高烏頭藥材常規(guī)項(xiàng)檢查及高烏甲素、冉烏頭堿含量測(cè)定

張立軍 戴海蓉 樊秦 夏鵬飛 沈秉學(xué) 李蕓

摘要：目的 對(duì)高烏頭藥材進(jìn)行常規(guī)項(xiàng)檢查并測(cè)定高烏甲素、冉烏頭堿含量，為建立高烏頭藥材質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)提供參考。方法 采集不同產(chǎn)地高烏頭藥材，采用薄層色譜法進(jìn)行定性鑒別，按藥典水分測(cè)定法（烘干法）、灰分測(cè)定法、浸出物測(cè)定法測(cè)定水分、灰分和浸出物，采用HPLC測(cè)定高烏甲素和冉烏頭堿含量。結(jié)果 薄層色譜斑點(diǎn)清晰，分離度好；暫定高烏頭藥材中水分、總灰分及酸不溶性灰分分別不得過11.0%、12.0%、7.0%，水溶性浸出物和醇溶性浸出物分別不少于18.2%、10.6%；高烏頭藥材中冉烏頭堿和高烏甲素含量分別不少于0.125%、0.815%。結(jié)論 本研究所建立的方法準(zhǔn)確可靠，可用于高烏頭藥材質(zhì)量評(píng)價(jià)。

關(guān)鍵詞：高烏頭；常規(guī)檢查；高效液相色譜法；高烏甲素；冉烏頭堿

DOI：10.3969/j.issn.1005-5304.2017.11.015

中圖分類號(hào)：R284.1 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A 文章編號(hào)：1005-5304（2017）11-0063-04

Routine Examination of Aconitum sinomontanum Nakai and Content Determination of Lappacontine and Ranaconitine ZHANG Li-jun1， DAI Hai-rong1， FAN Qin2， XIA Peng-fei2， SHEN Bing-xue1， LI Yun1 （1. Gansu University of Chinese Medicine， Lanzhou 730000， China； 2. Key Laboratory of Chemistry and Quality for Traditional Chinese （Tibetan） Medicines of Colleges of Gansu Province， Lanzhou 730000， China）

Abstract： Objective To study the routine examination of Aconitum sinomontanum Nakai and determine the contents of lappacontine and ranaconitine； To provide basis for establishing the quality standard of Aconitum sinomontanum Nakai. Methods Aconitum sinomontanum Nakai were collected from different areas. A method of TLC was used for qualitative discrimination. The methods in the Chinese Pharmacopoeia were adopted for the determination of moisture content， ash content and extractives. Determination of lappacontine and ranaconitine were performed by HPLC. Results The TLC showed that the spots were clear and the separation was good. Individual provisional standards： the moisture， total ash and acid-insoluble ash content of Aconitum sinomontanum Nakai were not more than 11.0%， 12.0%， and 7.0%， respectively； water soluble and alcohol soluble extractives were not less than 18.2% and 10.6%， respectively. The content of ranaconitine and lappacontine in Aconitum sinomontanum Nakai were not less than 0.125% and 0.815%， respectively. Conclusion The method established by the study is accurate and reliable， and can be used for quality evaluation of Aconitum sinomontanum Nakai.

Key words： Aconitum sinomontanum Nakai； routine examination； HPLC； lappacontine； ranaconitine

高烏頭為毛茛科烏頭屬植物高烏頭Aconitum sinomontanum Nakai的根，又名麻布七、辮子七、破骨七等，是我國(guó)甘肅等中西部地區(qū)民間習(xí)用中藥，也是著名“七藥”之一[1]，具有祛風(fēng)除濕、理氣止痛、活血散瘀的功效，用于治療風(fēng)濕痹痛、關(guān)節(jié)腫痛、跌打勞傷等?，F(xiàn)代藥理研究表明，高烏頭具有鎮(zhèn)痛、抗炎、解熱、局部麻醉、抗心律失常、抗氧化、殺蟲等廣泛的藥理作用[2-4]，臨床上常用于治療類風(fēng)濕關(guān)節(jié)

