廣東省副豬嗜血桿菌的流行病學(xué)調(diào)查

佟鐵鑄，賈愛(ài)卿，樊惠英

（1.廣東出入境檢驗(yàn)檢疫局，廣州 5106233；2.華南農(nóng)業(yè)大學(xué)獸醫(yī)學(xué)院 農(nóng)業(yè)部獸用疫苗創(chuàng)制重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣州510642；3.廣東海大畜牧獸醫(yī)研究院，廣州 510000）

廣東省副豬嗜血桿菌的流行病學(xué)調(diào)查

佟鐵鑄1，賈愛(ài)卿2,3，樊惠英2

（1.廣東出入境檢驗(yàn)檢疫局，廣州 5106233；2.華南農(nóng)業(yè)大學(xué)獸醫(yī)學(xué)院 農(nóng)業(yè)部獸用疫苗創(chuàng)制重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣州510642；3.廣東海大畜牧獸醫(yī)研究院，廣州 510000）

為了解副豬嗜血桿菌（Haemophilus parasuis，Hps）在廣東省的流行情況，采用細(xì)菌分離鑒定和PCR方法對(duì)廣東省79家規(guī)?；i場(chǎng)的227頭疑似關(guān)節(jié)炎、多發(fā)性漿膜炎的發(fā)病豬進(jìn)行了檢測(cè)。結(jié)果顯示，副豬嗜血桿菌陽(yáng)性率達(dá)22.74%。對(duì)豬場(chǎng)全年發(fā)病情況進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析，發(fā)現(xiàn)1～3月Hps陽(yáng)性率最高。使用間接血凝試驗(yàn)方法對(duì)55株臨床分離株進(jìn)行血清學(xué)分型，結(jié)果顯示5型（23.68%）最為流行，其次是12型（13.16%）和4型（10.53%）。

副豬嗜血桿菌；流行病學(xué)；調(diào)查

副豬嗜血桿菌病，又稱革拉澤氏病(Glasser's disease)，是由副豬嗜血桿菌（Haemophilus parasuis，Hps）引起的一種以呼吸道癥狀，跛行，胸膜炎、心包炎、腹膜炎、關(guān)節(jié)炎和腦膜炎等為特征的豬呼吸道傳染病[1,2]。副豬嗜血桿菌病是影響全球養(yǎng)豬業(yè)的一種重要細(xì)菌性疾病。Hps只感染豬，可影響2周齡到4月齡的豬，常見(jiàn)于5～8周齡的豬。副豬嗜血桿菌病主要在斷奶后和保育階段發(fā)病，發(fā)病率一般為l0%～15%，嚴(yán)重時(shí)死亡率可達(dá)50%[3-5]。

本研究通過(guò)細(xì)菌形態(tài)學(xué)、培養(yǎng)特性和生化特性以及PCR方法進(jìn)行鑒定，從病料中成功分離到Hps。再用間接血凝方法對(duì)分離到的菌株進(jìn)行血清學(xué)分型，初步了解廣東省副豬嗜血桿菌病的流行情況，為廣東省的副豬嗜血桿菌病的防控提供數(shù)據(jù)參考。

1 材料與方法

1.1 臨床病料 從2013年1月～2015年11月，在廣東省79家規(guī)?；i場(chǎng)共采集發(fā)病豬277份病料。發(fā)病豬多表現(xiàn)為咳嗽、打噴嚏、呼吸困難，鼻腔有分泌物，消瘦、生長(zhǎng)緩慢、跛行等。部分豬表現(xiàn)為發(fā)熱，腹瀉，耳和四肢末端皮膚發(fā)紫，急性死亡等癥狀。剖檢病變表現(xiàn)為胸膜炎、腹膜炎、心包炎、關(guān)節(jié)炎和腦膜炎等[6,7]。

1.2 主要儀器設(shè)備與試劑 電子天平購(gòu)自上海精密科學(xué)儀器有限公司天平儀器廠；凝膠成像系統(tǒng)購(gòu)自美國(guó)Bio-Rad公司；My Cycler TM型PCR儀購(gòu)自美國(guó)Bio-Rad公司；超凈工作臺(tái)購(gòu)自蘇州凈化設(shè)備廠；電泳儀購(gòu)自美國(guó)Bio-Rad公司；恒溫水浴器購(gòu)自江蘇國(guó)華電器有限公司；超純水儀購(gòu)自法國(guó)Millipore公司；高速離心機(jī)購(gòu)自德國(guó)Eppendorf公司；高壓蒸汽滅菌鍋購(gòu)自上海醫(yī)用核子儀器廠；生化培養(yǎng)箱購(gòu)自上海精宏實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司。

