基于線粒體COI基因的泰國近海有毒水母遺傳多樣性研究

繆曉翔,肖 潔,張學雷*,劉瑞娟,AUNGTONYA Charatsee

(1.國家海洋局第一海洋研究所,山東青島266061;2.海洋生態(tài)環(huán)境科學與工程國家海洋局重點實驗室,山東青島266061;3.Phuket Marine Biological Center,Phuket 83000,Thailand)

基于線粒體COI基因的泰國近海有毒水母遺傳多樣性研究

繆曉翔1,2,肖 潔1,2,張學雷1,2*,劉瑞娟1,2,AUNGTONYA Charatsee3

(1.國家海洋局第一海洋研究所,山東青島266061;2.海洋生態(tài)環(huán)境科學與工程國家海洋局重點實驗室,山東青島266061;3.Phuket Marine Biological Center,Phuket 83000,Thailand)

利用編碼線粒體細胞色素氧化酶I(COI)的基因片段序列,對泰國近海有毒水母69個樣本進行遺傳多樣性研究,并探討該片段作為DNA條形碼對泰國近海有毒水母類進行快速分類鑒定的可行性,以期為后續(xù)有毒水母的監(jiān)測和預警、生物學和生態(tài)學等的研究提供技術支撐。基因堿基組成分析表明,立方水母COI序列GC含量為42.1%,明顯高于缽水母(37.1%)和水螅水母(36.9%)。COI基因編碼氨基酸的密碼子第3位點GC含量(30.2%)顯著低于第1,2位點(分別為47.4%,42.1%),且該位點堿基替換頻率最高,轉換/顛換比值為1.0,表明該位點堿基突變趨于飽和;但去除密碼子第3位點,對系統(tǒng)進化樹的構建無顯著影響。根據(jù)COI序列計算3個綱水母的K2P(Kimura 2-parameter)遺傳距離,得出種內遺傳差異為0.000～0.151,均值為0.036,同綱種間遺傳差異為0.167～0.321,均值為0.263,綱間遺傳差異為0.246～0.385,均值為0.334。該COI基因片段能夠快速有效區(qū)分這些有毒水母種類。研究表明,泰國沿岸水母多樣性較高,所獲69個樣品可以分為13個種,包括5種缽水母、6種立方水母和2種水螅水母,其中Carukiidae科存在新屬新種。立方水母的地理分布具有明顯的區(qū)域特征,馬來半島東西兩岸存在物種和遺傳多樣性差異,其產生原因還有待于進一步研究。

立方水母;缽水母;DNA條形碼;COI序列;泰國

刺胞動物門(Cnidaria)中的水母亞門(Medusozoa)包含水螅蟲綱(Hydrozoa)、缽水母綱(Scyphozoa)、立方水母綱(Cubozoa)和十字水母綱(Staurozoa)四個綱。其中,立方水母雖然是種類數(shù)量最少的一個綱(目前已知僅有約36種[1]),但許多種類毒性極強,例如:Chironex fleckeri被稱為“海黃蜂(Sea wasp)”,人被大面積螫傷后可導致幾分鐘內死亡[2]。這些劇毒立方水母的廣泛分布,嚴重影響著沿海居民生命安全及海濱旅游業(yè)的發(fā)展,在印度洋-西太平洋熱帶地區(qū),劇毒立方水母蜇傷甚至使游客致死的事件頻繁發(fā)生,引起了當?shù)卣闹攸c關注[3-4]。僅在菲律賓沿岸的立方水母蜇死游客或漁民的發(fā)生率,每年可達20～50例,由于一些偏遠地區(qū)沒有統(tǒng)計數(shù)據(jù),實際發(fā)生率應遠高于此[4]。另外,近年來由于受人類活動及氣候變化的影響,水母數(shù)量劇增引發(fā)的重大事件在全球范圍內頻繁爆發(fā),例如:水母爆發(fā)堵塞發(fā)電廠的冷卻系統(tǒng),導致中國河北、山東等多地沿海發(fā)電廠被迫臨時關閉[5-6];在日本海[7]以及地中海、大西洋等某些海域[8],近海海域水母頻繁爆發(fā)嚴重破壞了當?shù)馗∮紊鷳B(tài)系統(tǒng)平衡,使海洋漁業(yè)大規(guī)模減產,造成了嚴重的經濟損失。因此,掌握水母種群和數(shù)量的動態(tài)分布與變化,尤其是對有毒水母進行快速鑒別和區(qū)分具有重要意義。

