting結(jié)果經(jīng)灰度掃描后分析表明(圖4),在蛋白水平上,假定蛋白PSYCG_10180的表達(dá)量在較短時(shí)間(2 h)內(nèi)變化不大,于6 h時(shí)均被抑制,較長(zhǎng)時(shí)間(12 h)內(nèi)均被誘導(dǎo),并于10℃時(shí)其表達(dá)量最大,約為對(duì)照組的4.6倍。

圖4 溫度脅迫下假定蛋白PSYCG_10180的表達(dá)分析Fig.4 Expression analysis of hypothetical protein PSYCG_10180 in response to temperature stress

2.3 對(duì)鹽度脅迫的應(yīng)答

由圖5可見(jiàn),在m RNA水平上,基因PSYCG_10180的表達(dá)在較短時(shí)間(2 h)內(nèi)被抑制,6 h被誘導(dǎo),12 h被顯著抑制狀態(tài)。在低鹽(0,15)條件下,基因PSYCG_10180的表達(dá)量于12 h時(shí)均為對(duì)照組的0.3倍;在高鹽(90,120)條件下,基因PSYCG_10180的表達(dá)量分別為對(duì)照組的0.8倍和0.3倍。

Western blotting結(jié)果經(jīng)灰度掃描后分析表明(圖6),在蛋白水平上,假定蛋白PSYCG_10180的表達(dá)在較短時(shí)間(2 h)內(nèi)除被高鹽(90)抑制外,可被其他鹽度誘導(dǎo),并于高鹽(120)時(shí)蛋白表達(dá)量達(dá)到最大,約為對(duì)照組的2.5倍;6 h無(wú)論鹽度高低,該蛋白的表達(dá)均被抑制,并在高鹽(90)時(shí)表達(dá)量最低,在2和6 h時(shí)蛋白的表達(dá)均可被高鹽(90)抑制;12 h時(shí)假定蛋白的表達(dá)均可被誘導(dǎo)。

圖5 假定蛋白基因PSYCG_10180對(duì)鹽度脅迫的應(yīng)答特征Fig.5 Expression patterns of hypothetical protein gene PSYCG_10180 in response to salinity stress

圖6 鹽度脅迫下假定蛋白PSYCG_10180的表達(dá)分析Fig.6 Expression analysis of hypothetical protein PSYCG_10180 in response to salinity stress

2.4 對(duì)溫度/鹽度協(xié)同脅迫的應(yīng)答

由圖7可見(jiàn),在溫度/鹽度協(xié)同脅迫條件下,在2 h假定蛋白基因PSYCG_10180的表達(dá)都可被低溫誘導(dǎo),尤其是被低溫低鹽(0℃,15)顯著誘導(dǎo),其表達(dá)量約為對(duì)照組的8.2倍。在3個(gè)試驗(yàn)時(shí)間點(diǎn)均可被高溫低鹽(30℃,15)抑制,表達(dá)量分別為對(duì)照組的0.4,0.3和0.3倍。

Western blotting結(jié)果經(jīng)灰度掃描后分析表明(圖8),在溫度/鹽度協(xié)同脅迫條件下,在蛋白水平上,假定蛋白PSYCG_10180的表達(dá)只有在2 h被高溫低鹽(30℃,15)誘導(dǎo)(表達(dá)量約為對(duì)照組的1.3倍),其余條件下均被抑制。

圖7 假定蛋白基因PSYCG_10180對(duì)溫/鹽協(xié)同脅迫的應(yīng)答特征Fig.7 Expression patterns of hypothetical protein gene PSYCG_10180 in response to combined stresses of temperature and salinity

圖8 溫鹽脅迫下假定蛋白PSYCG_10180的表達(dá)分析Fig.8 Expression analysis of hypothetical protein PSYCG_10180 in response to combined stresses of temperature and salinity