胰蛋白大豆瓊脂（TSA）、胰蛋白大豆肉湯（TSB）均為OXOID公司產(chǎn)品；新生牛血清為杭州四季青材料有限公司產(chǎn)品；輔酶I (煙酰胺腺嘌呤二核苷酸，NAD) 為上?；瘜W(xué)試劑公司產(chǎn)品；dNTPs、ExTaq酶、電泳緩沖液TAE（50×）購(gòu)自寶生物工程（大連）有限公司；微量生化鑒定試劑為杭州天和微生物試劑有限公司產(chǎn)品；陽(yáng)性血清，陰性血清均為實(shí)驗(yàn)室保存。

1.3 病原菌的分離 分別從疑似病豬的肺臟、鼻腔、肝臟、胸腹腔積液、脾臟、腎臟、心臟和關(guān)節(jié)液等病料中無(wú)菌操作取樣，在TSA固體培養(yǎng)基上分別劃線接種，37℃培養(yǎng)48～72 h后挑取單個(gè)菌落，進(jìn)行純培養(yǎng)并鑒定[8]。

1.4 革蘭氏染色鏡檢 挑取1.3獲得的單菌落涂片，進(jìn)行革蘭氏染色。

1.5 生化鑒定 用接種環(huán)分別挑取1.3獲得的單菌落，純培養(yǎng)后接種于脲酶、氧化酶、接觸酶、硝酸鹽還原、吲哚、葡萄糖、蔗糖、果糖、半乳糖、核糖和麥芽糖等微型生化鑒定管觀察結(jié)果。

1.6 PCR檢測(cè) 將被檢菌株培養(yǎng)液12 500 ×g離心5 min，棄上清液，用無(wú)菌水重懸，然后在沸水中水浴10 min，再置-20℃凍結(jié)，室溫融化后12 500 ×g離心5 min，取上清液作模板[9]。根據(jù)Hps 16S rRNA序列設(shè)計(jì)引物[10]，由上海生工公司合成。上游引物：5'-GGC TTC GTC ACC CTC TGT -3'；下游引物：5'-GTG ATG AGG AAG GGT GGT GT -3'。以10 μL DNA為模板，上下游引物各1 μL，然后分別加入5 μL 10×reaction buffer、0.5 μL Ex Taq酶（TaKaRa公司）、2.5 mmol/L dNTP 5 μL 、27.5 μL DEPC水，共50 μL。94℃預(yù)變性4 min；PCR反應(yīng)條件：94℃變性50 s，59℃退火50 s，72℃延伸1 min，運(yùn)行30個(gè)循環(huán)；最后72℃延伸10 min。

1.7 間接血凝試驗(yàn)血清學(xué)分型方法的操作步驟 無(wú)菌采集健康公綿羊頸靜脈血液200 mL，于400 mL滅菌阿氏液中，4℃靜置3 d，無(wú)菌雙層紗布過(guò)濾，500×g離心4 min。用PBS（pH7.4）洗5次，每次500×g離心5 min，配成3%的綿羊紅細(xì)胞懸液4℃保存，1周內(nèi)使用。取300 μL上述待檢Hps溫水抗原，加入2700 μLPBS（pH7.4），混勻后加入3000 μL 3%綿羊紅細(xì)胞，37℃水浴90 min，其間每隔10 min輕輕搖晃，保持紅細(xì)胞懸浮。將上述致敏紅細(xì)胞用PBS（pH7.4）清洗3次，每次500×g離心5 min，重懸于pH7.4 PBS中即為致敏好的綿羊紅細(xì)胞，4℃保存，1周內(nèi)使用。