然而,僅依據(jù)傳統(tǒng)形態(tài)學來鑒別和區(qū)分不同的水母種類存在一定的局限性,不能直接應用于水母生物多樣性和種群監(jiān)測等的研究中。首先,目前水母的分類系統(tǒng)還不夠完善,一些種類原始標本的遺失、形態(tài)描述不充分、隱種(Cryptic species)的存在等,使得一些水母科屬還未明確其分類地位[9];隨著研究的深入,一些新的水母種類不斷被發(fā)現(xiàn)[10-11],但仍有許多種類沒有充分描述或正式命名[12]。其次,已有研究表明一些水母的形態(tài)特征具有不確定性,例如:不同生活史時期差異甚大[13],水母的形態(tài)在不同的海域也往往有變化。而且實際調查中的很多限制因素如樣品含水多,采集后易變形失真等,也增加了形態(tài)鑒定的難度。相對于傳統(tǒng)形態(tài)學鑒定方法,DNA條形碼的優(yōu)勢在于能以較低的成本快速獲取DNA信息,大大縮短了鑒定時間,且可以監(jiān)測水母從浮浪幼蟲到成體的全生活階段[14]。

自20世紀90年代開始,隨著測序技術的飛速發(fā)展和廣泛應用,一些水母類的核糖體基因和線粒體基因片段也逐漸被開發(fā),并應用于系統(tǒng)發(fā)育和進化研究[15-17]。線粒體DNA具有結構簡單、堿基替換率高、無組織特異性等優(yōu)點,適于物種分類、進化關系等的分析,其中線粒體細胞色素c氧化酶I(COI)在海洋生物分子系統(tǒng)學研究中應用廣泛。已有的許多研究證明基于COI的DNA條形碼在物種鑒定、隱存種發(fā)現(xiàn)等方面具有強大的功能[18-20],這在水母研究中得到應用[21-22]。

近年來,泰國有毒水母蜇傷游客的事故頻發(fā)[4],引起泰國政府部門的高度重視,初步調查發(fā)現(xiàn)泰國海域有毒水母多屬于立方水母綱和缽水母綱,尤其是數(shù)個劇毒的立方水母種類尚難準確鑒定并區(qū)分其種類[23]。另外,這些水母生活史復雜、形態(tài)多變,嚴重影響了對其種群分布、生活史以及環(huán)境影響要素等的生態(tài)學調查研究?；谛螒B(tài)分類的不足和DNA條形碼在物種分類上的優(yōu)勢,我們分析了泰國近海有毒水母COI基因片段,探討其在水母種類鑒定方面的應用價值,以期推動線粒體COI序列片段在泰國有毒水母種群監(jiān)測和研究中的應用。

1 材料與方法

1.1 樣品的采集與保存

2014-2015年,西南季風季(5-10月)、東北季風季(11月至翌年4月)各采樣2～3次。由于泰國近岸的劇毒水母(如立方水母)比較多,采樣工作均由當?shù)赜薪涷灥谋O(jiān)測人員和漁民負責,大部分是利用大型浮游生物網采集,另有少量樣本來自當?shù)貪O民的零星采集。

甄選有毒水母樣本69個用于遺傳多樣性研究,其中12個采自泰國灣西部沿岸,57個來自安達曼海東部沿岸(圖1)。取小塊傘部或觸手組織,用體積分數(shù)為95%的酒精固定,4℃保存于冰箱中,運送至實驗室,2015-10開始進行DNA分析。其余組織保存于體積分數(shù)為5%的甲醛中,用于形態(tài)學的鑒定,泰方負責的形態(tài)學研究結果另文追述,表4僅列出我們研究中69個樣品的形態(tài)鑒定相關信息。

1.2 DNA的提取以及PCR擴增和測序

切取每個組織樣本約3 mg,用蒸餾水沖洗數(shù)次,無菌濾紙汲取樣品中的水分后,用滅菌刀片將組織切碎并研磨,使用動物組織DNA提取試劑盒(美國Omega Bio-Tek公司生產E.Z.N.A.TM型)提取基因組DNA[24]。

PCR擴增在PCR儀(杭州博日科技有限公司生產Gene Touch型)上進行,COI反應體系為50μL,包括5μL 10×buffer,4μL Mg2+(25 mmol/L),4μL d NTP(10 mmol/L),2μL每條引物(10μmol/L),0.25 U Taq酶(大連寶生物工程有限公司生產),0.75μL BSA(10 mg/m L,牛血清白蛋白),2μL基因組DNA模版(約50 ng),其余用超純水補足。擴增COI片段的反應程序:94℃預變性2 min,然后35個循環(huán)包括94℃變性45 s,48℃退火60 s,72℃延伸2 min,最后72℃延伸10 min。反應引物(表1)主要使用引物CNCOXF/R擴增,效果不佳時,采用其他2對引物擴增。

圖1 采集地點和樣品數(shù)量(括號內數(shù)字)Fig.1 The collecting locations and sample sizes(numbers in brackets)

表1 所用引物序列及參考文獻Table 1 Sequences and references of the primers used in the study

擴增產物經瓊脂糖凝膠電泳檢測,驗證無誤后使用割膠回收試劑盒(美國Omega Bio-Tek公司生產E.Z.N.A.TM型)進行回收純化[24]。純化產物直接送青島擎科梓熙生物技術有限公司使用PCR引物雙向測序。部分測序困難的樣品采用PMD TM 19-T(大連寶生物工程有限公司生產)連接,并轉化至感受態(tài)大腸桿菌DH5α,采用麥康凱選擇性培養(yǎng)基篩選陽性克隆,經PCR檢測確認無誤后,選擇4～5個陽性克隆進行雙向測序。

