海洋創(chuàng)傷弧菌感染對(duì)宿主免疫系統(tǒng)的影響研究

付凱飛，劉劍飛，王欲曉，吳成林，欽可為，周麗君 （解放軍海軍總醫(yī)院中心實(shí)驗(yàn)科，北京100048）

·論著·

海洋創(chuàng)傷弧菌感染對(duì)宿主免疫系統(tǒng)的影響研究

付凱飛，劉劍飛，王欲曉，吳成林，欽可為，周麗君 （解放軍海軍總醫(yī)院中心實(shí)驗(yàn)科，北京100048）

目的：探討重要海洋致病菌創(chuàng)傷弧菌對(duì)小鼠免疫器官及免疫組織的感染效應(yīng)，為有效的感染診治提供新思路.方法：以亞致死劑量的創(chuàng)傷弧菌感染BALB/c小鼠，采用病理顯微鏡技術(shù)觀察小鼠脾臟及腸道淋巴組織病理學(xué)變化，應(yīng)用流式細(xì)胞技術(shù)檢測(cè)外周血及脾臟的淋巴細(xì)胞壞死/凋亡情況和淋巴細(xì)胞亞群分布變化，并在人工合成創(chuàng)傷弧菌溶血素蛋白基礎(chǔ)上，采用細(xì)胞毒實(shí)驗(yàn)檢測(cè)創(chuàng)傷弧菌主要毒力因子對(duì)淋巴細(xì)胞損傷情況.結(jié)果：創(chuàng)傷弧菌感染后，脾臟及腸道相關(guān)淋巴組織均有明顯的結(jié)構(gòu)改變，出血/充血明顯，淋巴細(xì)胞可見碎裂、壞死；創(chuàng)傷弧菌感染后外周血及脾臟內(nèi)的淋巴細(xì)胞損傷以凋亡尤為顯著，同時(shí)淋巴細(xì)胞各亞群失去正常比例，CD4＋T細(xì)胞明顯低于對(duì)照組，CD4＋/CD8＋T細(xì)胞比例也顯著降低（P＜0.05）；體外CCK?8細(xì)胞毒活性實(shí)驗(yàn)也顯示，一定濃度的創(chuàng)傷弧菌溶血素蛋白可顯著降低淋巴細(xì)胞的存活率（P＜0.01）.結(jié)論：創(chuàng)傷弧菌感染對(duì)免疫組織細(xì)胞有明顯的破壞作用，可能導(dǎo)致感染后期發(fā)生免疫抑制，進(jìn)一步加重繼發(fā)感染.

創(chuàng)傷弧菌；免疫組織；溶血素；淋巴細(xì)胞；流式檢測(cè)

0 引言

創(chuàng)傷弧菌（Vibrio vulnificus）是一種廣泛分布在海洋中的致病弧菌，以致病毒力強(qiáng)、感染死亡率高著稱.接觸或食用被創(chuàng)傷弧菌感染的魚、蝦、貝類等海產(chǎn)品，或開放性傷口接觸海水等均可引起創(chuàng)傷弧菌感染，導(dǎo)致急性胃腸炎、創(chuàng)口蜂窩織炎、壞死性筋膜炎，甚至膿毒血癥等癥狀，偶還可致肺炎、自發(fā)性腹膜炎和腦膜炎［1－2］.世界范圍內(nèi)的創(chuàng)傷弧菌感染病例時(shí)有發(fā)生，最早的報(bào)道見于1970年，Roland發(fā)現(xiàn)創(chuàng)傷弧菌感染導(dǎo)致小腿壞疽和內(nèi)毒素性休克［3］，此后國(guó)內(nèi)外一些沿海城市相繼有創(chuàng)傷弧菌感染的臨床報(bào)告，國(guó)內(nèi)病例多集中于浙江溫州地區(qū)和臺(tái)灣地區(qū)［4－5］.而且多數(shù)病例分析報(bào)告［6－7］表明，發(fā)生創(chuàng)傷弧菌感染性重癥敗血癥患者大多是免疫力低下人群，如患有糖尿病、肝損傷、酒精性肝硬變等，感染后引發(fā)的敗血癥往往為多臟器累及，一旦發(fā)生敗血癥性休克，死亡率將達(dá)100%.目前已有大量針對(duì)創(chuàng)傷弧菌致病性及毒力的研究報(bào)道，常見的宿主感染效應(yīng)及部分致病機(jī)制也得以闡明，但其對(duì)免疫系統(tǒng)是否存在特殊損傷效應(yīng)目前國(guó)內(nèi)外均鮮見報(bào)道.為此，我們?cè)诩韧芯拷Y(jié)果基礎(chǔ)上，將創(chuàng)傷弧菌感染后免疫組織的病理學(xué)改變和免疫細(xì)胞變化相結(jié)合，在不同病變水平上評(píng)估其對(duì)免疫系統(tǒng)的損傷，并對(duì)目前公認(rèn)的創(chuàng)傷弧菌致病元兇——溶血素（Vibrio vulnificus cytolysin，VVC）的淋巴毒活性進(jìn)行檢測(cè)，從免疫學(xué)角度進(jìn)一步揭示其致病效應(yīng)機(jī)制.