2.5 重組菌株的抗凍融活性

重組菌株經(jīng)反復(fù)抗凍融后,其存活率結(jié)果見(jiàn)圖9?？梢钥闯?對(duì)表達(dá)假定蛋白PSYCG_10180的重組菌與僅含p ET22b的重組菌進(jìn)行反復(fù)凍融后,其存活率均不斷下降,但前者的存活率始終高于后者。在凍融3次以后表達(dá)假定蛋白PSYCG_10180的重組菌的存活率約為對(duì)照組的15倍。此結(jié)果可初步說(shuō)明,假定蛋白PSYCG_10180的異源表達(dá)可提高宿主菌E.coli BL21的抗凍融能力。

圖9 PSYCG_10180重組菌株的抗凍融實(shí)驗(yàn)Fig.9 Freezing and thawing resistance of PSYCG_10180-overexpressing strain

3 討 論

本文根據(jù)已有的對(duì)南極適冷菌Psychrobacter sp.G溫度脅迫轉(zhuǎn)錄組的比較分析,對(duì)其中一個(gè)低溫脅迫后表達(dá)顯著升高的假定蛋白基因PSYCG_10180進(jìn)行了基因克隆與序列分析,并利用q RT-PCR和western blotting技術(shù)分別從m RNA水平和蛋白水平研究了其在不同溫度/鹽度脅迫條件下的表達(dá)情況,以期揭示菌株G對(duì)南極極端環(huán)境的分子適應(yīng)機(jī)制。

序列分析表明,在假定蛋白基因PSYCG_10180的起始密碼子ATG下游10 bp處發(fā)現(xiàn)長(zhǎng)14 bp的下游框的存在。有研究表明,下游框?qū)浼ず筇幱谏L(zhǎng)停滯期細(xì)胞的翻譯過(guò)程是必需的[24],這初步說(shuō)明,該假定蛋白可能在菌株G的低溫適應(yīng)性中起著重要作用。BLASTP檢索到了兩類(lèi)與該假定蛋白相近的蛋白,相似性最高的是假定蛋白,相似度可達(dá)97%;與已知功能的Psychrobacter sp.PRwf-1的藍(lán)光傳感蛋白(WP_010201745.1)的相似度僅為37%。這說(shuō)明,有必要通過(guò)試驗(yàn)進(jìn)一步驗(yàn)證該基因的功能。

溫度脅迫對(duì)基因PSYCG_10180在m RNA和蛋白水平表達(dá)的影響存在著明顯差異。在mRNA水平上,在0℃時(shí)基因PSYCG_10180的表達(dá)先被誘導(dǎo)然后被抑制,在10和30℃該基因的表達(dá)僅在6 h受到誘導(dǎo),這表明該基因具有冷激蛋白基因?qū)囟让{迫應(yīng)答的典型特征;而在蛋白水平上,假定蛋白PSYCG_10180無(wú)論溫度高低,其表達(dá)均先被抑制后誘導(dǎo)。Etchegaray等[25]研究發(fā)現(xiàn),當(dāng)大腸桿菌的培養(yǎng)溫度低于其最適溫度時(shí),冷激蛋白Csp A的表達(dá)量會(huì)在短時(shí)間內(nèi)迅速升高。Song等[20]研究表明,冷激蛋白基因Csp 2039在m RNA水平上的表達(dá)可顯著被低溫誘導(dǎo);在蛋白水平上,冷激蛋白Csp2039的表達(dá)亦可被低溫誘導(dǎo),這與本文研究結(jié)果基本一致。當(dāng)大腸桿菌從其最適生長(zhǎng)溫度37℃下降到10℃時(shí),其Csp A蛋白家族的表達(dá)量為總蛋白的13%[26],這與本文假定蛋白PSYCG_10180在低溫(10℃)條件下其蛋白表達(dá)量最大的趨勢(shì)相一致。

