陽(yáng)和湯的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)研究*

竇建衛(wèi) ，朱宇紅 ，王紅英 ，任翠翠 ，尚榮國(guó)，黃 芊

1.西安交通大學(xué)藥學(xué)院(西安 710061)，2.西安市第一醫(yī)院(西安 710004)，3.西安市中醫(yī)醫(yī)院(西安 710021)

·方藥縱橫·

陽(yáng)和湯的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)研究*

竇建衛(wèi)1，朱宇紅1，王紅英1，任翠翠2，尚榮國(guó)1，黃 芊3△

1.西安交通大學(xué)藥學(xué)院(西安 710061)，2.西安市第一醫(yī)院(西安 710004)，3.西安市中醫(yī)醫(yī)院(西安 710021)

目的：創(chuàng)建陽(yáng)和湯質(zhì)量控制的標(biāo)準(zhǔn)，從而更好服務(wù)于研究與臨床。方法：采用TLC對(duì)麻黃、肉桂鑒別與HPLC對(duì)陽(yáng)和湯所含成分毛蕊花糖苷進(jìn)行含量測(cè)定。結(jié)果：用TLC鑒別麻黃、肉桂具有較好的專(zhuān)屬性；毛蕊花糖苷在32.1～192.6 ng范圍內(nèi)，與峰面積呈良好的線性關(guān)系，相關(guān)系數(shù)r=0.9994，平均回收率99.7%，RSD等于0.75%。結(jié)論：本實(shí)驗(yàn)所創(chuàng)建的檢測(cè)方法方便有效，專(zhuān)屬性強(qiáng)，此標(biāo)準(zhǔn)能夠很好控制陽(yáng)和湯質(zhì)量。

陽(yáng)和湯是由肉桂、麻黃、熟地、姜碳等多味中藥經(jīng)一定工藝加工而成。是基于古法陽(yáng)和湯，逐步優(yōu)化創(chuàng)制而成的中藥復(fù)方制劑，具有溫陽(yáng)散寒、補(bǔ)血通滯之效。前期實(shí)驗(yàn)研究表明，陽(yáng)和湯對(duì)乳腺癌具有良好的控制作用，其主要是通過(guò)對(duì)細(xì)胞內(nèi)多種信號(hào)通路起到一定的抑制作用，且藥物安全性良好[1-3]。本課題得到國(guó)家自然科學(xué)基金的大力支持，為了對(duì)該復(fù)方制劑質(zhì)量進(jìn)行控制，該實(shí)驗(yàn)采用TLC和HPLC檢測(cè)其含量，內(nèi)容如下。

材料與方法

1 儀器 超聲波清洗機(jī)(型號(hào)：PS-40，生產(chǎn)廠家：深華泰超聲洗凈設(shè)備有限公司)；分析天平(型號(hào)：YP1201N，生產(chǎn)廠家：上海天平儀器廠)；0.1 mg微量分析天平(型號(hào)：FA1104，生產(chǎn)廠家：上海天平儀器廠)；0.01 mg微量分析天平(型號(hào)：AB135-S，生產(chǎn)廠家：梅特勒-托利多公司)等。

2 試藥 毛蕊花糖苷對(duì)照品(批號(hào)：111530-201512)；桂皮醛對(duì)照品(批號(hào)：121604-201502)；鹽酸麻黃堿對(duì)照品(批號(hào)：171241-201508)；供試品、陰性樣品均為自制；其他試劑均是分析純。

3 薄層色譜鑒別

3.1 麻黃：取一定量樣品(5 ml左右)，加入一定量氫氧化鈉溶液(使其為堿性)，加乙醚20 ml萃取分離(3次重復(fù))，每次用量10 ml，合并乙醚相，蒸干，收集殘?jiān)? ml甲醇溶解，即為供試品溶液[4]。同時(shí)，取適量鹽酸麻黃堿對(duì)照品，以甲醇為溶劑，用上法配制對(duì)照品溶液。按處方的構(gòu)成比，取缺麻黃的其它藥材，用上法制成陰性樣品溶液(不含麻黃)。依薄層色譜法(通則0502)[5]，分別取上述10 μL各溶液，點(diǎn)于硅膠G薄層板上，放入展開(kāi)劑片刻，拿出，晾干后，浸漬于茚三酮溶液中，取出晾干。展開(kāi)劑按照三氯甲烷-甲醇-濃氨試液體積比為20∶6∶0.5配制而成。結(jié)果顯示，供試品色譜與對(duì)照品色譜對(duì)照，在對(duì)應(yīng)的位置上，主斑點(diǎn)呈現(xiàn)相同顏色及形狀，且陰性對(duì)照顯示沒(méi)有干擾，因此將該法列入該制劑的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)。