1 材料和方法

1.1 主要試劑RPMI?1640培養(yǎng)液購自美國(guó)Hy?clone公司；胎牛血清購于北京元亨圣馬生物技術(shù)研究所；2216E海生菌培養(yǎng)肉湯，胸腺依賴淋巴細(xì)胞（thymusdependent lymphocytes，T淋巴細(xì)胞）、骨髓依賴淋巴細(xì)胞（bone marrow dependent lymphocyte，B淋巴細(xì)胞）和自然殺傷細(xì)胞（natural killer cell，NK細(xì)胞）亞群檢測(cè)試劑盒，以及細(xì)胞壞死/凋亡（Annexin?V/7?AAD）檢測(cè)試劑盒均購自美國(guó)BD（Becton，Dick?inson and Company）公司；淋巴細(xì)胞分離液購自天津?yàn)笊锕?；?xì)胞增殖活性檢測(cè)試劑盒（cell count?ing kit?8，CCK?8）購自東仁化學(xué)科技公司.

1.2 菌株及細(xì)胞創(chuàng)傷弧菌（MCCC?1H00066）購于中國(guó)海洋微生物菌種保藏管理中心，于2216E海生菌培養(yǎng)肉湯中37℃恒溫培養(yǎng)；AHH?1細(xì)胞為本研究室保存，在1640培養(yǎng)液（含10%胎牛血清）中以37℃、50 mL/L CO2孵箱條件培養(yǎng).

1.3 創(chuàng)傷弧菌溶血素蛋白根據(jù)GeneBank中公布的創(chuàng)傷弧菌VVC（GenBank＝NC＿005140.1）序列設(shè)計(jì)擴(kuò)增目的基因引物［Pvvf1：5'?gcggatccatgaaaaaaat?gactctgttt?3'（BamH 1）、Pvvr2：5'?ccctcgaggagtttgacttgttg?taatgt?3'（Xho 1）］，委托上海生工進(jìn)行基因的克隆與鑒定，并構(gòu)建原核表達(dá)質(zhì)粒，獲得大腸桿菌中的高效表達(dá)并SDS?PAGE鑒定，將純化VVC蛋白－70℃保存?zhèn)溆?

1.4 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及感染模型制備雌性BALB/c小鼠（8周齡）購于解放軍海軍總醫(yī)院動(dòng)物中心.調(diào)整創(chuàng)傷弧菌懸液濃度為106CFU/mL，選取實(shí)驗(yàn)組小鼠于右下腹進(jìn)行腹腔注射（1 mL/只），對(duì)照組腹腔注射等量滅菌的生理鹽水.

1.5 病理學(xué)標(biāo)本的制備及觀察注射后12 h眼球取血，斷椎法處死后取脾臟、并剪除小腸淋巴結(jié)，放于10%緩沖甲醛溶液固定2～3 d后，石蠟包埋制片，HE染色，光鏡觀察其組織病理變化.

