弓形蟲膠體金免疫層析試紙條的研制

王釗哲，許 瑞，洪 煬，林矯矯,2，陸 珂，李 浩，陳兆國，唐亞蘭，吳思敏，江嘉欣，李嘉靜，朱傳剛

（1.中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院上海獸醫(yī)研究所 農(nóng)業(yè)部寄生蟲學(xué)重點開放實驗室 國家防治動物血吸蟲病專業(yè)實驗室，上海200241；2.江蘇高校動物重要疫病與人獸共患病防控協(xié)同創(chuàng)新中心，揚州 225009）

弓形蟲膠體金免疫層析試紙條的研制

王釗哲1，許 瑞1，洪 煬1，林矯矯1,2，陸 珂1，李 浩1，陳兆國1，唐亞蘭1，吳思敏1，江嘉欣1，李嘉靜1，朱傳剛1

（1.中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院上海獸醫(yī)研究所 農(nóng)業(yè)部寄生蟲學(xué)重點開放實驗室 國家防治動物血吸蟲病專業(yè)實驗室，上海200241；2.江蘇高校動物重要疫病與人獸共患病防控協(xié)同創(chuàng)新中心，揚州 225009）

為了研制一種可用于檢測弓形蟲的快速診斷膠體金免疫層析試紙條，本研究對弓形蟲表面抗原（surface antigen，SAG）SAG1和SAG2的基因片段進(jìn)行重構(gòu)合成，與PET-28a(+)載體連接后，轉(zhuǎn)化至大腸桿菌BL21(DE3)中表達(dá)，利用His親和層析柱對融合蛋白進(jìn)行純化，獲得SAG重組表位抗原，Western blot對重組蛋白免疫原性進(jìn)行分析。用rSAG重組蛋白及rSPG分別劃線，作為檢測線和質(zhì)控線，制作膠體金免疫層析試紙條，利用小鼠弓形蟲陽性血清及小鼠陰性血清檢驗?zāi)z體金免疫層析試紙條檢查效果。本研究成功表達(dá)純化了SAG抗原表位的重組蛋白，且該重組蛋白具有較好的免疫原性。以此多抗原表位的重組蛋白作為檢查抗原研制了膠體金免疫層析試紙條，能夠快速檢測弓形蟲的陽性血清，為基層弓形蟲病的快速診斷奠定了基礎(chǔ)。

膠體金免疫層析試紙條；重組蛋白；弓形蟲

弓形蟲（Toxoplasma gondii）是一種分布廣泛的專性細(xì)胞內(nèi)寄生蟲[1]，在感染人或動物后可通過胎盤方式垂直傳播，造成胎兒畸形，早產(chǎn)，神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育障礙；也可經(jīng)口傳播，如飲用未經(jīng)滅菌的奶制品，或使用未熟的肉類。弓形蟲對宿主選擇性不強(qiáng)，可寄生在多種動物的有核細(xì)胞中，并侵害多種組織器官。其中羊是較易感動物，感染弓形蟲后表現(xiàn)出流產(chǎn)、產(chǎn)死胎和弱畜。因此，弓形蟲給人類和養(yǎng)殖業(yè)都造成了嚴(yán)重威脅。

為了尋找敏感、特異、快速的診斷方法，國內(nèi)外學(xué)者在弓形蟲病診斷方面進(jìn)行了大量研究。目前，常見的弓形蟲病診斷方法有病原學(xué)方法、分子生物學(xué)方法、免疫學(xué)方法等[2]，但多出現(xiàn)檢出率不高、操作繁雜、靈敏度低等缺點。為適應(yīng)基層大規(guī)模普查的需要，有必要研制出針對多種動物的快速檢測試劑盒。目前，以膠體金為標(biāo)記物，利用特異性抗原抗體反應(yīng)制備的膠體免疫層析試紙條成為學(xué)者們研究的對象。國內(nèi)外學(xué)者多將從感染動物中收集或經(jīng)組織、細(xì)胞培養(yǎng)的弓形蟲速殖體作為抗原制備診斷試紙條，該方法雖然特異性好，但抗原純度較低，成份復(fù)雜，價格昂貴。原核表達(dá)系統(tǒng)表達(dá)出的特異性目的蛋白，具有蛋白產(chǎn)量高、操作簡單、費用低廉等優(yōu)勢，成為眾多學(xué)者研究的對象。本研究對弓形蟲抗原基因進(jìn)行生物學(xué)分析，設(shè)計并合成弓形蟲膜表面抗原（surface antigen，SAG）SAG1和SAG2多表位重構(gòu)基因，構(gòu)建原核表達(dá)質(zhì)粒，對重組的目的蛋白進(jìn)行表達(dá)純化及抗原性檢測，然后進(jìn)行弓形蟲膠體金免疫層析試紙條的制備，為有效防控弓形蟲病奠定基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 質(zhì)粒、菌種 E.coli BL21(DE3)購自北京全式金生物技術(shù)有限公司；質(zhì)粒PET-28a(+) 為實驗室保存。