1.3 數(shù)據(jù)處理

所得原始峰圖文件先經Seqman軟件(DNAstar軟件包)處理,進行序列拼接,并人工校正。使用Bioedit v7.0.9.0軟件中內置的Clustal W對核苷酸序列進行比對分析,參數(shù)為默認值。所得序列去除引物和兩端質量不高的部分,并雙向進行比對,對于正反向存在不一致的序列,會重復測序,以確定正確的序列。部分樣品進行連接轉化后測序,所得的重復序列進行比對,并以一致共有的序列作為該樣品的代表性序列,與其它樣品進行比較。研究中獲得水母COI片段69條,結合從GenBank數(shù)據(jù)庫中下載的19條相關代表性COI序列(表2),對所得樣品進行系統(tǒng)發(fā)育研究。比對后,去除兩端較長的序列,保留621 bp可比對位點。使用MEGA 6.0軟件統(tǒng)計堿基組成、堿基替換。計算基于K2P(Kimura 2-parameter)模型的樣品間相對遺傳距離(d),并按各樣品的分類組別分別統(tǒng)計和比較種內、種間和綱間遺傳距離的變化。利用無脊椎動物線粒體遺傳密碼翻譯COI核苷酸序列,并與GenBank中已知序列進行比對,尋找正確的翻譯密碼框;兩兩比較不同序列間轉換、顛換數(shù)量和轉換/顛換比值(R),進一步分析R值與d之間的關系;分別計算密碼子不同位點(第1,2,3位點)上的堿基含量、替換頻率、R值,以及與d的關系。分別采用鄰接法NJ(Neighbor-joining)和最大似然法ML(Maximum Likelihood)構建系統(tǒng)發(fā)育樹。鄰接法通過確定距離最近或相鄰的成對分類單位來使系統(tǒng)樹的總距離達到最小,而最大似然法根據(jù)堿基替換模型計算每個系統(tǒng)樹的似然值,以似然率最大的拓撲結構作為最優(yōu)樹,2種方法所建的系統(tǒng)樹可相互比較印證,并用1 000次bootstrap檢驗系統(tǒng)發(fā)育樹各節(jié)點的可信度。

1.4 統(tǒng)計分析

分別統(tǒng)計各綱中COI序列的GC含量(%)及標準誤差(SE),并利用SPSS16.0軟件包中的單因素方差分析(one-way ANOVA)方法,檢驗不同綱之間GC含量是否具有顯著差異。為檢驗不同樣本間(種內、種間和綱間)R值是否趨于飽和,做R值隨著遺傳距離(d)增加而變化的散點圖,并利用多項式回歸模型做出兩者之間的趨勢線。

表2 從Genebank下載的水母COI基因序列信息,包括序列號、種類和資料來源Table 2 Information of the COI sequences retrieved from the GenBank database,including accession numbers,species and the references

2 結果與分析

2.1 COI基因序列堿基組成與替換統(tǒng)計分析

3個綱(缽水母、立方水母、水螅水母)的GC含量平均分別為37.1%(標準誤差SE=0.3)、42.1%(SE=0.2)、36.9%(SE=2.2),并且不同綱間差異顯著(one-way ANOVA,P＜0.01),立方水母的COI序列GC含量明顯高于缽水母和水螅水母(表3)。3個密碼子位點的堿基組成差異也較大,第1位點較高,平均為47.4%,第2位點次之,為42.1%,第3位點最低,為30.2%,且3個綱的趨勢一致。可見,密碼子堿基使用頻率存在明顯的偏向性。

總共621 bp比對位點中,保守位點C(Conserved sites)322個,約占總數(shù)的51.9%;變異位點V(Variable sites)299個,其中簡約信息位點Pi(Parsim-info sites)293個,自裔位點Si(Singleton sites)6個,分別占47.2%,1.0%。進一步對密碼子各位點分別進行分析發(fā)現(xiàn):堿基替換主要發(fā)生在密碼子的第3位點,總共299個變異位點中,128個發(fā)生在第3位點上,占總變異位點的42.8%;對比密碼子第1,2位點,第3位點顛換的發(fā)生頻率較高,轉換與顛換的比值(R)為1.00;密碼子第1,2位點的堿基替換頻率分別為4.19%,0.97%,R值分別是1.43,0.37。3個綱間的R值波動較大,立方水母和水螅水母的轉換明顯高于顛換,R值分別為1.34,1.33,缽水母的COI序列中,顛換較多,R值為0.93。

表3 COI基因片段GC含量(%)和轉換/顛換比值(R)Table 3 G and C nucleotide composition(%)and Ts vs.Tv(R)of partial COI sequences

