秀珍菇不同生長(zhǎng)發(fā)育階段蛋白質(zhì)組學(xué)分析

王偉科，袁衛(wèi)東，方獻(xiàn)平，宋吉玲，閆靜，陸娜

秀珍菇不同生長(zhǎng)發(fā)育階段蛋白質(zhì)組學(xué)分析

王偉科1*，袁衛(wèi)東1，方獻(xiàn)平2，宋吉玲1，閆靜1，陸娜11

（1.杭州市農(nóng)業(yè)科學(xué)研究院蔬菜研究所，杭州310024；2.杭州市農(nóng)業(yè)科學(xué)研究院生物技術(shù)研究所，杭州310024）

為了解秀珍菇生長(zhǎng)發(fā)育各階段蛋白質(zhì)組的差異，對(duì)秀珍菇菌絲生長(zhǎng)期、原基期、珊瑚期及子實(shí)體成熟期4個(gè)不同階段的表達(dá)蛋白進(jìn)行比較蛋白質(zhì)組學(xué)分析。結(jié)果表明：與最初的菌絲生長(zhǎng)期相比，其余3個(gè)不同發(fā)育時(shí)期共篩選得到885個(gè)差異表達(dá)蛋白，原基期、珊瑚期和子實(shí)體成熟期分別有差異表達(dá)蛋白376、642及692個(gè)；這4個(gè)階段特異表達(dá)的蛋白分別為11、23、136和181個(gè)?；虮倔w注釋結(jié)果顯示，分別有26%、20%、15%和11%的差異蛋白參與糖類合成、生殖結(jié)構(gòu)發(fā)育、器官合成和蛋白大分子代謝等生物學(xué)過(guò)程；代謝通路分析表明，差異表達(dá)蛋白顯著富集在三羧酸循環(huán)和糖酵解/糖異生途徑2條代謝通路上，這些通路的改變很有可能在秀珍菇的生長(zhǎng)發(fā)育過(guò)程中起著重要作用。研究還發(fā)現(xiàn)，參與胞內(nèi)應(yīng)激修復(fù)過(guò)程的HSP70蛋白在不同階段發(fā)生顯著差異表達(dá)變化，提示分子伴侶類熱激蛋白對(duì)調(diào)控秀珍菇生長(zhǎng)發(fā)育具有重要意義。

秀珍菇；生長(zhǎng)期；蛋白質(zhì)組學(xué)

食用菌的生長(zhǎng)發(fā)育過(guò)程極為復(fù)雜，在不同的生長(zhǎng)發(fā)育階段受新陳代謝、營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)合成及轉(zhuǎn)運(yùn)、細(xì)胞分裂及分化、激素調(diào)控、信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)等多個(gè)代謝途徑的協(xié)同作用[1]。了解食用菌的生長(zhǎng)發(fā)育機(jī)制對(duì)其遺傳育種和栽培技術(shù)的研究具有重要指導(dǎo)意義，因此，食用菌尤其是可食用擔(dān)子菌子實(shí)體的形態(tài)建成一直是研究的重點(diǎn)。

蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)已經(jīng)成為當(dāng)今生命科學(xué)領(lǐng)域的研究熱點(diǎn)，是生物學(xué)中破譯基因功能、服務(wù)育種程序及提高作物品質(zhì)的重要途徑[2]。目前，蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)在食用菌研究中的應(yīng)用還處于起步階段，主要涉及食用菌不同生長(zhǎng)發(fā)育階段、不同組織形態(tài)階段等遺傳機(jī)制和逆境脅迫下差異表達(dá)蛋白的研究[3]，研究品種主要集中在雙孢蘑菇（Agaricus bisporus）[4]、金針菇（Flammulina velutipes）[5]、斑玉蕈（Hypsizigus marmoreus）[6]、靈芝（Ganoderma lucidum）[7]等。而利用蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)開展珍稀食用菌秀珍菇（Pleurotus pulmonarius）的生長(zhǎng)發(fā)育機(jī)制研究尚未見報(bào)道。