鹽度脅迫對(duì)基因PSYCG_10180在m RNA和蛋白水平的表達(dá)的影響也存在著明顯差異。在m RNA水平上,該基因在6 h被誘導(dǎo),其余時(shí)間(2,12 h)被抑制,尤其在12 h時(shí)所有鹽度均會(huì)顯著抑制其表達(dá),但總體來(lái)看該基因?qū)}度的應(yīng)答特征并不明顯;在蛋白水平上,該假定蛋白的表達(dá)無(wú)論鹽度高低在6 h均受到抑制,而在其余時(shí)間內(nèi)(2,12 h)除在2 h的高鹽度(90)外,該假定蛋白的表達(dá)均受到誘導(dǎo)。研究表明,當(dāng)向單增李斯特菌(Listeria monocytogenes)的培養(yǎng)基中加入3%的NaCl后,冷激蛋白Csp A的表達(dá)量會(huì)顯著升高,相對(duì)表達(dá)量達(dá)到對(duì)照組的2.8倍[27]。然而,車(chē)帥等[17]對(duì)冷激蛋白Csp2039在m RNA水平在鹽度脅迫下的研究中發(fā)現(xiàn),高鹽(90,120)顯著抑制冷激蛋白基因Csp 2039的表達(dá),這可能與Csp 2039基因的5'-UTR中不存在AT-rich UP element有關(guān)[20]。

在自然條件下,Psychrobacter sp.G通常需要同時(shí)面對(duì)多種環(huán)境壓力,如溫度變化通常伴隨著鹽度變化[28],因此本文對(duì)溫/鹽協(xié)同脅迫下假定蛋白基因PSYCG_10180的表達(dá)情況也進(jìn)行了分析。結(jié)果表明,溫/鹽協(xié)同脅迫對(duì)該假定基因在m RNA水平和翻譯水平的表達(dá)的影響也并不完全一致。在m RNA水平上,該基因的表達(dá)在2 h除被(30℃,15)抑制外,可被其他條件所誘導(dǎo),尤其是在低溫低鹽(0℃,15)條件下。在蛋白水平上,該假定蛋白的表達(dá)除被在2 h時(shí)被高溫低鹽(30℃,15)誘導(dǎo)以外,其余條件下均被抑制。

通過(guò)對(duì)基因PSYCG_10180在不同溫度、鹽度以及溫度/鹽度脅迫條件下的表達(dá)特征研究表明,在m RNA水平上,溫度和鹽度分別脅迫時(shí),溫度對(duì)PSYCG_10180基因的誘導(dǎo)表達(dá)明顯高于鹽度對(duì)基因的誘導(dǎo)增加倍數(shù),在溫度/鹽度協(xié)同脅迫時(shí),低溫占據(jù)了主導(dǎo)作用;而在蛋白水平上,溫度和鹽度分別脅迫時(shí),溫度對(duì)PSYCG_10180蛋白表達(dá)的影響作用稍高于鹽度,在溫度/鹽度協(xié)同脅迫時(shí),鹽度占據(jù)了主導(dǎo)作用,溫度對(duì)其影響較小。

對(duì)表達(dá)假定蛋白PSYCG_10180的宿主菌E.coli BL21進(jìn)行的反復(fù)凍融實(shí)驗(yàn)表明,表達(dá)假定蛋白PSYCG_10180的重組菌的存活率遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于僅含p ET22b的重組菌;在反復(fù)凍融3次以后,其存活率約為對(duì)照組p ET22b重組菌的15倍。此結(jié)果說(shuō)明,假定蛋白PSYCG_10180的異源表達(dá)提高了宿主菌E.coli BL21的抗凍融能力。Jung等[21]對(duì)含有冷激蛋白Csp Apa的宿主大腸桿菌進(jìn)行的反復(fù)凍融實(shí)驗(yàn)也表明,過(guò)量表達(dá)冷激蛋白Csp Apa使宿主大腸桿菌的耐寒能力增強(qiáng)了10倍以上。此結(jié)果表明假定蛋白PSYCG_10180具有冷激蛋白可提高宿主菌細(xì)胞抗凍融活性的類(lèi)似特性。