1.1.2 相關(guān)試劑 限制性內(nèi)切酶BamH I、HindIII、T4 DNA連接酶、2×PCR mix購自TaKaRa生物工程（大連）有限公司；Protein Ruler II（12-120 kDa）購自北京全式金生物技術(shù)有限公司；弓形蟲小鼠陽性血清為實驗室分離保存；羊抗鼠IgG-HRP購自北京康為世紀(jì)生物科技有限公司；His-rSPG為實驗室純化保存；硝酸纖維素膜（Sartorius CN140）、玻璃纖維素膜（GL0194）、PVC膠板（DB-6）購自上海杰一生物技術(shù)有限公司；氯金酸購自Sigma公司；其他化學(xué)試劑均為分析純。

1.2 方法

1.2.1 弓形蟲SAG重組基因的構(gòu)建表達(dá) 從GenBank中查出已公布的編碼弓形蟲表面抗原的SAG基因序列，分別分析SAG1和SAG2的B細(xì)胞抗原表位，合并抗原表位集中區(qū)段組建并優(yōu)化目的基因序列，將目的基因與PET-28a(+) 載體連接后，轉(zhuǎn)化至BL21(DE3) 感受態(tài)細(xì)胞，挑取完整單個菌落于含Kana的LB液體培養(yǎng)基中振蕩培養(yǎng)，加入1 mmol/L的IPTG誘導(dǎo)，使用His親和層析柱對表達(dá)的重組蛋白進(jìn)行純化，Western blot檢測重組蛋白的免疫原性。

1.2.2 膠體金最佳PH及最佳蛋白標(biāo)記量的確定 分別用K2CO3和HCl調(diào)節(jié)1 mL膠體金溶液pH至3.0、4.0、5.0、6.0、7.0、8.0、9.0，加入50 μL重組G蛋白，震蕩10 min后室溫放置10 min；然后每管分別加入100 μL 10%NaCl溶液，震蕩10 min后室溫放置10 min；觀察膠體金顏色變化，記錄保持紅色的最低pH 值。將膠體金溶液調(diào)至標(biāo)記的最佳pH值后，依次加入濃度為5、10、15、20、25、30、35、40、45、50 μg/mL的rSPG，震蕩10 min后室溫放置10 min；然后每管分別加入100 μL 10%NaCl溶液，震蕩10 min后室溫放置10 min，觀察膠體金顏色變化，記錄保持紅色的最小重組蛋白G用量。

1.2.3 膠體金探針的制備 燒制及貯存膠體金的所有玻璃器皿在酸缸中浸泡24 h，取出后用去離子水反復(fù)沖洗，烘干備用。將100 mL去離子水和1 mL1%氯金酸置于250 mL錐形瓶中，加熱至沸騰。緩慢加入1.5 mL的檸檬酸三鈉，觀察到溶液顏色由淡黃變黑最后逐漸穩(wěn)定成紫紅色后，繼續(xù)煮沸15 min，冷卻至室溫后定容到原體積。用0.2%K2CO3調(diào)節(jié)膠體金溶液pH至最佳值5.0，逐滴加入1.5 mL 1 mg/mL（濃度為15 μg/mL）的rSPG，振蕩15 min后靜置15 min；加入10 mL 10%PEG20000，使其終濃度為1%，振蕩15 min后靜置15 min；500× g離心20 min，棄沉淀；12 000×g離心30 min，棄上清，沉淀用20 mL TBS（1/5原體積）重懸。將制備好的膠體金探針均勻滴加于金標(biāo)墊上，使1.0 cm2的金標(biāo)墊中含有100 μL的膠體金探針，將金標(biāo)墊置于-80℃放置2 h，真空干燥。