基金項(xiàng)目：國(guó)家自然科學(xué)基金（81560650）；甘肅省自然科學(xué)基金（1107RJZA242）

通訊作者：李蕓，E-mail：liyunherb@163.com

炎及局部鎮(zhèn)痛[5-6]。高烏頭的主要活性成分為二萜生物堿[7]，其中以高烏甲素和冉烏頭堿的含量最高[8]，而活性成分之一高烏甲素已開發(fā)出不同劑型并應(yīng)用于臨床[9]。

高烏頭為我國(guó)特有植物，在北方地區(qū)有著豐富的資源分布，目前甘肅地區(qū)引種馴化成功、大量生產(chǎn)和應(yīng)用，現(xiàn)已成為甘肅地產(chǎn)大宗商品藥材。高烏頭收載于《甘肅省中藥材標(biāo)準(zhǔn)》（2009年版）[10]，現(xiàn)有的標(biāo)準(zhǔn)尚不完善，既無(wú)常規(guī)項(xiàng)檢查，也無(wú)含量測(cè)定項(xiàng)。為此，本試驗(yàn)采用常規(guī)項(xiàng)檢查及高烏甲素、冉烏頭堿含量對(duì)其進(jìn)行質(zhì)量評(píng)價(jià)，以保證臨床用藥安全有效，并為高烏頭藥材質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)的制訂和完善提供參考。

1 儀器與試藥

BT125D電子天平（賽多利斯科學(xué)儀器有限公司）；KQ3200DB超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司）；FW-400A高建萬(wàn)能粉碎機(jī)（北京科偉永興儀器有限公司）；DHG-9240A型電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱（上海一恒科技有限公司）；RJX-4-9型號(hào)箱形電阻爐（天津?qū)嶒?yàn)電爐廠）；HHS-11S數(shù)顯恒溫水浴鍋（上海宜昌儀器紗篩廠）；Agilent 1100 Series型高效液相色譜儀，DAD檢測(cè)器（美國(guó)Agilent科技有限公司）；SHB-3循環(huán)水多用真空泵（鄭州杜甫儀器廠）；PHS-430型pH計(jì)（方舟電子科技有限責(zé)任公司）；旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀、稱量瓶、干燥器、無(wú)灰濾紙等。

高烏甲素對(duì)照品（甘肅神龍藥業(yè)股份有限公司，批號(hào)20001001，HPLC純度≥97.50%），冉烏頭堿對(duì)照品（成都克洛瑪生物科技有限公司，批號(hào)150404，HPLC純度≥98.00%）；甲醇、三乙胺均為色譜純，三氯甲烷、氨水、正己烷、異丙醇、乙酸乙酯、95%乙醇為分析純。

高烏頭藥材分別購(gòu)于甘肅、青海等地，經(jīng)甘肅中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院楊扶德教授鑒定為毛茛科烏頭屬植物高烏頭Aconitum sinomontanum Nakai的干燥根，樣品信息見表1。

2 方法與結(jié)果

2.1 薄層鑒別

取高烏頭藥材粉末2 g（過4號(hào)篩），精密稱定，置具塞錐形瓶中，加氨試液3 mL，再加入異丙醇-乙酸乙酯（1∶1）混合溶液50 mL，稱定質(zhì)量，超聲處理（功率300 W，頻率40 kHz，水溫25 ℃以下）30 min，放冷，補(bǔ)足減失的質(zhì)量，搖勻，過濾，取續(xù)濾液25 mL，40 ℃以下減壓回收溶劑至干，殘?jiān)尤爰状? mL，溶解，密塞，搖勻，作為供試品溶液。另取冉烏頭堿、高烏甲素對(duì)照品，分別加甲醇溶解，制成每1 mL含1 mg的溶液，作為對(duì)照品溶液。按照薄層色譜法試驗(yàn)，分別吸取冉烏頭堿、高烏甲素對(duì)照品、供試品溶液各5 ?L，點(diǎn)于同一硅膠GF254薄層板上，以正己烷-三氯甲烷-乙酸乙酯-甲醇（5∶6∶8∶1.5）為展開劑，置氨蒸氣飽和20 min后展開，取出，晾干，分別置紫外光燈（254、365 nm）下檢視（溫度18～30 ℃，濕度45%～60%）。結(jié)果供試品色譜中，在與對(duì)照品相應(yīng)的位置上，顯相同顏色的斑點(diǎn)。