秀珍菇隸屬于擔(dān)子菌綱、傘菌目、側(cè)耳科、側(cè)耳屬，其生長(zhǎng)發(fā)育過(guò)程包含營(yíng)養(yǎng)生長(zhǎng)和生殖生長(zhǎng)2個(gè)階段。秀珍菇菌絲體在適宜的養(yǎng)分和環(huán)境條件下逐漸達(dá)到生理成熟形成原基，并進(jìn)一步分化成為成熟的子實(shí)體[8]。這一系列生理過(guò)程除了受栽培環(huán)境、基質(zhì)營(yíng)養(yǎng)成分等外在因素的影響外，主要還由其自身的遺傳因子所決定，即通過(guò)調(diào)控相關(guān)基因的表達(dá)來(lái)編碼蛋白質(zhì)表達(dá)，從而指導(dǎo)完成復(fù)雜的生理過(guò)程。因此，本文研究了秀珍菇不同生長(zhǎng)階段的差異表達(dá)蛋白，探討了其生長(zhǎng)發(fā)育過(guò)程中菌絲生長(zhǎng)、原基形成分化及子實(shí)體的建成機(jī)制，從而進(jìn)一步揭示秀珍菇生長(zhǎng)發(fā)育的分子機(jī)制，為加快其遺傳育種過(guò)程奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

供試秀珍菇菌株“臺(tái)秀5766”由浙江臨安鼎新生物科技有限公司提供。4個(gè)生長(zhǎng)發(fā)育階段，即菌絲體階段（S1）、原基形成期（S2）、珊瑚期（S3）和子實(shí)體成熟期（S4）的秀珍菇均采自杭州市農(nóng)業(yè)科學(xué)研究院蔬菜研究所菌種站大棚。菌包基質(zhì)配方為棉籽殼30%，木屑54%，麩皮15%，石灰1%。

1.2 秀珍菇蛋白的提取及定量

稱取每個(gè)階段新鮮秀珍菇材料1 g，在液氮中研磨成細(xì)粉，分裝入1.5 mL離心管中，加入1 mL蛋白質(zhì)提取液Ⅰ（含10%三氯乙酸和0.07%β-巰基乙醇的丙酮溶液）沉淀粗蛋白（－20℃，1 h），然后于4℃、1.3萬(wàn)r/min下離心20 min。再加入相同體積蛋白提取液Ⅱ（含0.07%β-巰基乙醇的丙酮溶液）懸浮粗蛋白（－20℃，1 h），然后于4℃、1.3萬(wàn)r/min下離心20 min。棄上清液，將沉淀用蛋白提取液Ⅱ懸浮清洗2次（－20℃，1 h），真空抽干得粗蛋白粉。準(zhǔn)確稱取50 mg粉末，加入1 mL裂解液（8 mol/L尿素、10 mmol/L二硫代蘇糖醇、2 mmol/L乙二胺四乙酸和1 mmol/L苯甲基磺酰氟）中，振蕩混勻，在4℃靜置1 h，期間取出振蕩3～5次，然后在20℃、1.3萬(wàn)r/min下離心15 min，取上清液。用Bradford法蛋白定量后分裝并保存于－80℃?zhèn)溆谩?/p>

1.3 蛋白溶液內(nèi)酶解與除鹽

取約100 μg蛋白樣本進(jìn)行酶解：加入10 mmol/L二硫代蘇糖醇（Sigma公司，美國(guó)），56℃還原反應(yīng)1 h；冷卻至室溫后，加入50 mmol/L碘乙酰胺（Sigma公司，美國(guó)），避光反應(yīng)45 min；再加入10%三氯乙酸（Sigma公司，美國(guó)），4℃沉淀2 h；然后用冷丙酮洗后離心得沉淀顆粒，溶于100 mmol/L NH4HCO3中，超聲5 min；按酶與蛋白質(zhì)量比1∶50加入胰蛋白酶，37℃反應(yīng)12 h。酶解后的肽段除鹽后真空干燥。