取微量血凝板2塊，按次序編號(hào)為1～15行，每孔加入25 μL/生理鹽水，然后將15株標(biāo)準(zhǔn)血清型Hps的高免血清25 μL，按次序分別加入每行的第1孔中?；靹蚝螅啃斜侗认♂屩恋?0孔，棄去第10孔吸出的血清，第11孔為陰性對(duì)照，第12孔為凝集對(duì)照；每行的1～10孔內(nèi)各加入25 μL的待檢菌株的抗原，每行第11孔分別加入未免疫的新西蘭大白兔陰性血清，每行第12孔加入相應(yīng)標(biāo)準(zhǔn)血清型的Hps菌株的抗原。最后每孔加入50 μL 3%致敏的綿羊紅細(xì)胞，在微量震蕩器上振蕩混勻，室溫下作用30 min后觀察結(jié)果[11,12]。

2 結(jié)果

2.1 副豬嗜血桿菌的檢測(cè)結(jié)果 通過(guò)細(xì)菌形態(tài)學(xué)、培養(yǎng)特性和生化特性觀察，以及PCR鑒定，從廣東省送檢的疑似病豬的277份病料中檢測(cè)到63株Hps，分離到55株Hps，陽(yáng)性率為22.74%，病料分離率為19.86%。1～3月從25家豬場(chǎng)檢測(cè)出Hps陽(yáng)性豬場(chǎng)11家，Hps陽(yáng)性檢出率為44%；4～6月從30家豬場(chǎng)檢測(cè)出Hps陽(yáng)性豬場(chǎng)10家，Hps陽(yáng)性檢出率為33.33%；7～9月從24家豬場(chǎng)檢測(cè)出Hps陽(yáng)性豬場(chǎng)4家，Hps陽(yáng)性檢出率為16.67%；10～12月從13家豬場(chǎng)檢測(cè)出Hps陽(yáng)性豬場(chǎng)3家，Hps陽(yáng)性檢出率為23.08%。

2.2 菌落特征與細(xì)菌形態(tài) Hps在TSA固體培養(yǎng)基上，37℃培養(yǎng)24～48 h后，菌落呈圓形、光滑濕潤(rùn)、無(wú)色透明、直徑1～2 mm，見(jiàn)圖1。革蘭染色顯示為革蘭氏陰性細(xì)小桿菌，具有多種不同的形態(tài)，有單個(gè)的球桿菌以及長(zhǎng)的、細(xì)胞的以致絲狀的菌體，見(jiàn)圖2。

圖1 副豬嗜血桿菌在TSA 固體培養(yǎng)基上37℃培養(yǎng)24 h的菌落形態(tài)Fig. 1 Colony morphology of Haemophilus parasuis on a TSA solid medium at 37°C for 24 h

圖2 副豬嗜血桿菌革蘭染色鏡檢Fig. 2 Microscopy of Hps Gram staining

2.3 生化鑒定 多數(shù)Hps分離株只發(fā)酵果糖、葡萄糖、半乳糖、麥芽糖、蔗糖，不發(fā)酵棉籽糖、乳糖、蜜三糖、阿拉伯糖、木糖、鼠李糖，甘露醇，尿素試驗(yàn)陰性，氧化酶試驗(yàn)陰性，接觸酶試驗(yàn)陽(yáng)性，硝酸鹽還原試驗(yàn)陽(yáng)性，吲哚試驗(yàn)陰性（表1）。

表1 部分副豬嗜血桿菌分離株的生化鑒定結(jié)果Table 1 Biochemical identi fi cation of some Haemophilus parasuis isolates

2.4 PCR鑒定 根據(jù)副豬嗜血桿菌16S rRNA序列設(shè)計(jì)引物，經(jīng)PCR擴(kuò)增，產(chǎn)物為822 bp大小的片段，見(jiàn)圖3。

2.5 廣東部分豬場(chǎng)副豬嗜血桿菌血清型鑒定 采用間接血凝試驗(yàn)方法對(duì)55株Hps分離株進(jìn)行血清學(xué)分型， 分型結(jié)果顯示以5型（23.68%）最為流行，其次是12型（13.16%）居多，其次分別是血清4型（10.53%）、14型（7.89%）、10型（5.26%）、1型（2.63%）和15型（2.64%），另外有34.21%不能定型，見(jiàn)圖4。

圖3 副豬嗜血桿菌16S rRNA PCR擴(kuò)增結(jié)果Fig.3 The results of 16S rRNA PCR ampli fi cation of Haemophilus parasuis