2.2 遺傳距離計算

以K2P模型計算COI序列之間遺傳距離,按照分類階元進行統(tǒng)計分析(圖2)。種內差異明顯小于種間和綱間差異。在種內,COI序列的差異為0.000～0.151(平均為0.036),中位數(shù)為0.006。同綱種間,序列差異為0.167～0.321(平均0.263)。不同的綱間遺傳差異為0.246～0.385(平均為0.334)。同綱種間遺傳距離是種內遺傳距離的7.3倍,而不同綱間的遺傳距離是種內的9.3倍(圖2)。

進一步分析密碼子不同位點的堿基突變與遺傳距離估算之間的關系,發(fā)現(xiàn)遺傳距離d＜0.100時,序列間轉換/顛換比值(R)波動較大,且密碼子第3位點的R值明顯低于3個位點的綜合結果;遺傳距離d＞0.150時,R值較小,且波動不大,第3位點的R值與綜合密碼子3個位點的結果無明顯區(qū)別(圖3)。

圖2 水母COI序列不同分類階元水平的遺傳距離(d)范圍箱式圖Fig.2 Boxplot on the range of pairwised genetic distances(d)at the levels of intra-,inter-species and among classes

圖3 R值與遺傳距離(d)的散點圖Fig.3 Estimated R values plotted as a function of the genetic distance(d)from pairwise comparisons of COI genes

2.3 基于COI序列的系統(tǒng)樹分析

用NJ和ML法對本研究所得69條COI序列及19條Gen Bank數(shù)據(jù)庫中代表性序列(表2)構建系統(tǒng)進化樹,2種方法所得的進化樹基本一致(圖3):88條序列可以分為3大組,39條序列與6條立方水母綱下載序列(FJ665180,KT223648,JN642335,JN700970,HQ824530,JN700960)組成立方水母綱(Cubozoa);另有26條本研究所得序列和9條下載序列聚合在一起,形成缽水母綱(Scyphozoa);其余8條序列聚成水螅水母綱(Hydrozoa)。缽水母綱可進一步分為5個獨立分支(圖4),立方水母亦可分成6個分支,分別代表本研究中所檢測獲得的不同種類。去除突變率較高的密碼子第3位點,僅根據(jù)第1,2位點構建系統(tǒng)發(fā)育樹(圖5),結果與保留所有位點構建的系統(tǒng)發(fā)育樹基本相同。

2.4 泰國有毒水母的種類及分布

對研究中69個泰國近海常見有毒水母樣本的分類及分布范圍的統(tǒng)計見表4。缽水母綱26個樣品中共有5個種:金黃水母(Chrysaora sp.)、海月水母(Aurelia sp.)、珍珠水母(Phyllorhiza puncatata)、沙海蜇(Stomolophus meleagris)和端棍水母(Catostylus sp.);立方水母綱39個樣品,分別屬于3科(Carukiidae,Chirodropidae和Chiropsalmidae),6個種(表4);水螅水母樣品共有4個,屬于2個種:多管水母(Aequorea sp.)和僧帽水母(Physalia sp.)。Chiropsoides buitendijki存在種內分化,根據(jù)COI序列,20個樣本明顯分為2個群體(圖4和圖5),而這2個群體的18S序列完全一致[23],屬于同一種,其COI序列的分化代表種內不同遺傳群體間的差異。金黃水母、Chiropsoides buitendijki數(shù)量較多,且分布范圍較廣,在安達曼海和泰國灣均有分布。

圖4 基于COI序列的系統(tǒng)樹(括號外為ML法檢驗值,括號內為NJ法檢驗值)Fig.4 Phylogenetic tree based on COI sequences(bootstrapping support values of MJ tree are labeled outside the brackets and values of NJ tree are inside the brackets)

2.5 立方水母綱新種的發(fā)現(xiàn)

立方水母綱Carukiidae科的16個樣本分為4個小支,結合16S和18S數(shù)據(jù)[23],其中7個樣本(NO.C1～NO.C6,NO.L3)屬于Morbakka屬;其余9個樣本與該科內已知的4個屬(Malo,Morbakka,Gerongia和Carukia)存在明顯的遺傳分化,結合形態(tài)學數(shù)據(jù)(Charatsee Aungtonya和肖潔未發(fā)表數(shù)據(jù)),這9個樣本組成一新屬,并可分為2個新種(表4)。然而,GenBank數(shù)據(jù)庫中關于立方水母的基因數(shù)據(jù)不夠完整,目前已有基因數(shù)據(jù)的種類數(shù)量不足總數(shù)的40%[38],而東南亞熱帶地區(qū)立方水母的序列數(shù)據(jù)尤為匱乏,一些樣本僅依賴分子序列,并不能完全確定其種屬地位,需要結合形態(tài)學數(shù)據(jù)進行系統(tǒng)的研究。在后續(xù)研究中,我們將與泰方研究人員合作,對一些新種進行逐個描述和命名。