4 結(jié) 論

根據(jù)南極適冷菌Psychrobacter sp.G的基因組完成圖,通過(guò)設(shè)計(jì)特異性引物對(duì)假定蛋白基因PSYCG_10180進(jìn)行了克隆,對(duì)其進(jìn)行序列分析,研究了該基因在m RNA水平和蛋白水平上對(duì)溫度/鹽度脅迫的響應(yīng),并對(duì)假定蛋白PSYCG_10180的宿主大腸桿菌進(jìn)行了凍融試驗(yàn),得出以下結(jié)論:

1)通過(guò)克隆得到假定蛋白基因PSYCG_10180的全長(zhǎng)基因進(jìn)行序列分析得到-10、-35、TSS、RBS等調(diào)控區(qū)域以及起始密碼子ATG下游10 bp處長(zhǎng)14 bp的下游框。系統(tǒng)發(fā)育分析表明,與假定蛋白PSYCG_10180相似性最高的為Psychrobacter cryohalolentis的假定蛋白(WP_041753194.1),相似性可達(dá)97%;與其相似性最高的已知功能的蛋白為Psychrobacter sp.PRwf-1的藍(lán)光傳感蛋白(WP_010201745.1),相似性?xún)H有37%。

2)溫度脅迫對(duì)基因PSYCG_10180在mRNA水平和蛋白水平表達(dá)的影響存在著明顯差異:在m RNA水平上,低溫(0℃)使基因PSYCG_10180的表達(dá)先被誘導(dǎo)然后被抑制,這表明該基因具有冷激蛋白基因?qū)囟让{迫應(yīng)答的典型特征;而在蛋白水平上,假定蛋白PSYCG_10180無(wú)論溫度高低,其表達(dá)均先被抑制后誘導(dǎo);鹽度脅迫對(duì)基因PSYCG_10180在m RNA水平和蛋白水平上表達(dá)的影響也存在著明顯差異:在m RNA水平上,該基因在6 h被誘導(dǎo),其余時(shí)間(2,12 h)被抑制;在蛋白水平上,該基因在6 h被抑制,其余時(shí)間內(nèi)(2,12 h)除在2 h的高鹽度(90)外,該假定蛋白的表達(dá)均受到誘導(dǎo)。溫度/鹽度協(xié)同脅迫下,在m RNA水平和蛋白水平上,該基因的表達(dá)同時(shí)受溫度和鹽度影響。

3)通過(guò)異源表達(dá)假定蛋白PSYCG_10180,其宿主大腸桿菌的抗凍融能力得到明顯提高。

[1] BORK P.Powers and pitfalls in sequence analysis:the 70%hurdle[J].Genome Research,2000,10(10):398-400.

[2] GALPERIN M Y,KOONIN E V.‘Conserved hypothetical’proteins:prioritization of targets for experimental study[J].Nucleic Acids Research,2004,32(18):5452-5463.

[3] RAJADURAI C P,SUBAZINI T K,KUMAR G R.An integrated re-annotation approach for functional predictions of hypothetical proteins in microbial genomes[J].Current Bioinformatics,2011,6(4):45-461.

[4] MAZANDU G K,MULDER N J.Scoring protein relationships in functional interaction networks predicted from sequence data[J].Plos One,2011,6(4):e18607.

[5] ENAULT F,SUHRE K,CLAVERIE J M.Phydbac“gene function predictor”:a gene annotation tool based on genomic context analysis[J].BMC Bioinformatics,2005,6(1):247.

[6] ROBERTS R J.Identifying protein function-a call for community action[J].PLoS Biology,2004,2(3):293-294.

[7] CHE S,SONG L,SONG W Z,et al.Complete genome sequence of Antarctic bacterium Psychrobacter sp.strain G[J].Genome Announcements.2013,1(5):e00725-13.

[8] WATKINS J.Predicting the function of a putative uncharacterized hypothetical protein from Leishmania major[J].Internet Journal of Genomics&Proteomics.2012,6(2):1-5.

[9] MAO S J,KLUGE K,SQUILLACE SJ,et al.Functional insight into putative conserved proteins of Rickettsia rickettsii and their vibrulence characterization[J].Current Proteomics,2015,132(2):289-292.