1.4 液質(zhì)鑒定與差異蛋白相對(duì)定量分析

真空干燥后的肽段用含0.1%甲酸的水溶液復(fù)溶至0.5 μg/μL，每組分上樣4 μL（約2 μg蛋白）。采用納升級(jí)EASY-nLC 1000液相和Q-Exactive高分辨率質(zhì)譜聯(lián)用系統(tǒng)（Thermo Fisher公司，美國(guó)）的液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜（liquid chromatography-tandem mass spectrometry,LC-MS/MS）法對(duì)各個(gè)時(shí)期的樣品肽段進(jìn)行鑒定。流動(dòng)相A液：含0.1%甲酸的水溶液；B液：含0.1%甲酸的乙腈。線性洗脫梯度（B液）：1%～40%，120 min；40%～65%，5 min；65%，保持5 min；65%～1%，1 min；1%，20 min平衡。流速為200 nL/min。Q-Exactive質(zhì)譜掃描范圍為350～1 800（m/z），每個(gè)一級(jí)譜圖自動(dòng)選擇3個(gè)最強(qiáng)母離子進(jìn)行二級(jí)掃描。每個(gè)時(shí)期進(jìn)行3次生物學(xué)重復(fù)。

鑒于秀珍菇為非模式生物，基因組序列未完全可知，所以利用分類學(xué)上級(jí)近緣物種傘菌目（Agaricales）數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行同源搜庫(kù)比對(duì)。搜庫(kù)鑒定軟件為Proteome Discoverer 1.4（Thermo Fisher公司，美國(guó)），并借助Sieve 2.2軟件（Thermo Fisher公司，美國(guó)）對(duì)差異表達(dá)的蛋白譜峰強(qiáng)度加以對(duì)比，進(jìn)行非標(biāo)記相對(duì)定量（p＜0.05）。

1.5 生物信息學(xué)分析

利用Uniprot蛋白數(shù)據(jù)庫(kù)（http://www.ebi.uniprot.org）對(duì)所鑒定到的蛋白質(zhì)進(jìn)行基因本體（gene ontology,GO）注釋，依據(jù)蛋白質(zhì)參與的生物學(xué)過(guò)程、細(xì)胞學(xué)組分和分子功能屬性，以S1期為對(duì)照，對(duì)秀珍菇不同生長(zhǎng)發(fā)育時(shí)期出現(xiàn)的差異蛋白分別進(jìn)行GO分析。利用KEGG網(wǎng)絡(luò)信號(hào)數(shù)據(jù)庫(kù)（http://www.genome.jp/kegg/pathway.html）對(duì)鑒定到的差異蛋白進(jìn)行匹配，挖掘秀珍菇在發(fā)育過(guò)程中由差異蛋白表達(dá)變化導(dǎo)致發(fā)生改變的重要代謝信號(hào)通路（p＜0.05）。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同生長(zhǎng)發(fā)育階段秀珍菇的形態(tài)學(xué)觀察

秀珍菇菌絲生長(zhǎng)期（S1）培養(yǎng)條件為（26±2）℃，避光；待菌絲發(fā)滿菌袋并后熟培養(yǎng)50 d，再將菌包在5℃下放置12 h，然后移入溫度為（30±2）℃的菇棚，1～2 d后形成原基（S2）；經(jīng)16～20 h進(jìn)入珊瑚期（S3）；再經(jīng)6～8 h即為秀珍菇子實(shí)體成熟期（S4）。取S1、S2、S3和S4期（圖1）生長(zhǎng)發(fā)育狀態(tài)良好的樣品用作后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

圖1 秀珍菇4個(gè)生長(zhǎng)發(fā)育階段的形態(tài)特征Fig.1 Morphological characteristics of four different growth phases of Pleurotus pulmonarius