1.6 流式檢測(cè)樣本制備

1.6.1 外周血樣本 將所采小鼠眼球抗凝血稀釋后，加于分離液之液面上，以400 g離心20 min，小心吸取淋巴細(xì)胞分離層，用PBS重復(fù)離心洗滌3次，并將離心細(xì)胞團(tuán)重懸于100 μL的PBS中，以備流式檢測(cè).

1.6.2 脾臟樣本 將所取脾臟組織放入盛有1640培養(yǎng)液的培養(yǎng)皿中沖洗，剝除周圍結(jié)締組織，放置于300目尼龍濾膜上，用注射器針芯輕輕研壓脾臟，至無組織團(tuán)塊時(shí)，取1 mL含0.1%血清的PBS沖洗針芯及濾膜，吸取脾細(xì)胞懸液共3 mL加入流式上樣管中，以備檢測(cè).

1.7 VVC細(xì)胞毒檢測(cè)將AHH?1細(xì)胞接種于96孔板，在不同組別的孔中分別加入VVC（終濃度分別為（0.5 μg/mL、5 μg/mL、20 μg/mL和40 μg/mL），對(duì)照組加入同體積1640培養(yǎng)液，空白組不含細(xì)胞.檢測(cè)時(shí)間點(diǎn)分別為12 h、18 h、24 h和36 h，細(xì)胞培養(yǎng)完成后加入CCK?8試劑，共孵育2 h后用酶標(biāo)儀測(cè)定450 nm波長(zhǎng)（630 nm參考波長(zhǎng)）的雙波長(zhǎng).細(xì)胞存活率＝（OD實(shí)驗(yàn)組?OD空白組）/（OD對(duì)照組?OD空白組）×100%.

1.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理采用SPSS21.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行單因素方差分析，數(shù)據(jù)以±s表示，P＜0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義.

2 結(jié)果

2.1 創(chuàng)傷弧菌感染后免疫組織病理變化陰性對(duì)照組脾臟及腸淋巴組織結(jié)構(gòu)正常（圖1A、2A）.弧菌感染后小鼠脾臟可見脾臟充血出血明顯，被膜下有充血、出血改變，脾小結(jié)周圍有明顯的出血帶，脾小結(jié)縮小或消失，脾小結(jié)內(nèi)可見灶狀出血，淋巴細(xì)胞碎裂、壞死改變，髓索內(nèi)也可見網(wǎng)狀內(nèi)皮細(xì)胞增生和中性粒細(xì)胞浸潤(rùn)（圖1B、1C）；腸淋巴結(jié)組織可見附近腸絨毛排列紊亂，脫落絨毛細(xì)胞變性、壞死，部分絨毛水腫明顯，間質(zhì)有蛋白滲出液，粘膜固有層、肌層和粘膜下層水腫，部分絨毛表面、絨毛內(nèi)、粘膜和粘膜下層均有菌團(tuán)侵入，部分淋巴結(jié)失去正常的形態(tài)結(jié)構(gòu)，淋巴結(jié)內(nèi)可見紅細(xì)胞滲出，呈灶狀出血，淋巴細(xì)胞碎裂、壞死改變（圖2B、2C）.

圖1 小鼠脾臟組織結(jié)構(gòu)變化

圖2 小鼠腸組織淋巴結(jié)結(jié)構(gòu)變化

2.2 創(chuàng)傷弧菌感染后外周血免疫細(xì)胞變化

2.2.1 壞死/凋亡變化 流式檢測(cè)結(jié)果顯示，創(chuàng)傷弧菌感染后，小鼠外周血淋巴細(xì)胞出現(xiàn)明顯壞死、凋亡，且以凋亡損傷為主，凋亡細(xì)胞數(shù)量顯著高于對(duì)照組（圖3）.