[10] OANY A R,AHMAD S A,KIBRIA K K,et al.A hypothetical protein of Alteromonas macleodii AltDE1(amad1_06475)predicted to be a cold-shock protein with RNA chaperone activity[J].Gene Regulation&Systems Biology,2013,8(8):141-147.

[11] RETIEF J D.Phylogenetic analysis using PHYLIP[J].Methods in Molecular Biology,2000,132(132):243-258.

[12] HALL B G.Comparison of the accuracies of several phylogenetic methods using protein and DNA sequences[J].Molecular Biology and Evolution,2005,22(3):792-802.

[13] PAGE R D.Tree View:an application to display phylogenetic trees on personal computers[J].Bioinformatics,1996,12(4):357-358.

[14] CHOI J H,JUNG H Y,KIM H S,et al.PhyloDraw:a phylogenetic tree drawing system[J].Bioinformatics,2000,16(11):1056-1058.

[15] KANAYAMA Y,MIZUTANI R,YAGUCHI S,et al.Characterization of an uncharacterized aldo-keto reductase gene from peach and its role in abiotic stress tolerance[J].Phytochemistry,2014,104(3):30-36.

[16] RAJNISH K N,KISHORE CHOUDHARY G M,GUNASEKARAN P.Functional chara cterization of a putative endoglucanase gene in the genome of Zymomonas mobilis[J].Biotechnology Letters,2008,30(8):1461-1467.

[17] CHE S.Trancriptomic analysis of the Antarctic psychrotrophic bacterium Psychrobacter sp.G and expression characteristics of heat shock protein gene(Hsp 845)/cold shock protein gene(Csp 2039)[D].Qingdao:The First Institute of Oceanography,2014.車(chē)帥.南極適冷菌Psychrobacter sp.G的轉(zhuǎn)錄組學(xué)研究與熱激蛋白基因Hsp 845/冷激蛋白基因的Csp 2039表達(dá)分析[D].青島:國(guó)家海洋局第一海洋研究所,2014.

[18] PANICKER G,MOJIB N,NAKATSUJI T,et al.Occurrence and distribution of cap B in Antarctic microorganisms and study of its structure and regulation in the Antarctic biodegradative Pseudomonas sp.30/3[J].Extremophiles,2010,14(2):171-183.

[19] LI Y,CHE S,WANG Z,et al.Expression characteristics of cold shock protein gene Csp 2039 of the Antarctic psychrotrophic bacterium Psychrobacter sp.G[J].Advances in Marine Science,2016,34(1):85-94.李陽(yáng),車(chē)帥,王楨,等.南極適冷菌Psychrobacter sp.G冷激蛋白基因Csp 2039的表達(dá)分析[J].海洋科學(xué)進(jìn)展,2016,34(1):85-94.

[20] SONG W Z,LIN X Z,HUANG X H.Characterization and expression analysis of three cold shock protein(CSP)genes under different stress conditions in the Antarctic bacterium Psychrobacter sp.G[J].Polar Biology,2012,35(10):1515-1524.

[21] CHE S,SONG W Z,LIN X Z.Response of heat-shock protein(HSP)genes to temperature and salinity stress in the Antarctic psychrotrophic bacterium Psychrobacter sp.G[J].Current Microbiology,2013,67(5):601-608.

[22] LIVAK K J,SCHMITTGEN T D.Analysis of relative gene expression data using real-time quantitative PCR and the 2–ΔΔCT method[J].Methods,2001,25(4):402-408.

[23] JUNG Y H,YI J Y,LEE Y K,et al.Overexpression of cold shock protein a of Psychromonas arctica KOPRI 22215 confers cold-resistance[J].The Protein Journal,2010,29(2):136-142.

[24] MITTA M,FANG L,INOUYE M.Deletion analysis of csp A of Escherichia coli:requirement of the AT-rich UP element for csp A transcription and the downstream box in the coding region for its cold shock induction[J].Molecular Microbiology,1997,26(2):321-335.