圖5 基于COI序列的系統(tǒng)樹(只包含密碼子第1,2位點)Fig.5 Phylogenetic tree based on COI sequences with only 1st,2nd condon positions included

表4 泰國沿海有毒水母種類和分布范圍Table 4 Species and distribution of the venomous jellyfish collected from the coasts of Thailand

3 討 論

我們對采自于泰國沿海的69個有毒水母樣本的線粒體COI基因片段進行分析,堿基組成分析結果表明,3個綱線粒體COI基因的GC含量都小于50%,這符合后生動物的線粒體基因組堿基組成的特點[39],立方水母的GC含量顯著高于缽水母和水螅水母綱,這與前人的結果[27]基本一致。3個密碼位點的堿基組成結果表明,密碼子第3位點的GC含量最小,這表明COI序列核苷酸堿基構成出現(xiàn)了明顯的偏倚現(xiàn)象;并且,密碼子第3位點的堿基替換速率明顯高于第1,2位點,符合氨基酸編碼基因第3位點進化最快的規(guī)律[40];該位點上,轉換與顛換比值(R)也低于第1,2位點,尤其是水螅水母和缽水母,R＜2(表3),說明該位點上堿基突變已趨于飽和(圖3)。為減少由于堿基突變過飽和,而低估物種之間的遺傳差異,我們采用2種方法(保留所有位點和只包含密碼子第1,2位點)構建COI基因序列的系統(tǒng)發(fā)育樹。結果表明2種方法所得的系統(tǒng)發(fā)育樹基本一致(圖4和圖5),說明密碼子第3位點的高突變率未對遺傳距離的估算和遺傳關系分析造成明顯影響,該段基因適用于不同水平的物種區(qū)分和進化樹構建。

通過COI基因片段的序列分析,在泰國沿海采集的69個有毒水母樣本可區(qū)分為13個種,在綱的水平上,利用分子生物學與形態(tài)學手段所得的結果一致,但在種的水平上存在一些差異(表4),例如:缽水母綱中,有9個樣品被鑒定為同一種向心水母(Lychnorhiza sp.),然而根據(jù)其COI序列可分為3種,分別為海月水母(Aurelia sp.)、端棍水母(Catostylus sp.)和金黃水母(Chrysaora sp.)。立方水母綱中有16個樣本被鑒定為Morbakka sp.,但其COI基因序列存在明顯分化,可分為3個獨立分支。結合18S與16S基因結果[23],其中一支與來自于日本的Morbakka virulenta[38]相近,雖然18S基因與M.virulenta一致,但16S與COI基因存在明顯差異,16S遺傳距離為0.000～0.050,均值為0.009[23],研究中COI遺傳距離為0.000～0.151,均值為0.036;另外,該水母的足葉管等形態(tài)特征(Charatsee Aungtonya未發(fā)表數(shù)據(jù))與已知的M.virulenta和M.fenner[41]不同;因此,該水母可能為Morbakka屬中的新種。另2個分支也屬于Carukiidae科,但16S和18S序列數(shù)據(jù)表明其與該科內已知的4個屬(Malo,Morbakka,Gerongia和Carukia)明顯不同[23,40,42];形態(tài)分析進一步發(fā)現(xiàn)其眼點(rhopalia)形狀和假緣膜(velarium)花紋比較特殊(Charatsee Aungtonya未發(fā)表數(shù)據(jù))[42],也與該科內的其他4個屬不同,因此,該水母為Carukiidae科中的新屬,系統(tǒng)的形態(tài)描述和種屬的建立正在進行中。上述結果也表明,研究所用的線粒體COI基因片段,可以有效區(qū)分泰國沿海常見的水母種類,這種基于線粒體COI基因片段的DNA條形碼技術可以為后續(xù)有毒水母種類的生活史、監(jiān)測和生態(tài)學等方面的研究提供快捷有效的技術手段。

4 結 語

我們利用線粒體COI序列對泰國沿海習見有毒水母進行遺傳多樣性分析,研究表明泰國沿海水母多樣性較高,其中劇毒的立方水母有5種,且立方水母的地理分布呈明顯的區(qū)域特征。例如:Chiropsoides buitendijk明顯分為2個遺傳群體(圖4和圖5),其中一個群體集中于攀牙府(Phany-nga Province)的Panwa Bay,而另一個群體在安達曼海東部沿岸和泰國灣均有分布;Carukiidae科新屬中的2個相近種,一種只出現(xiàn)于安達曼海東部沿岸,另一種在泰國灣和安達曼海東部沿岸均有發(fā)現(xiàn),而Morbakka sp.也只在泰國灣沿岸發(fā)現(xiàn)。與泰國灣海域相比,安達曼東部沿岸的水母多樣性更高,其中,攀牙府附近海域的水母多樣性最高,約有8種。我們的研究中來自安達曼東部沿海的樣本數(shù)量高于泰國灣的,這可能對評估2個海域的物種遺傳多樣性產生一定的影響,后續(xù)研究中應加強對泰國灣海域的樣品采集和分析。然而,一些種類或群體呈明顯的局域性分布,結合往年對于泰國近岸有毒水母分布的調查數(shù)據(jù)[43]分析,馬來半島(Malay Peninsula)東西兩岸的水母存在物種和遺傳多樣性差異。這種差異是否在浮游生物中普遍存在,是否是2海域的地理隔離造成的,有待于進一步研究。

[1] DALY M,BRUGLER M R,CARTWRIGHT P,et al.The phylum Cnidaria:A review of phylogenetic patterns and diversity 300 years after Linnaeus[J].Zootaxa,2007,1668:127-182.

