基于12S rRNA基因序列的犬弓首蛔蟲種系發(fā)育關(guān)系分析

（1.河南省濟(jì)源市畜產(chǎn)品質(zhì)量監(jiān)測檢驗(yàn)中心，濟(jì)源 459000；2.河南省平頂山市畜牧技術(shù)推廣站，平頂山 467000）

項(xiàng)黎麗1，蘇玉賢2

基于12S rRNA基因序列的犬弓首蛔蟲種系發(fā)育關(guān)系分析

（1.河南省濟(jì)源市畜產(chǎn)品質(zhì)量監(jiān)測檢驗(yàn)中心，濟(jì)源 459000；2.河南省平頂山市畜牧技術(shù)推廣站，平頂山 467000）

本次研究旨在分析河南省不同地區(qū)犬弓首蛔蟲分離株線粒體12S rRNA部分基因序列（plastiosome 12S rRNA，p12S rRNA）的遺傳變異情況。通過PCR技術(shù)對犬弓首蛔蟲p12S rRNA序列進(jìn)行擴(kuò)增并測序，應(yīng)用ClustalX 2.0程序?qū)π蛄羞M(jìn)行比對，再利用Mega4.0程序進(jìn)行NJ法繪制種系發(fā)育樹。結(jié)果顯示，所獲得的18個犬弓首蛔蟲分離株p12S rRNA序列長度為497～499 bp。種系發(fā)育分析結(jié)果顯示，所有的犬弓首蛔蟲分離株與已知犬弓首蛔蟲位于同一分支，與其他蛔蟲所屬分支相隔較遠(yuǎn)。犬弓首蛔蟲p12S rRNA序列種內(nèi)相對保守，而種間差異較大，可以作為種間遺傳變異研究的標(biāo)記，從而為犬弓首蛔蟲的分類與流行學(xué)調(diào)查奠定了基礎(chǔ)。

犬弓首蛔蟲；線粒體DNA；12S rRNA基因；種系發(fā)育關(guān)系

項(xiàng)黎麗1，蘇玉賢2

犬弓首蛔蟲病是由犬弓首蛔蟲（Toxocara canls）感染引起的人畜共患寄生蟲病，其成蟲主要寄生于犬、貓和狐等犬科動物的胃部和小腸內(nèi)，宿主主要表現(xiàn)消瘦、異嗜、食欲不振、消化不良等臨床癥狀，嚴(yán)重時可導(dǎo)致死亡，剖檢可發(fā)現(xiàn)宿主小腸和胃部有大量成蟲[1]。人類經(jīng)口誤食感染性蟲卵后可導(dǎo)致幼蟲在其肌肉、眼睛和大腦中移行，引起嚴(yán)重的病例綜合癥[2,3]。犬弓首蛔蟲在全世界分布廣泛，據(jù)國外學(xué)者報(bào)道，其感染率為5.3%～64.7%[4-6]。我國的犬弓首蛔蟲病感染率為8.13%～77.4%[7,8]。近年來，隨著寵物犬飼養(yǎng)量的劇增，弓首蛔蟲病感染率也呈逐年上升趨勢。同時，犬弓首蛔蟲對犬、貓和狐等犬科動物的健康成長產(chǎn)生了極大的危害，給相關(guān)養(yǎng)殖業(yè)帶來了巨大的經(jīng)濟(jì)損失。因此，準(zhǔn)確鑒定出犬弓首蛔蟲，對遏制其流行與防制具有重要的意義。

隨著科學(xué)技術(shù)的飛速發(fā)展，分子遺傳研究已廣泛應(yīng)用于寄生蟲的分類學(xué)、遺傳變異和分子流行學(xué)中來，相關(guān)研究表明，線粒體基因（mitochondrial DNA，mtDNA）具有分子結(jié)構(gòu)簡單、無重組、進(jìn)化速率快、母系遺傳、拷貝數(shù)多等優(yōu)點(diǎn)[9]，其中線粒體12S rRNA 基因也可以作為分子標(biāo)記應(yīng)用于寄生蟲的分子鑒定和種系發(fā)育研究中[10,11]。本研究通過對河南省不同地區(qū)犬弓首蛔蟲分離株線粒體12S rRNA基因進(jìn)行擴(kuò)增并分析，探討其與其他蛔蟲的親緣關(guān)系，從而明確線粒體12S rRNA基因是否可以作為分子種間遺傳標(biāo)記，為犬弓首蛔蟲的鑒定、分類和分子流行病學(xué)調(diào)查以及防治等研究奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 蟲體樣品 本研究所采集的18株樣品分別來自于河南省鄭州市（ZZ1-2）、開封市（KF1-2）、洛陽市（LY1-2)、安陽市（AY1-2）、鶴壁市（HB1-2）、新鄉(xiāng)市（XX1-2）、許昌市（XC1-2）、洛河市（LH1-2）和焦作市（JZ1-2），所采集樣品均來自于犬腸道。