圖3 創(chuàng)傷弧菌感染后外周血淋巴細(xì)胞壞死/凋亡變化

2.2.2 各淋巴細(xì)胞亞群變化 創(chuàng)傷弧菌感染組T細(xì)胞比例顯著低于對(duì)照組，B細(xì)胞和NK細(xì)胞比例也分別有升高及降低的變化，但無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（圖4）；T細(xì)胞亞群中，CD4＋T細(xì)胞明顯減少，CD8＋T細(xì)胞及CD4＋/CD8＋T細(xì)胞比例也有相應(yīng)降低，但差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（圖5）.

2.3 創(chuàng)傷弧菌感染后脾臟淋巴細(xì)胞變化

2.3.1 壞死/凋亡變化 創(chuàng)傷弧菌感染脾臟淋巴細(xì)胞也有壞死凋亡發(fā)生（圖6），且以凋亡改變尤為顯著，壞死細(xì)胞相對(duì)數(shù)量較少，這也與病理觀察到的結(jié)果相一致.

圖6 創(chuàng)傷弧菌感染后脾臟淋巴細(xì)胞壞死/凋亡變化

2.3.2 各淋巴細(xì)胞亞群變化 創(chuàng)傷弧菌感染脾臟中T細(xì)胞和NK細(xì)胞比例明顯較對(duì)照組降低，B細(xì)胞比例則明顯高于對(duì)照組，均存在統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（圖7A）；T細(xì)胞亞群中，創(chuàng)傷弧菌感染組CD4＋T細(xì)胞明顯低于對(duì)照組，CD4＋/CD8＋T細(xì)胞比例也顯著降低（圖7B）.

圖7 創(chuàng)傷弧菌感染后脾臟不同淋巴細(xì)胞群比例變化情況

2.4 VVC的細(xì)胞毒作用VVC對(duì)淋巴細(xì)胞株AHH?1存活率影響存在一定的量效關(guān)系，0.5 μg/mL和5 μg/mL的VVC作用組AHH?1存活率無顯著下降，VVC作用濃度超過20 μg/mL時(shí)AHH?1存活率均明顯降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01，圖8）.

圖8 創(chuàng)傷弧菌溶血素VVC對(duì)淋巴細(xì)胞株AHH?1毒性作用

3 討論

機(jī)體的免疫系統(tǒng)可通過有效地啟動(dòng)抗感染免疫應(yīng)答效應(yīng)，從而發(fā)揮殺傷作用，清除入侵的病毒、細(xì)菌等病原微生物.淋巴細(xì)胞是機(jī)體發(fā)生免疫應(yīng)答的主要作用細(xì)胞，其基本成分主要包括T細(xì)胞、B細(xì)胞、NK細(xì)胞等.不同淋巴細(xì)胞亞群的數(shù)量及構(gòu)成是反映機(jī)體免疫功能狀態(tài)的重要指標(biāo)，也是各亞群細(xì)胞協(xié)同調(diào)節(jié)，實(shí)現(xiàn)機(jī)體免疫功能正常的必要條件［8］.因此，對(duì)感染機(jī)體外周血及脾等免疫組織內(nèi)淋巴細(xì)胞的檢測(cè)，可以為感染程度、機(jī)體免疫狀態(tài)及臨床表現(xiàn)的差異等提供有效啟示.

本研究結(jié)果顯示，亞致死劑量的創(chuàng)傷弧菌通過腹膜吸收入血后，可引起器官組織炎癥反應(yīng)和嚴(yán)重的血液循環(huán)障礙，并造成淋巴組織變性、壞死等結(jié)構(gòu)上的損傷，而且流式細(xì)胞檢測(cè)表明淋巴細(xì)胞受損方式以凋亡為主，這也與病理觀察到的結(jié)果一致.關(guān)于創(chuàng)傷弧菌感染引起的病理變化及其相關(guān)致病因素的研究較多，已明確的致病因子包括溶血素、腸毒素、細(xì)胞毒素、蛋白酶、鐵螯合物、粘附因子和血凝素等，其中溶血素除了增加血管通透性，更是導(dǎo)致細(xì)胞凋亡和壞死的重要元兇［9－10］.本研究體外實(shí)驗(yàn)也表明，一定濃度的創(chuàng)傷弧菌溶血素vvc可以顯著降低淋巴細(xì)胞的存活率.因此，在創(chuàng)傷弧菌感染時(shí)，機(jī)體可通過凋亡、壞死方式直接損傷淋巴細(xì)胞，造成其數(shù)量、比例的變化，進(jìn)而打破機(jī)體免疫平衡.