2.2 秀珍菇不同生長(zhǎng)發(fā)育階段蛋白質(zhì)組變化

對(duì)秀珍菇4個(gè)生長(zhǎng)發(fā)育階段的蛋白數(shù)進(jìn)行鑒定。結(jié)果（圖2）顯示：不同生物學(xué)重復(fù)間具有很好的重復(fù)性；根據(jù)每個(gè)階段3次重復(fù)實(shí)驗(yàn)中至少2次鑒定到同一蛋白的原則，總共同源鑒定到秀珍菇菌絲生長(zhǎng)期、原基形成期、珊瑚期和子實(shí)體成熟期的蛋白數(shù)分別為962、1 165、1 338和1 434個(gè)。

通過(guò)Uniprot蛋白注釋和Sieve 2.2軟件對(duì)差異表達(dá)的蛋白譜峰強(qiáng)度進(jìn)行對(duì)比和非標(biāo)記相對(duì)定量。結(jié)果（表1）顯示，以S1為對(duì)照，在S2、S3和S4中鑒定到的差異表達(dá)蛋白分別為376、642和692個(gè)，分別占鑒定到的蛋白總數(shù)的22.1%、37.8%和40.8%。除去重復(fù)蛋白數(shù)，共有885個(gè)蛋白與S1相比至少在1個(gè)階段的差異表達(dá)倍數(shù)達(dá)到1.5倍以上（p＜0.05），其中上調(diào)表達(dá)的蛋白742個(gè)，下調(diào)表達(dá)的蛋白143個(gè)；差異表達(dá)倍數(shù)達(dá)3倍以上（p＜0.01）且在3次重復(fù)實(shí)驗(yàn)中（圖2）都被鑒定到的高可信蛋白有46個(gè)（附表1，http://www.zjujournals.com/agr/EN/article/showSupportInfo.do?id=10508）。

圖2 秀珍菇4個(gè)生長(zhǎng)發(fā)育階段3次重復(fù)實(shí)驗(yàn)鑒定到的蛋白數(shù)Fig.2 Number of proteins identified from four different phases of P.pulmonarius with three biological replicates

表1 4個(gè)生長(zhǎng)發(fā)育階段鑒定到的總蛋白及差異蛋白數(shù)Table 1 Number of total identified proteins and differential proteins in four different phases

從圖3A中可以看出：有789個(gè)蛋白在4個(gè)生長(zhǎng)發(fā)育階段中均被鑒定到，而只在1個(gè)階段中出現(xiàn)的特異表達(dá)蛋白共351個(gè)，對(duì)應(yīng)到各階段分別有11、23、136和181個(gè)（圖3A，表2）；其中涉及生殖發(fā)育和糖類合成的特異表達(dá)蛋白數(shù)量分別占總特異表達(dá)蛋白的23.9%和21.9%。由圖3B可知，大部分蛋白等電點(diǎn)（pI）為4～12，分子質(zhì)量聚集在10～100 kDa之間。

2.3 差異蛋白GO注釋功能分析

對(duì)885個(gè)變化1.5倍以上的差異表達(dá)蛋白進(jìn)行GO功能注釋發(fā)現(xiàn)，在差異表達(dá)蛋白參與的相關(guān)生物學(xué)過(guò)程中，分別有26%、20%、15%和11%的蛋白與糖類合成、生殖結(jié)構(gòu)發(fā)育、器官合成和蛋白大分子代謝相關(guān)（圖4A）。經(jīng)細(xì)胞組分分析發(fā)現(xiàn)，差異表達(dá)蛋白主要富集在線粒體（29%）、細(xì)胞核（15%）和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)（13%）3大區(qū)域（圖4B）。由于大量蛋白質(zhì)的合成變化往往需要核蛋白復(fù)合物、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)和線粒體的協(xié)同作用，因此推測(cè)這很可能與秀珍菇原基分化形成子實(shí)體過(guò)程中大量蛋白質(zhì)合成變化相關(guān)。同時(shí)，對(duì)差異表達(dá)蛋白的分子功能聚類發(fā)現(xiàn)，21%的蛋白具有轉(zhuǎn)移酶活性，15%的蛋白具有水解酶活性（圖4C）。