1.2 主要試劑 PCR試劑（Buffer、MgCl2、dNTP等）、DNA提取試劑盒、DL2000 Marker等均購自于寶生物工程（大連）有限公司；蛋白酶K為Merck公司產(chǎn)品。

1.3 基因組DNA的制備 取出70%酒精保存的蟲體，用蒸餾水反復(fù)沖洗5次，每次6 min。用無菌鑷子取出蟲體的一部分置于滅菌的1.5 mL Eppendorf管中，用滅菌的微型剪刀將蟲體徹底剪碎，加入200 μL GA buffer溶液與20 μL蛋白酶K，混勻后，放在65℃培養(yǎng)箱2～3 h（每30 min混勻1次）。將消化好的蟲體懸浮液體按使用說明書提取蟲體DNA，并置于－20℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.4 PCR擴(kuò)增 采用引物12SF和12SR[12]對犬弓首蛔蟲線粒體p12S rRNA 進(jìn)行擴(kuò)增，12SF：5'-GTTCCA GAATAATCGGCTA-3'，12SR：5'-ATTGACGGAT GAGTTTGTACC-3'，由上海生工生物科技技術(shù)有限公司合成。擴(kuò)增體系為25 μL：雙蒸水13.25 μL，2×Taq PCR Master Mix 8.5 μL、rTaq DNA聚合酶（5 U/μL）0.25 μL、上下游引物（10 pmol/μL）各0.5 μL、模板DNA 2 μL，同時設(shè)置無菌雙蒸水作陰性對照。擴(kuò)增條件為：94℃預(yù)變性3 min；然后94℃變性30 s，50℃退火30 s，72℃延伸1 min，共31個循環(huán)；最后以72℃延伸5 min。取5 μL PCR產(chǎn)物在1%TAE瓊脂糖凝膠電泳，利用紫外投射儀觀察實(shí)驗(yàn)結(jié)果，將陽性產(chǎn)物送至上海生工生物技術(shù)有限公司測序。

1.5 數(shù)據(jù)分析 利用DNAstar軟件對測序結(jié)果進(jìn)行分析，從GenBank檢索具有代表性的蛔蟲p12S rRNA進(jìn)行相似性對比和種系發(fā)育分析，以雙盲小口線蟲（Contracaecum osculatum，登錄號：JF713818.1）作為外群，用Clustal X 2.0 軟件和Mega4.0軟件對p12S rRNA 序列進(jìn)行對比及計(jì)算遺傳差距，然后用Mega4.0軟件中的臨接法（neighbor-joining, NJ）繪制種系發(fā)育樹，進(jìn)行重復(fù)自舉檢驗(yàn)（Bootstrap test）1000次。

2 結(jié)果與討論

2.1 PCR擴(kuò)增結(jié)果 18個犬弓首蛔蟲樣品均成功擴(kuò)增約500 bp的片段，與預(yù)期片段長度相符，無非特異性條帶，且空白對照為陰性。其中9個樣品PCR產(chǎn)物的瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果如圖1所示。

2.2 測序與序列分析結(jié)果 測序結(jié)果顯示，由引物12SF和12SR擴(kuò)增出犬弓首蛔蟲p12S rRNA片段大小為497～499 bp，與Wickramasinghe等[12]所擴(kuò)增12S rRNA基因片段長度一致。對18個p12S rRNA樣品序列進(jìn)行種內(nèi)差異對比，結(jié)果顯示，18個分離株樣品之間的p12S rRNA序列核苷酸序列的變異性很小（0～0.8%），序列差異主要表現(xiàn)為堿基互換、插入和缺失。河南省18個樣品p12S rRNA序列與GenBank收錄的弓首蛔蟲分離株（登錄號：FJ4 18782.1）相似度均高于98.2%，與其他蛔蟲分離株p12S rRNA序列的同源性均低于82.3%。以序列堿基組成為視角，12S rRNA序列的A、T、C、G四個堿基平均含量分別為30.84%、38.07%、9.40%和21.69%，A+T堿基含量為68.92%，明顯高于C+G堿基含量（31.08%），具有明顯的AT堿基偏倚性，這與李明偉[13]對犬弓首蛔蟲的研究結(jié)果相符。

2.3 12S rRNA序列系統(tǒng)發(fā)生樹 根據(jù)參考序列的長度，經(jīng)過比對后除去多余的序列，選用所測序列為430 bp。通過種系發(fā)育分析，結(jié)果顯示，河南省9個不同地區(qū)18個樣品分離株12S rRNA序列具有高度的同源性，和GenBank中收錄的犬弓首蛔蟲分離株（FJ4 18782.1）位于同一分支，系統(tǒng)發(fā)生樹中的Bootstrap值較高，且與其他蛔蟲所屬分支相隔較遠(yuǎn)，得到了很好的鑒別（圖2）?？梢娋€粒體12S rRNA基因可以作為遺傳標(biāo)記基因應(yīng)用于犬弓首蛔蟲的分子鑒定、分類學(xué)和種系發(fā)育等系列研究，本研究結(jié)果為犬弓首蛔蟲病的診斷、防制及進(jìn)一步的分子學(xué)研究提供了科學(xué)依據(jù)。

圖1 犬弓首蛔蟲線粒體12S rRNA PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的瓊脂糖凝膠電泳分析Fig.1 Analysis of PCR-ampli fi ed mtDNA 12S rRNA from Toxocara canls by agarose gel electrophoresis

圖2 基于12S rRNA 基因序列所構(gòu)成的系統(tǒng)發(fā)育樹Fig.2 Phylogenetic tree of 12S rRNA sequence using neighbor-joining method

[1] 梁貴金. 犬弓首蛔蟲病的防治[J]. 四川畜牧獸醫(yī), 2014(5): 50.