3.2 肉桂：取一定量樣品(5 mL左右)，加10 mL乙醇，振蕩，靜置，醋酸乙酯萃取(重復(fù)3次)，收集乙醇相并旋蒸，收集殘?jiān)?，再? mL乙醇攪拌溶解，即供試品溶液[6]。同時(shí)將肉桂對(duì)照藥材，以乙醇為溶劑，按以上方法配制成對(duì)照品溶液。按處方的構(gòu)成比，取不含肉桂的其它藥材，用上法制成陰性樣品溶液(不含肉桂)。分別取5 μL上述溶液，點(diǎn)于硅膠G薄層板上，放入展開(kāi)劑片刻，拿出后，晾干，將二硝基苯肼乙醇噴于薄層板上105°C條件下加熱，斑點(diǎn)完全顯現(xiàn)時(shí)停止。展開(kāi)劑按照石油醚-醋酸乙酯體積比為18∶2配制。供試品色譜與對(duì)照品色譜對(duì)照，在對(duì)應(yīng)的位置上，主斑點(diǎn)呈現(xiàn)相同顏色及形狀，且陰性對(duì)照顯示沒(méi)有干擾，因此將該法列入該制劑的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)。

4 含量測(cè)定

4.1 色譜條件與系統(tǒng)適用性試驗(yàn)：十八烷基硅烷鍵合硅膠為色譜柱填充劑；流動(dòng)相為乙腈-0.1%醋酸溶液(18∶82)；檢測(cè)波長(zhǎng)334nm。理論板數(shù)按毛蕊花糖苷峰計(jì)算應(yīng)不小于5000。

4.2 對(duì)照品溶液、供試品溶液及陰性對(duì)照溶液的制備：取一定量毛蕊花糖苷，用甲醇為溶劑配成10μg/ml的溶液，即對(duì)照品溶液。供試品溶液：量取10 ml樣品于25 ml容量瓶中，加甲醇定容至刻度線，超聲處理1.5 h，稍冷，補(bǔ)加甲醇溶液至刻度線，混勻，過(guò)濾，收集續(xù)濾液，即得。陰性對(duì)照溶液：按前述制備方法，取除熟地外的陰性樣品適量，制備陰性對(duì)照溶液。

4.3 干擾性試驗(yàn)：取一定量對(duì)照品溶液(10 μl)，進(jìn)行檢測(cè)，得到色譜圖，陰性對(duì)照和供試品溶液重復(fù)以上操作。由結(jié)果可知，陰性樣品在毛蕊花糖苷對(duì)應(yīng)的位置上，沒(méi)有色譜峰被檢出，說(shuō)明該制劑中其余藥材毛蕊花糖苷的測(cè)定不會(huì)產(chǎn)生干擾。

4.4 線性考察：稱(chēng)取一定量毛蕊花糖苷對(duì)照品，用甲醇溶液作為溶劑，制備10.7μg/ml的溶液，精確吸取3、6、9、12、15、18μl進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，得到色譜圖，峰面積值，分析得到其回歸方程：y=1768.3×-627.3(r=0.9994)，在32.1～192.6 ng范圍內(nèi)，毛蕊花糖苷與色譜峰面積線性關(guān)系良好。

4.5 精密度試驗(yàn):取適量對(duì)照品溶液，進(jìn)行精密度實(shí)驗(yàn)(色譜條件與上述相同)，得到色譜圖及色譜峰面積，以毛蕊花糖苷峰面積(A)為指標(biāo)進(jìn)行考察，進(jìn)樣6次，得到RSD為0.95%，結(jié)果可知，該方法具有較好的精密度。

4.6 穩(wěn)定性試驗(yàn):從首次進(jìn)樣后，每2 h進(jìn)樣1次，共進(jìn)樣5次(10μl/次)，得到色譜圖及色譜峰面積，RSD為0.72%。由以上結(jié)果可知，在8 h內(nèi)，供試品溶液有較好的穩(wěn)定性。

4.7 重復(fù)性試驗(yàn):按上法，制備6樣份供試品溶液，按次序取10 μl進(jìn)行處理，得到色譜圖，計(jì)算復(fù)方制劑中目標(biāo)成分含量為0.102 mg/ml，RSD為1.33%。由以上結(jié)果可知，該法有較好的重復(fù)性。

4.8 加樣回收率試驗(yàn):取濃度已知的樣品(各1ml)，按順序加入容量瓶中，同時(shí)加以上毛蕊花糖苷對(duì)照品(0.105 mg/ml)溶液適量，依上法制備、分析、得到色譜圖，對(duì)復(fù)方制劑中毛蕊花糖苷含量及回收率進(jìn)行計(jì)算，見(jiàn)表1。