圖3 秀珍菇4個(gè)生長(zhǎng)發(fā)育階段蛋白質(zhì)組鑒定概況Fig.3 Preliminary proteomic analysis of four different phases of P.pulmonarius

表2 4個(gè)生長(zhǎng)發(fā)育階段鑒定到的特異表達(dá)蛋白數(shù)及功能分類Table 2 Number of specifically expressed proteins and function class in four different phases

2.4 秀珍菇不同生長(zhǎng)發(fā)育階段的差異表達(dá)蛋白參與的代謝通路

885個(gè)變化1.5倍以上的差異表達(dá)蛋白不但廣泛參與了眾多的生物學(xué)過(guò)程，而且還行使著諸多不同的分子生物學(xué)功能。KEGG注釋結(jié)果表明，差異表達(dá)蛋白主要參與了三羧酸循環(huán)（圖5）和糖酵解/糖異生途徑（圖6）2條代謝通路?？梢?，這些通路的改變可能對(duì)秀珍菇的生長(zhǎng)發(fā)育過(guò)程起著重要作用。

3 討論

圖4 秀珍菇885個(gè)差異表達(dá)蛋白GO功能注釋情況Fig.4 GO analysis of 885 differentially expressed proteins of P.pulmonarius

圖5 秀珍菇發(fā)育過(guò)程中差異表達(dá)蛋白參與的三羧酸循環(huán)Fig.5 Differentially expressed proteins of P.pulmonarius involved in the tricarboxylic acid(TCA)cycle

圖6 秀珍菇發(fā)育過(guò)程中差異蛋白參與的糖酵解/糖異生途徑Fig.6 Differentially expressed proteins of P.pulmonarius involved in the glycolysis/gluconeogenesis pathway

生物體在不同生長(zhǎng)發(fā)育階段的蛋白質(zhì)組會(huì)發(fā)生變化，這些不同的蛋白質(zhì)組是構(gòu)成生物體某一時(shí)刻特征性生命活動(dòng)的基礎(chǔ)，是認(rèn)識(shí)生物體生命活動(dòng)本質(zhì)的直接途徑[9]。蛋白質(zhì)組學(xué)研究旨在建立不同時(shí)間與空間的生物組織細(xì)胞所有表達(dá)蛋白質(zhì)的動(dòng)態(tài)表達(dá)譜，不僅能為生命活動(dòng)規(guī)律提供物質(zhì)基礎(chǔ)，也能為生物體遺傳育種提供理論根據(jù)和解決途徑。通過(guò)對(duì)不同生長(zhǎng)發(fā)育階段食用菌蛋白質(zhì)組進(jìn)行比較分析，我們可以找到某些“特定生長(zhǎng)發(fā)育階段特異性蛋白質(zhì)分子”，它們可成為遺傳育種的靶向效應(yīng)蛋白，有利于揭示內(nèi)外環(huán)境對(duì)生物機(jī)體生長(zhǎng)發(fā)育的影響機(jī)制，在食用菌乃至作物的遺傳育種中都具有重要意義。因此，我們運(yùn)用蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)對(duì)秀珍菇生長(zhǎng)發(fā)育過(guò)程中動(dòng)態(tài)變化的蛋白質(zhì)進(jìn)行了研究。