1.2.4 膠體金免疫層析試紙條的制備 將NC膜貼于底板上，之后用膠體金點樣系統(tǒng)進(jìn)行劃線。分別用rSAG和rSPG（0.5 mg/mL）作為檢測線（T線）和質(zhì)控線（C線）。SAG重組蛋白劃線設(shè)置兩個劃線量，分別是1 μL/cm、2 μL/cm；重組蛋白G劃線量是1 μL/cm，劃線后將底板置于37℃烘箱過夜烘干。將金標(biāo)墊、樣品墊、吸水紙依次貼于含有NC膜的底板上，用貼條機(jī)以0.3 cm的寬度切條。

圖1 試紙條的組裝Fig.1 The assembly of strip

1.2.5 試紙條檢測結(jié)果的判定 吸取適量待檢樣品滴加到試紙條的樣品墊上，靜置5 min。若T線和C線均顯色，則結(jié)果為陽性；T線不顯色，C線顯色，則樣品為陰性；若C線不顯色，則試紙條無效。陽性血清按濃度比1:10、1:20、1:40、1:80稀釋，觀察出現(xiàn)陽性反應(yīng)的最高稀釋倍數(shù)。

2 結(jié)果與討論

2.1 弓形蟲SAG1和SAG2基因序列的構(gòu)建合成 SAG1和SAG2抗原都是弓形蟲特異性表膜抗原，以糖磷脂?；问藉^定在細(xì)胞膜上[3]，以阻止吞噬細(xì)胞對侵襲的弓形蟲進(jìn)行吞噬消化。SAG1主要與弓形蟲毒力相關(guān)[4]；SAG2與弓形蟲入侵宿主細(xì)胞有密切的關(guān)系。有研究表明，弓形蟲感染后的血清抗體能夠識別SAG1和SAG2表面抗原[5]，并己證實該基因編碼的重組抗原可作為診斷抗原，用于弓形蟲速殖子感染的免疫學(xué)檢測。將不同特異性抗原聯(lián)合使用作為診斷抗原，才可能增加檢測的靈敏性。我們通過生物信息學(xué)的方法預(yù)測這兩個蛋白的B細(xì)胞抗原表位，將這些抗原表位串聯(lián)在一起集中表達(dá)，以取代原蛋白。這種方法將兩個蛋白的抗原信息整合在一起，保留了兩個蛋白的大部分抗原信息，克服了各自蛋白的缺點，有望提高檢測的靈敏性和特異性。為了利用原核表達(dá)重組抗原，將基因信息中的稀有密碼子替換成大腸桿菌的偏愛密碼子，達(dá)到了產(chǎn)量高，易于純化的目的，可確保診斷抗原的規(guī)范化生產(chǎn)和質(zhì)量控制（圖2）。

圖2 弓形蟲SAG基因序列的構(gòu)建Fig.2 Construction of SAG gene sequence of Toxoplasma gondii

2.2 膠體金標(biāo)記His-rSAG的最佳pH值和最佳蛋白標(biāo)記量 用 K2CO3及 HCl 調(diào)節(jié)膠體金的 pH 值，根據(jù)肉眼觀察 pH 值為5.0 時為保持紅色最低pH值（圖2）。調(diào)節(jié)膠體金 pH 至5.0，加入His-rSAG，用蛋白濃度梯度法，測定膠體金結(jié)合蛋白的最低量，結(jié)果顯示，最佳蛋白標(biāo)記濃度是15 μg/mL（圖3）。

圖2 膠體金標(biāo)記His-rSPG的最佳pH值Fig.2 The optimal pH of gold colloid binding His-rSPG

圖3 膠體金標(biāo)記的最佳蛋白標(biāo)記濃度Fig.3 The optimal concentration of gold colloid binding His-rSPG

2.3 重組蛋白表達(dá)純化及Western blot鑒定結(jié)果rSAG在大腸桿菌BL21(DE3)中成功表達(dá)，并順利純化出大小約50 kDa的重組蛋白。Western blot結(jié)果顯示，重組蛋白能夠與小鼠陽性血清發(fā)生特異性結(jié)合（圖4）。

圖4 重組蛋白SAG純化結(jié)果（A）及Western blot（B）分析Fig.4 Puri fi cation result(A) and Western blot(B) of recombinant protein SAG

SAG基因的成功表達(dá)為弓形蟲膠體金免疫層析試紙條的制備奠定基礎(chǔ)。

2.4 膠體金免疫層析試紙條檢測小鼠血清 重組蛋白rSAG劃線量為2 μL/cm的試紙條與陽性血清反應(yīng)明顯，rSAG劃線量為1 μL/cm的陽性血清反應(yīng)不明顯，結(jié)果反映為陽性，陽性血清濃度稀釋至1:40仍可檢測到明顯的陽性反應(yīng)。兩種劃線濃度制備的試紙條與陰性血清均不反應(yīng)，結(jié)果反映為陰性（圖5）。