[2] FENNER P J,HARRISON S L.Irukandji and Chironex fleckeri jellyfish envenomation in tropical Australia[J].Wilderness and Environmental Medicine,2000,11:233-240.

[3] XIAO L,ZHANG L M.Research development of jellyfish toxins[J].Chinese Journal of Marine Drugs,2007,26(6):40-43.肖良,張黎明.水母毒素的研究進展[J].中國海洋藥物,2007,26(6):40-43.

[4] FENNER P J,LIPPMANN J,GERSHWIN L A.Fatal and nonfatal severe jellyfish stings in Thai waters[J].Journal of Travel Medicine,2010,17(2):133-138.

[5] LIU X,LI D G.When the jellyfish hit rough[J].North China Power,2008(4):66-69.劉旋,李德剛.當海蟄群洶涌襲來[J].華北電業(yè),2008(4):66-69.

[6] DONG Z,LIU D,KEESING J K.Jellyfish blooms in China:dominant species,causes and consequences[J].Marine Pollution Bulletin,2010,60(7):954-963.

[7] UYE S I,FUJII N,TAKEOKA H.Unusual aggregations of the scyphomedusa Aurelia aurita in coastal waters along western Shikoku,Japan[J].Plankton Biology and Ecology,2003,50(1):17-21.

[8] LICANDRO P,CONWAY D V P,DALY YAHIA M N,et al.A blooming jellyfish in the northeast Atlantic and Mediterranean[J].Biology Letters,2010,6(6):688-691.

[9] DAWSON M N.Some implications of molecular phylogenetics for understanding biodiversity in jellyfishes,with emphasis on Scyphozoa[J].Hydrobiologia,2004(530/531):249-260.

[10] HUANG J Q,XU Z Z,LIN M,et al.Two new species of genus Nubiella from the Taiwan Strait,China(Filifera,Bougainvillidae)[J].Journal of Xiamen University(Natural Science),2012,51(1):130-133.黃加祺,許振祖,林茂,等.臺灣海峽單肢水母屬二新種(絲螅水母目,高手水母科)[J].廈門大學學報(自然科學),2012,51(1):130-133.

[11] HUANG J Q,XU Z Z,LIN M,et al.Two new species of Suborder Tubulariida from the South China Sea(Anthomedusae,Capitata)[J].Journal of Xiamen University(Natural Science),2015,54(6):825-828.黃加祺,許振祖,林茂,等.南海筒螅水母亞目二新種(花水母亞綱,頭螅水母目)[J].廈門大學學報(自然科學),2015,54(6):825-828.

[12] BENTLAGE B.Phylogenetic systematics,taxonomy and biogeography of jellyfish(Cnidaria:Medusozoa)[D].Larence:The University of Kansas,2012.

[13] ORTMAN B D,BUCKLIN A,PAGES F,et al.DNA Barcoding the Medusozoa using mtCOI[J].Deep Sea Research Part II:Topical Studies in Oceanography,2010,57(24):2148-2156.

[14] CHENG F P,WANG X M,WANG Y T,et al.DNA barcoding of common Medusozoa in northern China based on mtCOI sequence[J].Oceanologia et Limnologia Sinica,2012,43(3):451-459.程方平,王曉敏,王彥濤,等.中國北方習見水母類的DNA條形碼分析[J].海洋與湖沼,2012,43(3):451-459.

[15] BRIDGE D,CUNNINGHAM C W,SCHIERWATER B,et al.Class-level relationships in the phylum Cnidaria:evidence from mitochondrial genome structure[J].Proceedings of the National academy of Sciences,1992,89(18):8750-8753.

[16] HORI H,SATOW Y.Dead-end evolution of the Cnidaria as deduced from 5S ribosomal RNA sequences[J].Hydrobiologia,1991,216(1):505-508.

[17] ODORICO D M,MILLER D J.Variation in the ribosomal internal transcribed spacers and 5.8S r DNA among five species of Acropora(Cnidaria;Scleractinia):patterns of variation consistent with reticulate evolution[J].Molecular Biology and Evolution,1997,14(5):465-473.

[18] BALL S L,HEBERT P D N,BURIAN S K,et al.Biological identifications of mayflies(Ephemeroptera)using DNA barcodes[J].Journal of the North American Benthological Society,2005,24(3):508-524.