在淋巴細(xì)胞各亞群構(gòu)成中，T細(xì)胞是其中的主要組分，數(shù)量最多，功能也最為復(fù)雜，如可直接殺傷靶細(xì)胞，輔助或抑制B細(xì)胞產(chǎn)生抗體，以及產(chǎn)生細(xì)胞因子等.絕大部分成熟的T細(xì)胞可經(jīng)血流遷徙至脾臟、骨髓或淋巴結(jié)（如腸相關(guān)淋巴組織），并進(jìn)行淋巴再循環(huán)，發(fā)揮細(xì)胞免疫及免疫調(diào)節(jié)等功能，其中有超過一半的T細(xì)胞可進(jìn)入脾臟白髓［11－12］.本研究結(jié)果中，創(chuàng)傷弧菌感染使外周血和脾臟T細(xì)胞比例均有顯著降低，其中CD4＋T細(xì)胞下降明顯，CD4＋/CD8＋T細(xì)胞比例也相應(yīng)降低，表明機(jī)體細(xì)胞免疫功能減弱.CD4＋T是人體最重要的免疫細(xì)胞，其數(shù)量能夠直接反映人體免疫功能，也是著名的HIV的攻擊對(duì)象［13］.Leder?berger等［14］對(duì)HIV感染者的研究表明，若血液中CD4＋T數(shù)量低于200個(gè)/μL，機(jī)會(huì)性感染的風(fēng)險(xiǎn)上升2.5倍，若低于50個(gè)/μL，這種風(fēng)險(xiǎn)將會(huì)上升到5.8倍.而CD8＋T細(xì)胞是介導(dǎo)細(xì)胞毒性反應(yīng)的效應(yīng)細(xì)胞，其增多會(huì)引起免疫抑制反應(yīng)［15］.因此，CD4＋和CD8＋T細(xì)胞二者之間的比值是衡量機(jī)體免疫功能是否穩(wěn)定的重要依據(jù)，其降低則提示免疫功能下降，反映感染進(jìn)程的加重且影響預(yù)后［16］.

而B細(xì)胞在血液和淋巴結(jié)中的數(shù)量相對(duì)較少，也可經(jīng)血流遷出至脾臟和淋巴結(jié)，受抗原刺激后可產(chǎn)生抗體發(fā)揮體液免疫的功能［17］.雖然B細(xì)胞通過與T細(xì)胞相同的途徑定居至脾臟和淋巴結(jié)，但其在脾臟中的循環(huán)數(shù)量遠(yuǎn)高于外周淋巴結(jié)［13］.本研究結(jié)果中，創(chuàng)傷弧菌感染使外周血和脾臟B細(xì)胞比例有所升高，表明機(jī)體體液免疫功能在感染后受損傷較小，甚或有所提升.除了T細(xì)胞和B細(xì)胞，NK細(xì)胞也是同樣重要的免疫效應(yīng)細(xì)胞，雖數(shù)量不多，但在機(jī)體防御病原微生物感染和抗腫瘤方面發(fā)揮著及其重要的作用［18－19］.NK細(xì)胞在體內(nèi)分布非常廣泛，根據(jù)表面標(biāo)志不同又可分為不同亞群，存在于外周血中的NK細(xì)胞既可誘導(dǎo)針對(duì)靶細(xì)胞的抗體依賴的細(xì)胞介導(dǎo)的細(xì)胞毒性作用，又可產(chǎn)生多種不同類型的細(xì)胞因子［20］，而肝臟、脾臟等其它組織中的NK細(xì)胞功能則與其周圍的微環(huán)境狀態(tài)密切相關(guān)，不同組織中NK細(xì)胞的分化、成熟過程及其細(xì)胞毒活性都顯示出明顯差異［21－22］.本研究中創(chuàng)傷弧菌感染后NK細(xì)胞比例也有一定程度降低，有可能是創(chuàng)傷弧菌及其毒力因子的細(xì)胞毒作用所致，也不排除其本身抗菌過程中存在一定的消耗，提示創(chuàng)傷弧菌感染后，依賴于NK細(xì)胞的抗感染免疫功能也受到影響.