2.2 檢查

2.2.1 水分測(cè)定 取高烏頭藥材粉末4 g（過4號(hào)篩），平行3份，精密稱定，按照2015年版《中華人民共和國(guó)藥典》四部通則0832水分測(cè)定項(xiàng)下第二法（烘干法）進(jìn)行測(cè)定。

2.2.2 總灰分測(cè)定 取高烏頭藥材粉末4 g（過4號(hào)篩），平行3份，置熾灼至恒重的坩堝中，稱定質(zhì)量，按照2015年版《中華人民共和國(guó)藥典》四部通則2302總灰分測(cè)定項(xiàng)下方法測(cè)定。如果供試品不易灰化，可將坩堝放冷，加熱水或10%硝酸鐵溶液2 mL，使殘?jiān)鼭駶?rùn)，然后置水浴上蒸干，殘?jiān)^續(xù)熾灼，至坩堝內(nèi)容物完全灰化。

2.2.3 酸不溶性灰分測(cè)定 取“2.2.2”項(xiàng)下所得的灰分，按2015年版《中華人民共和國(guó)藥典》四部通則2302總灰分測(cè)定項(xiàng)下酸不溶性灰分測(cè)定法測(cè)定。

2.2.4 浸出物測(cè)定

2.2.4.1 水溶性浸出物 取高烏頭藥材粉末4 g（過4號(hào)篩），平行3份，精密稱定，按照2015年版《中華人民共和國(guó)藥典》四部通則2201水溶性浸出物測(cè)定項(xiàng)下熱浸法進(jìn)行測(cè)定。

2.2.4.2 醇溶性浸出物 取高烏頭藥材粉末4 g（過4號(hào)篩），平行3份，精密稱定。分別用45%、55%、65%、75%、85%、95%乙醇作為溶劑，按照2015年版《中華人民共和國(guó)藥典》四部通則2201醇溶性浸出物測(cè)定項(xiàng)下熱浸法進(jìn)行測(cè)定，計(jì)算得醇溶性浸出物含量分別為33.9%、28.9%、24.1%、19.5%、17.4%、12.5%。可見，隨著乙醇濃度的降低，醇溶性浸出物較多，但同時(shí)溶出的雜質(zhì)也多；95%乙醇浸出物較少，不能完全提取出高烏頭中的各類成分。綜合以上因素，選用稀乙醇（47.5%）作溶劑測(cè)定樣品中的醇溶性浸出物，一方面能夠溶出高烏頭中各類主要成分，另一方面便于用市售的95%乙醇配制成稀乙醇。

取高烏頭粉末約4 g（過4號(hào)篩），平行3份，精密稱定，以稀乙醇作為溶劑，按上述操作方法進(jìn)行測(cè)定。

2.3 指標(biāo)成分含量測(cè)定

2.3.1 色譜條件 采用DIKMA Spursil C18色譜柱（4.6 mm×250 mm，5 ?m）；流動(dòng)相A為三乙胺水溶液（pH 9.3～9.6）、B為甲醇，梯度洗脫（0～30 min，5%～35%B，流速0.4 mL/min；30～70 min，30%～100%B，流速0.4 mL/min；70～80 min，100%B，流速0.4 mL/min；80～85 min，100%B，流速1.0 mL/min）；檢測(cè)波長(zhǎng)308 nm；柱溫35 ℃。

2.3.2 對(duì)照品溶液的制備 分別取冉烏頭堿、髙烏甲素對(duì)照品，精密稱定，加甲醇溶解并定容，制成冉烏頭堿和高烏甲素對(duì)照品溶液，再分別精密量取上述2種對(duì)照品溶液適量，配制混合對(duì)照品溶液（冉烏頭堿0.172 5 mg/mL，高烏甲素0.375 0 mg/mL）。在上述色譜條件下，冉烏頭堿與高烏甲素能夠很好地分離，色譜圖見圖1。