[19] JOHNSON S B,WAREN A,VRIJENHOEK R C.DNA barcoding of Lepetodrilus limpets reveals cryptic species[J].Journal of Shellfish Research,2008,27(1):43-51.

[20] SCHLEI O L,CREETE-LAFRENLERE A,WHITELEY A R,et al.DNA barcoding of eight North American coregonine species[J].Molecular Ecology Resources,2008,8(6):1212-1218.

[21] ZHANG S,ZHANG F,LIU Y,et al.Molecular identification of two macro-jellyfish in China[J].Oceanologia et Limnologia Sinica,2009,40(1):94-101.張姝,張芳,劉媛,等.我國海域兩種大型水母的分子鑒定[J].海洋與湖沼,2009,40(1):94-101.

[22] ZHENG L M,LIN Y S,LI S J,et al.Morphological and molecular evidences of Aequorea taiwanensis n.sp.from Taiwan Strait,with mtCOI sequence analysis for genus Aequorea[J].Haiyang Xuebao,2008,30(4):139-146.鄭連明,林元燒,李少菁,等.臺灣海峽多管水母屬——新種及基于線粒體COI序列分析鑒定多管水母[J].海洋學報,2008,30(4):139-146.

[23] LIU R J,XIAO J,ZHANG X L,et al.Genetic analysis of common venomous Cubozoa and Scyphozoa in Thai waters based on 16Sand 18S r DNA sequences[J].Haiyang Xuebao,2016,38(6):51-61.劉瑞娟,肖潔,張學雷,等.泰國近海習見有毒立方水母和缽水母的遺傳分析[J].海洋學報,2016,38(6):51-61.

[24] OMEGA BIO-TEK.E.Z.N.ATMprotocol for tissue[EB/OL].(2012-03)[2016-08-15].https:∥www.omegbiotek.com.

[25] FOLMER O,BLACK M,HOEH W,et al.DNA primers for amplification of mitochondrial cytochrome c oxidase subunit I from diverse metazoan invertebrates[J].Molecular Marine Biology and Biotechnology,1994,3(5):294-299.

[26] SMITH D R,KAYAL E,YANAGIHARA A A,et al.First complete mitochondrial genome sequence from a box jellyfish reveals a highly fragmented linear architecture and insights into telomere evolution[J].Genome Biology and Evolution,2012,4(1):52-58.

[27] KAYAL E,BENTLAGE B,COLLINS A G,et al.Evolution of linear mitochondrial genomes in medusozoan cnidarians[J].Genome Biology and Evolution,2011,4(1):1-12.

[28] NCBI(National Center for Biotechnology Information).GenBank.[DB/OL].[2016-08-15].https:∥www.ncbi.nlm.nih.gov/genbank.

[29] LEWIS C,BENTLAGE B.Clarifying the identity of the Japanese Habu-kurage,Chironex yamaguchii,sp.nov.(Cnidaria:Cubozoa:Chirodropida)[J].Zootaxa,2009,513(2030):59-65.

[30] COLLINS A G,SCHUCHERT P,MARQUES A C,et al.Medusozoan phylogeny and character evolution clarified by new large and small subunit r DNA data and an assessment of the utility of phylogenetic mixture models[J].Systematic Biology,2006,55(1):97-115.

[31] KI J S,HWANG D S,SHIN K,et al.Recent moon jelly(Aurelia sp.1)blooms in Korean coastal waters suggest global expansion:examples inferred from mitochondrial COI and nuclear ITS-5.8 S rDNA sequences[J].ICES Journal of Marine Science,2008,65(3):443-452.

[32] DAWSON M N,CIECIEL K,DECKER M B,et al.Population-level perspectives on global change:genetic and demographic analyses indicate various scales,timing,and causes of scyphozoan jellyfish blooms[J].Biological Invasions,2015,17(3):851-867.

[33] ARMANI A,TINACCI L,GIUSTI A,et al.What is inside the jar?-Forensically informative nucleotide sequencing(FINS)of a short mitochondrial COI gene fragment reveals a high percentage of mislabeling in jellyfish food products[J].Food Research International,2013,54(2):1383-1393.

[34] BAYHA K M,GRAHAM W M.First confirmed reports of the rhizostome jellyfish Mastigias(Cnidaria:Rhizostomeae)in the Atlantic basin[J].Aquatic Invasions,2011,6(3):361-366.

[35] KOCOT K M,TODT C.Three new meiofaunal solenogaster species(Mollusca:Aplacophora)from the north-east Pacific[J].Journal of Natural History,2014,48(45-48):3007-3031.

[36] ZHENG L,HE J,LIN Y,et al.16S r RNA is a better choice than COI for DNA barcoding hydrozoans in the coastal waters of China[J].Acta Oceanologica Sinica,2014,33(4):55-76.

[37] KAYAL E,BENTLAGE B,CARTWRIGHT P,et al.Phylogenetic analysis of higher-level relationships within Hydroidolina(Cnidaria:Hydrozoa)using mitochondrial genome data and insight into their mitochondrial transcription[J].PeerJ,2015,3:e1403.