[2] Ahmed A M，Levkut M，Revajová V，et al. Larval tox-ocarosis in sheep：the immunohistochemical characterization of lesions in some affected organs[J]. Vet Parasitol, 2002, 105(3): 207-214.

[3] Akao N, Tomoda I, Hayashi E, et al. Cerebellar ataxia due to Toxocara infection in Mongolian gerbils，Meriones unguiculatus[J]. Vet Parasitol, 2003, 113(3-4): 229-237.

[4] Habluetzel A, Traldi G, Ruggieri S, et al. An estimation of Toxocara canis prevalence in dogs, environmental egg contamination and risk of human infection in the Marche region of Italy[J]. Vet Parasitol, 2003, 113(3-4): 243-252.

[5] Minnaar W N，Krecek R C，F(xiàn)ourie L J. Helminths in dogs from a peri-urban resource-limited community in Free State Province, South Africa[J]. Vet Parasitol, 2002,107(4): 343-349.

[6] Wright I, Stafford K, Coles K. The prevalence of intestinal nematodes in cats and dogs from Lancashire,north-west England[J]. J Small Anim Pract, 2016, 57(8):393-395.

[7] 林芝, 莊益芬, 張文昌. 寵物犬寄生蟲感染情況調(diào)查[J].黑龍江畜牧獸醫(yī), 2015(12): 135-136.

[8] 卓國榮, 狄和雙, 劉俊棟, 等. 泰州地區(qū)犬蛔蟲感染情況調(diào)查與治療研究[J]. 黑龍江畜牧獸醫(yī), 2016(2): 134-136.[9] 梁軒, 劉毅. 犬弓首蛔蟲線粒體 cox1 基因的克隆及序列分析[J]. 中國動物檢疫, 2015, 32(3): 66-69.

[10] 謝躍, 周璇, 孫韻, 等. 基于線粒體12S對中國兩大山系大熊貓西氏貝蛔蟲種群遺傳多樣性的研究[J]. 獸類學(xué)報(bào),2015, 35(3): 328-335.

[11] Rostami S, Salavati R, Beech R N, et al. Cytochrome c oxidase subunit 1 and 12S ribosomal RNA characterization of Coenurus cerebralis from sheep in Iran[J]. Vet Parasitol, 2013, 197(1-2): 141-151.

[12] Wickramasinghe S, Yatawara L, Rajapakse R P, et al.Toxocara canis and Toxocara vitulorum: molecular characterization, discrimination, and phylogenetic analysis based on mitochondrial (ATP synthase subunit 6 and 12S)and nuclear ribosomal (ITS-2 and 28S) genes[J]. Parasitol Res, 2009, 104(6): 1425-1430.

[13] 李明偉. 弓首蛔蟲分子鑒定和線粒體基因組的研究[D].廣州: 華南農(nóng)業(yè)大學(xué), 2006.

PHYLOGENETIC ANALYSIS OF MITOCHONDRIAL 12S rRNA GENE OF TOXOCARA CANLS IN HENAN PROVINCE

XIANG Li-li1, SU Yu-xian2

(1. Livestock Product Quality Surveillance Test Center of Jiyuan City, Henan Province, Jiyuan 459000, China; 2. Animal Husbandry and Veterinary Station of Pingdingshan City Henan Drovince, Pingdingshan 467000, China)

The aims of the present study were to analyze sequence variations in the mitochondrial 12S rRNA gene among Toxocara canls isolates from Henan province. The 12S rRNA was ampli fi ed from each of Toxocara canls isolates by PCR and analyzed using the ClustalX 2.0. The results showed that the lengths of all the 12S rRNA sequences were 497 - 499 bp. The 12S rRNA sequences of the Henan isolates and reference Toxocara canls available in GenBank were aligned for phylogenetic analysis and found that they all clustered in the same clade. Therefore, 12S rRNA sequence could be used as a genetic marker for population genetic studies of ascarid. The results of the present study provided foundation for further studies of diagnosis and molecular epidemiology of Toxocara canls.

Toxocara canls; mitochondrial DNA; 12S rRNA gene; phylogenetic relationship

S852.731

B

1674-6422（2017）05-0064-04

2016-12-23

平頂山市科技發(fā)展計(jì)劃項(xiàng)目（20160315-N02）

項(xiàng)黎麗，女，獸醫(yī)師，主要從事畜禽疫病防治研究

蘇玉賢，E-mail：634379495@qq.com