2.3.3 供試品溶液的制備 取高烏頭藥材粉末1 g（過4號(hào)篩），精密稱定，置于具塞錐形瓶中，加氨試液3 mL，再加入異丙醇-乙酸乙酯（1∶1）混合溶液50 mL，稱定質(zhì)量，超聲處理（頻率50 kHz，水溫25 ℃）30 min，放冷，補(bǔ)足減失的質(zhì)量，搖勻，過濾，精密量取續(xù)濾液10 mL，40 ℃以下減壓回收溶劑，殘?jiān)蛹状既芙?，定容?5 mL，密塞，搖勻，進(jìn)樣前用0.45 ?m微孔膜過濾，作為供試品溶液。

2.3.4 線性關(guān)系考察 分別精密吸取混合對(duì)照品溶液0.5、1、2、4、6、8、10 ?L進(jìn)樣分析，測(cè)定峰面積，以峰面積對(duì)進(jìn)樣量進(jìn)行線性回歸。結(jié)果表明，高烏甲素在0.187 5～3.750 ?g范圍內(nèi)線性關(guān)系良好，回歸方程Y=1158.8X+2.128，r=0.999 9；冉烏頭堿在0.086 25～1.725 0 ?g范圍內(nèi)線性關(guān)系良好，回歸方程Y=1195.3X-2.035，r=0.999 8。

2.3.5 精密度試驗(yàn) 精密吸取對(duì)照品混合溶液20 ?L，按上述色譜條件進(jìn)樣分析，連續(xù)進(jìn)樣5次，結(jié)果冉烏頭堿、高烏甲素峰面積的RSD分別為0.76%、0.98%，表明儀器的精密度良好。

2.3.6 穩(wěn)定性試驗(yàn) 取同一供試品溶液，分別于0、3、6、9、12、24 h按上述色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，記錄冉烏頭堿、高烏甲素峰面積，結(jié)果峰面積的RSD分別為2.36%、1.51%，表明24 h內(nèi)樣品的穩(wěn)定性良好。

2.3.7 重復(fù)性試驗(yàn) 取同一批次樣品粉末，平行稱取5份，按供試品溶液的制備方法進(jìn)行制備，按上述色譜條件進(jìn)行測(cè)定，計(jì)算樣品中高烏甲素和冉烏頭堿的含量，結(jié)果高烏甲素和冉烏頭堿含量的RSD分別為2.51%、1.62%，表明本法有良好的重復(fù)性。

2.3.8 加樣回收率試驗(yàn) 取已知含量的高烏頭藥材粉末0.5 g（高烏甲素含量為1.240%，冉烏頭堿含量為0.239%），共5份，精密稱定，分別加入與其含有等量的高烏甲素和冉烏頭堿對(duì)照品，按供試品溶液制備方法制備，依法測(cè)定，計(jì)算高烏甲素和冉烏頭堿的平均回收率均分別為97.94%、101.73%，RSD分別為2.50%、3.15%，表明本方法回收率良好，結(jié)果見表2。

2.3.9 樣品含量測(cè)定 取5批次高烏頭藥材供試品溶液，分別精密吸取20 ?L注入液相色譜儀，記錄色譜圖，并按外標(biāo)法以峰面積計(jì)算樣品中高烏甲素、冉烏頭堿的含量，色譜圖見圖2。

2.4 檢查項(xiàng)及含量測(cè)定結(jié)果（見表3）

以統(tǒng)計(jì)學(xué)方法分析數(shù)據(jù)，設(shè)定高烏頭藥材水分、總灰分、酸不溶性灰分、水溶性浸出物、醇溶性浸出物、冉烏頭堿及高烏甲素的上下限，計(jì)算公式如下[11-12]：