總體而言，重要海洋致病弧菌除了導(dǎo)致宿主免疫組織極顯著的血液循環(huán)障礙，同時(shí)也導(dǎo)致淋巴細(xì)胞發(fā)生凋亡、壞死性損傷，各亞群構(gòu)成平衡也相應(yīng)被打破，從而進(jìn)一步破壞機(jī)體免疫力.因此，弧菌感染對(duì)機(jī)體免疫組織細(xì)胞的破壞作用，可能導(dǎo)致感染后期發(fā)生免疫抑制，進(jìn)一步加重繼發(fā)感染.提示在弧菌感染后的診治過程中，有必要進(jìn)行相關(guān)免疫指標(biāo)監(jiān)測(cè)，考慮從免疫學(xué)角度探尋提高其診治療效的新手段.

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Study on the effects of Vibrio vulnificus infection on host immune system

FU Kai-Fei，LIU Jian-Fei，WANG Yu-Xiao，WU Cheng-Lin，QIN Ke-Wei，ZHOU Li-Jun
Center for Basic Medical Science，Navy General Hospital，Beijing 100048，China

AIM：To study the effect of Vibrio vulnificus，an im?portant marine pathogen，on immune organs and tissues of mice，so that to provide new ideas for effective diagnosis and treatment of infection.METHODS：BALB/c mice were infected with suble?thal doses of Vibrio vulnificus，then the pathological changes of the spleen and gut associated lymphoid tissues were observed with mi?croscopy，and the lymphocyte necrosis/apoptosis and lymphocyte subsets distribution changes of application in peripheral blood and spleen were detected by flow cytometry.On the basis of synthetic Vibrio vulnificus cytolysin（VVC），the lymphocyte damage from main toxicity factor of Vibrio vulnificus were tested with the cell counting Kit?8（CCK?8）cytotoxic experiment.RESULTS：There were obvious structural changes in the spleen and intestinal related lymphatic tissues of mice after Vibrio vulnificus infection，and the bleeding/congestion was obvious，and the lymphocytes appeared to be fragmentation and necrosis.After Vibrio vulnificus infection，the dominant lymphocyte damage in the peripheral blood and spleen was apoptosis，and the lymphocyte subset lost the normal proportion，more specifically，the number of CD4＋T cell group decreased significantly，the proportion of CD4＋/CD8＋T cells also significantly reduced（P＜0.05）.In vitro cytotoxicity test also showed that a certain concentration of VVC could significantly re?duce the survival rate of lymphocytes（P＜0.01）.CONCLUSION：Vibrio vulnificus infection can cause significant damages to the host immune tissue cells，which may lead to immunosuppression in the later stages of infection and further aggravate secondary infection.

Vibrio vulnificus；immune tissue；Vibrio vulnificus cytolysin；lymphocyte；flow cytometer detection

R378.3

A

2017－08－29；接受日期：2017－09－10

國(guó)家自然科學(xué)基金（31400107）；軍隊(duì)醫(yī)藥衛(wèi)生重點(diǎn)課題（BHJ14J004）

付凱飛.博士.E?mail：fukaifei＠sina.com

周麗君.博士，研究員.研究方向：抗體工程學(xué)、細(xì)胞與分子免疫學(xué).E?mail：hzzhoulj＠126.com

2095?6894（2017）10?16?04