[38] BENTLAGE B,CARTWRIGHT P,YANAGIHARA A A,et al.Evolution of box jellyfish(Cnidaria:Cubozoa),a group of highly toxic invertebrates[J].Proceedings of the Royal Society of London B:Biological Sciences,2010,277(1680):493-501.

[39] BEARD C B,HAMM D,COLLINS F H.The mitochondrial genome of the mosquito Anopheles gambiae:DNA sequence,genome organization,and comparisons with mitochondrial sequences of other insects[J].Insect Molecular Biology,1993,2(2):103-124.

[40] IRWIN D M,KOCHER T D,WILSON A C.Evolution of the cytochrome b gene of mammals[J].Journal of Molecular Evolution,1991,32(2):128-144.

[41] GERSHWIN L A.MORBAKKA FENNERI.A new genus and species of Irukandji jellyfish(Cnidaria:Cubozoa)[J].Memoirs of the Queensland Museum-Nature,2008,54(1):23-33.

[42] BENTLAGE B,LEWIS C.An illustrated key and synopsis of the families and genera of carybdeid box jellyfishes(Cnidaria:Cubozoa:Carybdeida),with emphasis on the"Irukandji family"(Carukiidae)[J].Journal of Natural History,2012,46(41-42):2595-2620.

[43] AUNGTONYA C,CHANACHON K.Species and distribution of venomous jellyfish in coastal areas of Phuket Province[R]∥Technical Paper.Phuket:Phuket Marine Biological Center Press,2012.

Genetic Diversity of the Venomous Medusae in Thai Waters Based on the Mitochondrial COI Gene Sequences

MIAO Xiao-xiang1,2,XIAO Jie1,2,ZHANG Xue-lei1,2,LIU Rui-juan1,2,AUNGTONYA Charatsee3
(1.The First Institute of Oceanography,SOA,Qingdao 266061,China;2.Key Laboratory of Science and Engineering for Marine Ecology and Environment,SOA,Qingdao 266061,China;3.Phuket Marine Biological Center,Phuket 83000,Thailand)

To explore the genetic diversity of the venomous medusae,the partial mitochondrial COI gene sequences were generated from 69 jellyfish specimens collected from the coastal waters of Thailand.And the feasibility of DNA barcoding using this gene fragment was further investigated,in order to provide technique supporting for the early warning of venomous medusae in Thailand,and for the future work on ecology and biology of these venomous jellyfish as well.The analysis of nucleotide composition of the sequences showed that G and C nucleotide percentage(GC%)of Cubozoa(42.1%)was significantly higher than those of Scyphozoa(37.1%)and Hydrozoa(36.9%).GC%of the 3rd condon position(30.2%)was much lower than those of the 1st and 2nd positions(47.4%and 42.1%,respectively).Besides,the frequency of nucleotide substitution was highest at the 3rd positions with the R value(transition/transversion)of 1.0,indicating that the mutational rate at this position was prone to be saturated.Whereas,the topology of the phylogenetic tree was not significantly changed after the 3rd condon positions were excluded from the analyses.The K2P(Kimura 2-parameter)genetic distance was evaluated within and among the species based on the sequences of COI gene.The intra-specific genetic distances ranged from 0.000 to 0.151,with the average of 0.036;the inter-specific distances varied from 0.167 to 0.321,with the average of 0.263,and inter-classes were from 0.246 to 0.385 with the average of 0.334.The COI gene fragments were proved to be able to discriminate these venomous jellyfish species fast and efficiently.Additionally,a high species diversity of the venomous jellyfish along the coasts of Thailand was revealed by this research.There were total 13 species identified from the 69 samples,including 5 Cubozoa species,6 scyphozoans and 2 hydrozoans.A new genus of the family Carukiidae was suggested by this study.A regional distribution pattern of the cubozoan jellyfish in Thai waters was observed,which showed the species and genetic divergence between east and west coasts of Malaya Peninsula.It needs further investigation whether there is a geographic barrier for the divergence between these two regional groups of cubozoan jellyfish.

Cubozoa;Scyphozoa;DNA barcoding;COI sequences;Thailand

September 1,2016

Q344

A

1671-6647(2017)04-0535-12

10.3969/j.issn.1671-6647.2017.04.010

2016-09-01

中國-東盟海上合作基金項目——瀕危海洋物種合作研究;國家自然科學青年基金項目——我國海水甲殼類中寄生性甲藻(Hematodinium)的種群遺傳結構及其分子系統(tǒng)分類地位的研究(41206162)

繆曉翔(1991-),女,江蘇南通人,碩士研究生,主要從事近海水母和大型藻類的生態(tài)學方面研究.E-mail:miaoxiaoxiang@fio.org.cn

*通訊作者:張學雷(1973-),男,山東淄博人,博士,研究員,主要從事海洋生物、環(huán)境科學和生態(tài)學方面研究.E-mail:zhangxl@fio.org.cn

(高 峻 編輯)