上限μ= +（t×s）/√n+MU，下限μ= -（t×s）/√n-MU

式中，—x為樣本均數(shù)；t為置信水平為99%的t值（單側(cè)），t（0.01，4）=4.604；s為樣本標(biāo)準(zhǔn)偏差；n為樣本批數(shù)；MU是不確定度評(píng)估，水分MU=0.126 0—x，總灰分MU=0.052 0—x，酸不溶性灰分MU=0.070 2—x，水溶性浸出物MU=0.127 5—x，醇溶性浸出物MU=0.141 5—x，冉烏頭堿MU=0.223 5—x，高烏甲素MU=0.231 5—x。

水分：μ= +（t×s）/√n+MU=7.320+ （4.604×1.033）/√5+0.9221=10.369

總灰分：μ= +（t×s）/√n+MU=8.400+ （4.604×1.407）/√5+0.437=11.734

酸不溶性灰分：μ= +（t×s）/√n+MU=3.500+ （4.604×1.243）/√5+0.246=6.305

水溶性浸出物：μ= -（t×s）/√n-MU=32.760- （4.604×5.030）/√5-4.177=18.226

醇溶性浸出物：μ= -（t×s）/√n-MU=28.560- （4.604×6.755）/√5-4.041=10.611

冉烏頭堿：μ= -（t×s）/√n-MU=0.216- （4.604×0.021）/√5-0.048=0.125

高烏甲素：μ= -（t×s）/√n-MU=1.243- （4.604×0.068）/√5-0.288=0.815

可知，高烏頭藥材的水分、總灰分及酸不溶性灰分應(yīng)分別不得過11.0%、12.0%、7.0%，水溶性浸出物、醇溶性浸出物應(yīng)分別不少于18.2%、10.6%；按干燥品計(jì)算，高烏頭藥材中冉烏頭堿與高烏甲素的含量應(yīng)不少于0.125%、0.815%。

3 討論

高烏頭是一味民間常用中藥，一直以來(lái)，有關(guān)其質(zhì)量控制方面的研究鮮有文獻(xiàn)報(bào)道?，F(xiàn)有的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)指標(biāo)過于簡(jiǎn)單，不能很好地控制其質(zhì)量。本課題首次從常規(guī)檢查和定量分析角度對(duì)高烏頭進(jìn)行了質(zhì)量評(píng)價(jià)研究，為新版《甘肅省中藥材標(biāo)準(zhǔn)》中高烏頭藥材標(biāo)準(zhǔn)的完善提供依據(jù)。

薄層鑒別試驗(yàn)分別考察了正己烷、二甲苯、三氯甲烷、乙酸乙酯、甲醇等多種溶劑展開系統(tǒng)，曾用三氯甲烷-甲醇-氨水（7∶2∶0.50）、二甲苯-甲醇（5∶1）等，經(jīng)過多次試驗(yàn)和篩選，最終確定上述展開條件，結(jié)果表明該條件具有分離度好、斑點(diǎn)清晰、簡(jiǎn)便易行等特點(diǎn)，可用于高烏頭藥材的薄層鑒別分析。

本試驗(yàn)建立了HPLC同時(shí)測(cè)定高烏頭藥材中冉烏頭堿、高烏甲素的方法。該方法專屬性強(qiáng)、靈敏度高、重復(fù)性好，可用于評(píng)價(jià)高烏頭藥材的質(zhì)量。同時(shí)，試驗(yàn)采用藥典方法對(duì)不同批次高烏頭藥材中水分、總灰分、酸不溶性灰分、水溶性浸出物和醇溶性浸出物進(jìn)行測(cè)定，得出了較為準(zhǔn)確的數(shù)據(jù)，為建立藥材標(biāo)準(zhǔn)提供依據(jù)。

高烏頭在功效上與同科同屬的烏頭（川烏、草烏）作用相當(dāng)，但高烏頭不含極毒的雙酯型烏頭堿類成分，臨床應(yīng)用相對(duì)烏頭更加安全。烏頭可以引起動(dòng)物心律失常[13]，而高烏頭則具有抗烏頭堿心律失常的作用。高烏頭一直作為地方用藥，究其原因，一方面是其標(biāo)準(zhǔn)不夠完善，另一方面是產(chǎn)量較低、使用范圍小，未能引起重視。如果解決以上問題，高烏頭很有可能代替烏頭藥材，載入藥典標(biāo)準(zhǔn)。

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