膠體金作為一種快速診斷方法已廣泛應(yīng)用于寄生蟲病檢測中，王艷華等[6]制備了弓形蟲抗體免疫膠體金快速診斷試紙條，并與IHA法進(jìn)行對照，結(jié)果顯示兩種方法符合率達(dá)82.5%，且敏感度高于IHA。唐雨德等[7]應(yīng)用膠體金免疫層析法檢測囊蟲抗體，并與ELISA法作對照，結(jié)果的符合率達(dá)96.8%。李學(xué)伍等[8]研制出旋毛蟲病快速金標(biāo)試紙條，該試紙條與ELISA檢測結(jié)果符合率達(dá)100%。上述研究也進(jìn)一步證明膠體金免疫層析試紙條在寄生蟲病快速檢測中發(fā)揮著重要作用。

圖5 試紙條與小鼠弓形蟲病血清樣品反應(yīng)結(jié)果Fig.5 The results of mouse toxoplasmosis positive serum with GICA

膠體金顆粒表面所帶的負(fù)電荷可以與蛋白質(zhì)的正電荷基團(tuán)通過靜電感應(yīng)發(fā)生物理吸附，物理吸附作用對蛋白質(zhì)的生物活性影響較小，從而更容易標(biāo)記[9]。本次研制的試紙條依然采用檸檬酸三鈉還原法制備膠體金并標(biāo)記重組G蛋白，該試紙條應(yīng)用的重組G蛋白保留了G蛋白同多種哺乳動物血清IgG的Fc段結(jié)合特性，去除了同IgG的Fab段和血清白蛋白結(jié)合部位，不僅提高了同IgG的結(jié)合力，而且減少了非特異性反應(yīng)[10]。因此，本試紙條理論上可以作為多種哺乳動物弓形蟲病的血清抗體檢測。

用弓形蟲的標(biāo)準(zhǔn)陰陽性血清檢測研制的試紙條，獲得了預(yù)期結(jié)果（表1）。本研究初步建立了快速檢測弓形蟲病的診斷方法，今后將對該試紙條的靈敏度、特異性及交叉反應(yīng)性做進(jìn)一步驗證。

表1 不同稀釋倍數(shù)的小鼠血清反應(yīng)結(jié)果Table 1 Results of different dilution ratio of mice serum

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DEVELOPMENT OF COLLOIDAL GOLD IMMUNOCHROMATOGRAPHIC STRIP ASSAY FOR TOXOPLASMOSIS DIAGNOSIS

WANG Zhao-zhe1, XU Rui1, HONG Yang1, LIN Jiao-jiao1,2, LU Ke1, LI Hao1, CHEN Zhao-guo1,TANG Ya-lan1, WU Si-min1, JIANG Jia-xin1, LI Jia-jing1, ZHU Chuan-gang1

(1. Natural Laboratory of Animal Schistosomiasis Control, Key Laboratory for Animal Parasitology, Ministry of Agriculture, Shanghai Veterinary Research Institute, CAAS, Shanghai 200241, China; 2. Jiangsu Co-innovation Center for Prevention and Control of Important Animal Infectious Diseases and Zoonoses, Yangzhou 225009, China)

In order to develop a colloidal gold immunochromatographic strip assay for toxoplasmosis diagnosis, the surface antigen genes of SAG1 and SAG2 of Toxoplasma gondii were synthesized and subcloned into plasmid pET-28a(+) to be expressed in Escherichia coli BL21(DE3). To obtain high concentrations of recombinant SAGs, the target proteins were purified using His-fusion protein puri fi cation kit and analyzed in Western blotting. Recombinant SAG1 and SAG2 were blotted on the nitrocellulose membrane and murine T. gondii positive and negative serum samples were then added as primary antibodies to test the sensitivity of colloidal gold immune chromatography strip. Development of the method laid a foundation for rapid diagnosis of toxoplasmosis at the grass-roots levels.

Colloidal gold immunochromatographic strip; recombinant protein; Toxoplasma

S852.723

B

1674-6422（2017）05-0068-05

2017-01-10

國家重點研發(fā)計劃（2017YFD0501306）；中央級公益性科研院所基本科研業(yè)務(wù)費（2017JB20）

王釗哲，女，碩士，實習(xí)研究員，主要從事動物血吸蟲病研究

朱傳剛，E-mail: zcg@shvri.ac.cn