本研究對(duì)秀珍菇商業(yè)菌株“臺(tái)秀5766”的4個(gè)生長(zhǎng)發(fā)育階段，即菌絲生長(zhǎng)期、原基形成期、珊瑚期和子實(shí)體成熟期的樣品肽段進(jìn)行了LC-MS/MS分析，共鑒定到885個(gè)具有相對(duì)定量信息的差異蛋白，這些差異蛋白的功能主要涉及糖類合成、生殖結(jié)構(gòu)發(fā)育、器官合成和蛋白大分子代謝等。本研究還發(fā)現(xiàn)，秀珍菇4個(gè)生長(zhǎng)發(fā)育階段的特異表達(dá)蛋白數(shù)隨著發(fā)育進(jìn)程而增加，且29.3%的特異表達(dá)蛋白與生殖發(fā)育相關(guān)。這說(shuō)明這些特異表達(dá)蛋白很可能參與了秀珍菇子實(shí)體生殖器官的形態(tài)建成，但其具體生理功能還有待進(jìn)一步研究。KEGG分析發(fā)現(xiàn)，參與三羧酸循環(huán)和糖酵解/糖異生途徑這2個(gè)不同代謝通路的差異蛋白顯著富集，提示這些差異蛋白引發(fā)的這2條代謝通路的改變可能對(duì)秀珍菇的生長(zhǎng)發(fā)育過(guò)程起著重要作用。

本研究還鑒定到在4個(gè)生長(zhǎng)發(fā)育階段中差異表達(dá)的46個(gè)高可信蛋白。通過(guò)Uniprot蛋白注釋發(fā)現(xiàn)，近17%的蛋白參與了胞內(nèi)應(yīng)激修復(fù)過(guò)程，包括熱休克蛋白70（heat shock protein 70），細(xì)胞分裂控制蛋白 3（cell division control protein 3），septin基因家族4（spn4）等。其中熱休克蛋白70由應(yīng)激誘導(dǎo)產(chǎn)生，參與胞內(nèi)應(yīng)激修復(fù)，其主要生物學(xué)功能之一是作為分子伴侶，在胞內(nèi)幫助其他多肽進(jìn)行正確的折疊、組裝、運(yùn)轉(zhuǎn)和降解[10]，可能對(duì)秀珍菇子實(shí)體的正常發(fā)育起著重要作用。研究表明，植物中HSP70的表達(dá)受到多種非生物脅迫的誘導(dǎo)，如高溫[11]、低溫[12]、干旱[13]等，也與植物個(gè)體生長(zhǎng)發(fā)育相關(guān)[14-15]。過(guò)表達(dá)HSP70可提高植物對(duì)高溫的耐受性已得到研究證實(shí)[16]。本研究發(fā)現(xiàn)，HSP70在4個(gè)生長(zhǎng)發(fā)育階段的變化顯著，推測(cè)可能與秀珍菇不同生長(zhǎng)階段受溫度刺激有關(guān)。今后可深入研究HSP70基因家族成員的功能，為秀珍菇抗逆品種的選育提供參考。

本研究獲得了秀珍菇4個(gè)生長(zhǎng)發(fā)育階段的差異表達(dá)蛋白，以菌絲生長(zhǎng)期為對(duì)照，將其余3個(gè)生長(zhǎng)發(fā)育階段共885個(gè)差異表達(dá)蛋白與之進(jìn)行了初步比較研究。后續(xù)將進(jìn)一步對(duì)相鄰階段的差異表達(dá)蛋白進(jìn)行比較，以及對(duì)各階段特異表達(dá)的蛋白質(zhì)進(jìn)行篩選和功能驗(yàn)證，并結(jié)合秀珍菇對(duì)應(yīng)階段的轉(zhuǎn)錄組學(xué)測(cè)序分析，開展mRNA和蛋白質(zhì)在表達(dá)量和表達(dá)趨勢(shì)上的相關(guān)性研究。本研究初步探討了秀珍菇菌絲生長(zhǎng)、原基形成與分化、子實(shí)體成熟的分子機(jī)制，逐步解析了秀珍菇生長(zhǎng)發(fā)育過(guò)程中遺傳、生理生化等變化規(guī)律，對(duì)秀珍菇育種及栽培技術(shù)研究具有重要的指導(dǎo)意義。