圖4 55株臨床分離株血清型分布圖Fig. 4 The serotype distribution of 55 clinical isolates

3 討論

副豬嗜血桿菌是豬上呼吸道的常在菌，在不利的飼養(yǎng)環(huán)境和其他病原菌侵襲下，能迅速侵入主要器官，引起以纖維素性多發(fā)性漿膜炎、關(guān)節(jié)炎和腦膜炎為特征的格拉澤氏病[13,14]。由于豬感染Hps后，其臨床癥狀、肉眼觀察病理變化等與豬鏈球病、支原體性肺炎和傳染性胸膜肺炎等都有相似之處，容易混淆，所以副豬嗜血桿菌病較難鑒定。因此，對(duì)于Hps的分離鑒定是臨床上最準(zhǔn)確有效的診斷方法。Hps生長(zhǎng)所需營(yíng)養(yǎng)條件高、生長(zhǎng)速度緩慢、死亡快，培養(yǎng)難度較大；另外，針對(duì)Hps的選擇培養(yǎng)基目前還未見(jiàn)報(bào)道，所以Hps的分離鑒定就有很大難度。PCR方法具有簡(jiǎn)便、快速、靈敏度高等優(yōu)點(diǎn)，能加快對(duì)于Hps的準(zhǔn)確診斷，提高Hps的分離效率。

本研究對(duì)廣東省的277份病料先通過(guò)PCR的方法將陽(yáng)性病料選出，然后在含有犢牛血清、NAD的TSA平板上分離出多數(shù)的病原菌，再將單菌落接種于含有犢牛血清、NAD的TSA平板和不含有犢牛血清、NAD的TSA平板上，區(qū)分Hps和豬鏈球菌[15,16]。最后，通過(guò)微生物學(xué)鏡檢、生化試驗(yàn)以及PCR方法對(duì)分離菌株進(jìn)行鑒定，保證了分離的菌株為Hps。277份病料共檢測(cè)到Hps63株，其中分離到55株Hps，陽(yáng)性率為22.74%，病料分離率為19.86%。結(jié)果表明，Hps在我國(guó)廣東省豬場(chǎng)中普遍存在。另外通過(guò)對(duì)豬場(chǎng)全年不同季度發(fā)病情況的數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)，發(fā)現(xiàn)其中以1～3月陽(yáng)性率最高，這可能與廣東地區(qū)1～3月氣溫低，豬的抵抗力相對(duì)較弱，而天氣比較潮濕，溫度、濕度等條件比較適合細(xì)菌繁殖有關(guān)。

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EPIDEMIOLOGICAL INVESTIGATION OF HAEMOPHILUS PARASUIS IN GUANGDONG PROVINCE

TONG Tie-zhu1, JIA Ai-qing2,3, FAN Hui-ying2

(1. Guangdong Entry-Exit Inspection and Quarantine Bureau, Guangzhou 5106233, China; 2. Key Laboratory for Animal Vaccine
Development of Ministry of Agriculture, College of Veterinary Medicine, South China Agricultural University, Guangzhou 510642, China; 3.Guangdong Haid Institute of Animal Husbandry & Veterinary,Guangzhou 510000,China)

In order to understand the epidemiology of Haemophilus parasuis in Guangdong province, 227 cases of suspected arthritis and multiple serositis from 79 large-scale swine farms in Guangdong province were tested using bacterial isolation and nucleic acid ampli fi cation method. The results showed that the positive rate of Haemophilus parasuis was 22.74%. Statistical analysis of the incidences of pig farms in different quarters of a year revealed that the positive rate was the highest in the fi rst three months. Fifty- fi ve clinical isolates were obtained and serotyped using indirect hemagglutination test. The most prevailing serotype was type 5 (23.68%), followed by serotype 12 (13.16%) and serotype 4 (10.53%).

Haemophilus parasuis; epidemiological; investigation

S852.612

A

1674-6422（2017）05-0042-05

2017-02-06

公益性行業(yè)項(xiàng)目（201303034）

佟鐵鑄，男，碩士研究生，預(yù)防獸醫(yī)學(xué)專業(yè)

樊惠英，E-mail：13829915152@163.com