表1 樣品的回收率試驗(yàn)結(jié)果

4.9 樣品的含量測(cè)定:按以上方法對(duì)3批陽(yáng)和湯進(jìn)行含量測(cè)定，毛蕊花糖苷平均含量為0.102 mg/ml。

討 論

陽(yáng)和湯作為臨床常用中藥復(fù)方制劑，由熟地、麻黃、肉桂、白芥子等組成。其中熟地為滋養(yǎng)之品，滋陰補(bǔ)腎，養(yǎng)血調(diào)肝；麻黃、肉桂、炮姜炭、白芥子乃溫陽(yáng)之藥，具有驅(qū)散寒邪，腠理開(kāi)，寒凝解，氣血?jiǎng)t行，毒跡隨消。肉桂、炮姜炭入血分，溫經(jīng)散結(jié)而解寒凝；麻黃辛溫，得熟地而通絡(luò)；白芥子通陽(yáng)散寒而消痰結(jié)，祛內(nèi)外之痰。諸藥配伍，針對(duì)陽(yáng)氣虧虛之本，寒凝痰滯之標(biāo)，溫陽(yáng)共補(bǔ)陰合用，滋膩和辛散相伍，溫且不燥、補(bǔ)而不膩。寒邪易客于肌肉、筋骨，凝則為痰，凝痰阻礙氣血運(yùn)行，日久為瘀血，寒痰瘀聚于乳，則為“乳巖”，本方溫陽(yáng)以化寒痰、解凝聚，血得熱則行，寒痰得溫而消，故能消痰凝腫塊。

在體外實(shí)驗(yàn)研究方面，陽(yáng)和湯可明顯抑制MDA-MB-231細(xì)胞的增殖，下調(diào)NF-κB、減少I(mǎi)L-8的分泌，從而有效阻止乳腺癌的發(fā)生、發(fā)展[2]；在體內(nèi)實(shí)驗(yàn)研究方面，陽(yáng)和湯通過(guò)降低裸鼠血清中IL-6、移植瘤組織中MMP-9、CD90的表達(dá)，從而表明其可抑制乳腺癌的發(fā)生、發(fā)展[1,3]。因此，為保證陽(yáng)和湯復(fù)方制劑的質(zhì)量，我們創(chuàng)建陽(yáng)和湯復(fù)方制劑的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)，此實(shí)驗(yàn)通過(guò)測(cè)定制劑中毛蕊花糖苷成分的含量，建立了該制劑質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)。此外，我們對(duì)該制劑中的肉桂、麻黃進(jìn)行了TLC鑒別，在相應(yīng)展開(kāi)劑中，供試品能夠特征性地檢測(cè)出該制劑中肉桂、麻黃。鑒于以上實(shí)驗(yàn)結(jié)果，將上法列入該制劑的標(biāo)準(zhǔn)，為更好的掌控陽(yáng)和湯復(fù)方制劑的質(zhì)量提供了標(biāo)準(zhǔn)。

[1] 竇建衛(wèi), 任翠翠, 郝 云, 等. 陽(yáng)和湯對(duì)裸鼠荷人乳腺癌組織中CD90表達(dá)的影響及其抑瘤作用[J]. 世界中醫(yī)藥, 2015, 10(3): 391-393，398.

[2] 竇建衛(wèi), 黃 芊, 趙天一, 等. 陽(yáng)和湯對(duì)乳腺癌MDA-MB-231細(xì)胞NF-κB、IL-8表達(dá)的影響[J]. 四川中醫(yī), 2017, 35 (2): 44-47.

[3] 竇建衛(wèi), 黃 芊,趙天一, 等. 陽(yáng)和湯對(duì)三陰性乳腺癌裸鼠移植瘤生長(zhǎng)及IL-6、MMP-9表達(dá)的影響[J]. 中國(guó)現(xiàn)代醫(yī)藥雜志, 2016, 18(12): 1-4.

[4] 毛 丹,許 勇,陸繼偉, 等. 復(fù)方桔梗麻黃堿糖漿質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)研究[J]. 中成藥,2012, 34(8): 1518-1522.

[5] 國(guó)家藥典委員會(huì). 中國(guó)藥典[M]. 第四部. 北京: 中國(guó)醫(yī)藥科技出版社, 2015: 57-59．

[6] 王 卓, 韓 璐, 王 燕. 前列痊膠囊質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)中大青葉、肉桂TLC鑒別的研究[J]. 中國(guó)醫(yī)藥指南, 2015, 13(33): 39-40.

*國(guó)家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(81573983) 陜西省社會(huì)發(fā)展科技攻關(guān)項(xiàng)目(2015SF082)

△通訊作者

陽(yáng)和湯 毛蕊花屬 色譜法, 高壓液相 色譜法, 薄層

R284

A

10.3969/j.issn.1000-7369.2017.11.054

(收稿：2017-06-17)