4 結(jié)論

本研究分析了秀珍菇在生長(zhǎng)期、原基形成期、珊瑚期和子實(shí)體成熟期4個(gè)不同生長(zhǎng)發(fā)育階段蛋白質(zhì)組的表達(dá)變化，發(fā)現(xiàn)了不同生長(zhǎng)發(fā)育階段之間的差異信號(hào)響應(yīng)通路及差異表達(dá)蛋白，說(shuō)明這些差異表達(dá)蛋白在秀珍菇子實(shí)體形態(tài)建成及抵抗不良環(huán)境等方面起到了非常重要的作用。本研究結(jié)果也為解析秀珍菇生長(zhǎng)發(fā)育過(guò)程中遺傳、生理生化及生物學(xué)特性等方面的研究提供了參考。這有利于揭示內(nèi)外環(huán)境對(duì)秀珍菇機(jī)體生長(zhǎng)發(fā)育的影響，為進(jìn)一步深入研究秀珍菇機(jī)體生長(zhǎng)發(fā)育機(jī)制提供了支撐，也為后續(xù)秀珍菇育種及相關(guān)栽培技術(shù)研究奠定了理論基礎(chǔ)。

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WANG Weike1*,YUAN Weidong1,FANG Xianping2,SONG Jiling1,YAN Jing1,LU Na1
(1.Institute of Vegetables,Hangzhou Academy of Agricultural Sciences,Hangzhou 310024,China;2.Institute of Biology,Hangzhou Academy of Agricultural Sciences,Hangzhou 310024,China)

Pleurotus pulmonarius;growth period;proteomics

S 646；S 353；Q 51

A

10.3785/j.issn.1008-9209.2016.12.191

Summary It is important to investigate the mechanism of growth and development of edible fungi for genetic breeding and cultivation technique research.Based on the total expressed proteins of biological tissues and cells,a protein expression profile can be established by using proteomics technology,which can not only provide a material basis for the law of life,but also provide a theoretical basis and solution for biological genetic breeding.

In this study,in order to analyze the protein expression changes at different developmental phases and explore the law of growth and development of Pleurotus pulmonarius,we applied an integrated proteomic approach to comprehensively investigate the proteome change of P.pulmonarius at different developmental phases,including mycelium phase,primordium phase,coral-like phase,and fruit body phase,by using high-sensitive-mass spectrometer.

The results showed that,compared with the initial mycelium growth phase,a total of 885 differentially expressed proteins were isolated from the other three growth phases,with 376,642 and 692 differentially expressed proteins from the primordium phase,coral-like phase and fruit body phase,respectively.The specifically expressed proteins were 11,23,136 and 181 respectively in the four different developmental phases.Gene ontology annotation showed that 26%,20%,15%and 11%of the differentially expressed proteins were related with carbohydrate synthesis,reproductive structuredevelopment,organ synthesis and protein metabolism.Moreover,the analysis of metabolic pathway showed that the differentially expressed proteins mainly involved in the pathway of tricarboxylic acid cycle and glycolysis/gluconeogenesis which may possibly play an important role in the growth and development of P.pulmonarius.The heat shock protein 70(HSP70),belonging to a molecular chaperone,showed significant differences in mycelium phase,primordium phase,corallike phase,and fruit body phase,indicating that it is critical to regulate the growth of P.pulmonarius.

浙江省農(nóng)業(yè)（食用菌）新品種選育重大科技專項(xiàng)（2016C02057）；杭州市科技發(fā)展計(jì)劃項(xiàng)目（20150932H06）。

王偉科（http://orcid.org/0000-0002-2228-6519），E-mail:akeok@126.com

（

）:2016-12-19；接受日期（Accepted）:2017-03-13

In conclusion,there are differentially expressed proteins and differential signaling pathways at different developmental phases of P.pulmonarius.These differentially expressed proteins play a very important role in the organic development,fruiting body morphogenesis and resistance to adverse environmental conditions.This study lays a theoretical basis for the research of breeding and cultivation techniques of P.pulmonarius.