[25] ETCHEGARAY J P,JONES P G,INOUYE M.Differential thermoregulation of two highly homologous cold-shock genes,csp A and csp B,of Escherichia coli[J].Genes to Cells,1996,1(2):171-178.

[26] GOLDSTEIN J,POLLITT N S,INOUYE M.Major cold shock protein of Escherichia coli.[J].Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America,1990,87(1):283-287.

[27] SCHMID B,KLUMPP J,RAIMANN E,et al.Role of cold shock proteins in growth of Listeria monocytogenes under cold and osmotic stress conditions[J].Applied&Environmental Microbiology,2009,75(6):1621-1627.

[28] THOMAS D N,DIECKMANN G S.Antarctic Sea ice-a habitat for extremophiles[J].Science,2002,295(5555):641-644.

Analysis of the Response of Hypothetical Protein Gene PSYCG_10180 to Temperature and Salinity Stress in the Antarctic Psychrotrophic Bacterium Psychrobacter sp.G

ZHANG Liang1,2,LI Yang1,2,ZHANG Zheng1,2,LIN Xue-zheng1,2
(1.The First Institute of Oceanography,SOA,Qingdao 266061,China;2.Key Lab of Marine Bioactive Substances,SOA,Qingdao 266061,China)

According to the complete genome sequence,a hypothetical protein gene PSYCG_10180 was cloned from the Antarctic psychrotrophic bacterium Psychrobacter sp.G and it sequences was analyzed.The expression characteristics of gene PSYCG_10180 under different temperature and salinity stresses were investigated by quantitative real-time PCR(qRT-PCR)and western blotting.Sequence analysis showed that the proteins with relatively high similarity to PSYCG_10180 were unknown proteins,and the highest similarity of the known functional proteins(blue light sensor protein,WP_010201745.1)was only 37%.At the mRNA level,the expression of hypothetical gene PSYCG_10180 was induced by low temperature(0℃);under different salinity stresses,the expression was inhibited at 2 h and 12 h;in the combined stress treatment,the expression was induced by low temperature at 2 h,and it was inhibited by high temperature,low salinity(30℃,15).At the protein level,the expression level had little changes at 2 h,and it was induced at 12 h upon temperature stress investigated;in the combined stress treatment,the expression was inhibited except induced at 2 h by high temperature and low salinity(30℃,15).Comparative analysis showed that,at the m RNA level,the expression of gene PSYCG_10180 was more sensitive to high temperature;at the protein level,the expression of hypothetical protein PSYCG_10180 was more sensitive to high salinity;in the combined stress treatment,the effect of salinity was dominative.Freezing and thawing test showed that the survival rate of the recombinant strain expressing the hypothetical protein was significantly enhanced compared with the control group.The study indicates that hypothetical protein PSYCG_10180 may play an important role in environmental adaptability of Psychrobacter sp.G.

Psychrobacter;PSYCG_10180;Stress expression;q RT-PCR;western blotting

February 21,2017

Q751

A

1671-6647(2017)04-0547-12

10.3969/j.issn.1671-6647.2017.04.011

2017-02-21

國(guó)家自然科學(xué)基金項(xiàng)目——南極適冷菌Psychrobacter sp.G溫度與鹽度脅迫下基因表達(dá)譜分析及冷/熱激基因應(yīng)答機(jī)制研究(41176174);南北極環(huán)境綜合考察與評(píng)估專(zhuān)項(xiàng)——北極海域海洋生物和生態(tài)考察(CHINARE2016-03-05)和北極微生物資源多樣性與功能評(píng)估(CHINARE2016-04-03)

張 良(1990-),男,山東濰坊人,碩士研究生,主要從事極地微生物學(xué)方面研究.E-mail:1172627930@qq.com

*通訊作者:林學(xué)政(1971-),男,山東棲霞人,研究員,博士,主要從事海洋極端環(huán)境微生物學(xué)方面研究.E-mail:linxz@fio.org.cn

(王佳實(shí) 編輯)