酶聯(lián)免疫吸附法在飼料安全檢測中的應用

古麗娜孜·海如拉 庫來汗·巴依多拉

新疆維吾爾自治區(qū)獸藥飼料監(jiān)察所，烏魯木齊830063

酶聯(lián)免疫吸附法（Enzyme linked immunosorbent assay，ELISA）自問世以來，以其高特異性、高靈敏度、操作簡便等優(yōu)勢廣泛應用于飼料、食品、生物和醫(yī)藥檢測，且實驗可重復，結(jié)果可定量定性判斷，對檢測人員技術(shù)要求較低，為國際認可且廣泛應用的一類大批量樣本檢測技術(shù)。隨著飼料安全問題關(guān)注度日益增高，ELISA 檢測方法也逐漸應用到飼料及飼料添加劑的檢測當中，為化學藥物、有害毒素和微生物檢測提供便利。

1 當前飼料安全中存在的問題

當前我國飼料安全中存在的問題主要包括6點：1）飼料中私自或使用性激素類（如甲基睪丸酮）、鎮(zhèn)靜類（如氯丙嗪）或皮質(zhì)激素類（地塞米松）等違禁藥物；2）不按照使用量或不按規(guī)定添加飼料添加劑；3）不按照藥物休藥期規(guī)定停藥或不遵守藥物間的配伍禁忌；4）飼料變質(zhì)發(fā)霉或病原微生物超標；5）飼料及飼料添加劑標識不明確或標識不當?shù)龋?）銷售變質(zhì)或偽劣飼料及飼料添加劑產(chǎn)品。

2 ELISA 在飼料安全檢測中的應用

飼料的安全檢測往往需要在多種復雜基質(zhì)的條件下對受檢樣品中含量非常低的有毒、有害或者違禁添加劑等進行定性或者定量的檢測。我國是一個畜牧產(chǎn)業(yè)大國，對飼料的依賴性較強，因此飼料產(chǎn)品本身也具有流通快以及數(shù)量大等特點，在實際流通與應用中選擇一種快捷、方便、靈敏度和準確度高，并且價格便宜的檢測手段對飼料進行安全性檢測非常重要。當前飼料安全檢測中最常用的一套程序為：初篩（即取得該飼料樣品是否存在某種有毒有害物質(zhì)的初步信息）→檢測（即對樣本進行分離以及定量分析的過程）→確認分析（對是否存在的有毒有害物質(zhì)進行確認，即定性分析）。ELISA 檢測方法的靈敏度高，操作簡便，對設(shè)備的要求較低，易于使用，并且檢測速度快，可在短時間內(nèi)得到檢測的結(jié)果，適用于流通性強的飼料安全性檢測，基于ELISA 檢測法的眾多優(yōu)勢，其已經(jīng)被廣泛地用于飼料安全檢測中，對飼料中是否含有有毒、有害物質(zhì)，違禁藥品以及其他添加劑進行快速的篩檢。

2.1 檢測飼料中的鹽酸克倫特羅

鹽酸克倫特羅是一種可提高食用家畜瘦肉率的“瘦肉精”，我國于2000年明確提出在飼養(yǎng)過程中嚴禁飼喂鹽酸克倫特羅，但仍有養(yǎng)殖戶私自濫用，人類攝入過量后會損害體內(nèi)臟器，并出現(xiàn)心慌、惡心、嘔吐甚至中毒癥狀。

孫明君等[1]利用間接競爭ELISA 方法檢測飼料中鹽酸克倫特羅殘留情況，發(fā)現(xiàn)該方法的最低檢測限為0.05 ng/mL，與萊克多巴胺的交叉反應率為7.75%，證明ELISA 檢測技術(shù)具有快速、簡便優(yōu)勢，可廣泛應用于進出口飼料這類大批量現(xiàn)場檢測。賀健強等[2]利用ELISA 方法、液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法（LC-MSMS）對動物飼料中鹽酸克倫特羅和萊克多巴胺進行檢測，發(fā)現(xiàn)ELISA 在初步快速篩查時具有一定優(yōu)勢，不僅能準確定性，還能提供定量參考，與LC-MSMS 檢測方法相比，ELISA 是一種適合大量樣本篩查飼料“瘦肉精”的檢測方法。

2.2 檢測飼料中的沙門氏菌

沙門氏菌是一類血清型和種類繁多的病原菌，傳統(tǒng)檢測方法為細菌培養(yǎng)和生化鑒定，但是該方法耗時長，且假陽性較多，而ELISA 檢測方法是一類準確性較高的檢測方法。斑點酶聯(lián)免疫吸附法（Dot-ELISA）在傳統(tǒng)ELISA 檢測試驗基礎(chǔ)上，將原有的聚苯乙烯微量反應板更換為纖維素膜，此種改進可以增強抗原或抗體對載體的粘附度，所需檢材少，操作簡便，結(jié)果可讀性高，通過顏色斑點有無或色澤可判斷定性和定量結(jié)果。

韓志輝等[3]利用Dot-ELISA 對飼料廠100 份成品飼料進行檢測，結(jié)果發(fā)現(xiàn)飼料中沙門氏菌陽性檢出率為38%，同時和常規(guī)的分離鑒定技術(shù)相比，發(fā)現(xiàn)Dot-ELISA 檢測方法具有較高的符合率，數(shù)值可達82.23%，該結(jié)果表明ELISA 檢測方法也具有較高的準確率和特異性，在多飼料樣本沙門氏菌的檢測中可廣泛應用。雷風[4]利用Dot-ELISA 檢測魚粉中是否含有沙門氏菌，檢測發(fā)現(xiàn)64 份魚粉為沙門氏菌陽性樣品（總樣品數(shù)為85 份），其檢出率為75.29%，而常規(guī)分離培養(yǎng)檢出53 份沙門氏菌樣品，Dot-ELISA 和常規(guī)分離培養(yǎng)符合率為78.13%，2 種不同檢測方法不具有明顯差異性，表明Dot-ELISA具有較高的準確性，檢測結(jié)果可作為飼料病原微生物判斷結(jié)果。

2.3 檢測飼料中的黃曲霉毒素

黃曲霉毒素衍生物類型較多，其中黃曲霉毒素B1 的毒性和致癌性最為突出，動物和人類食用后會出現(xiàn)嚴重的中毒癥狀，并向癌癥發(fā)展，因此對飼料中黃曲霉毒素的檢測具有重要意義。

陳琛等[5]利用ELISA 和高效液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用（HPLC-MS）分別檢測玉米飼料中的黃曲霉毒素B1 含量，結(jié)果發(fā)現(xiàn)用ELISA 檢出樣品為陽性，用HPLC-MS 檢測也為陽性，比較2 個實驗的用時、成本和準確度，得出ELISA 檢測具有較高準確度，且操作簡便，用時短，可適用于飼料中黃曲霉毒素B1含量的快速大量篩選，若要確證結(jié)果，可結(jié)合HPLC-MS 進行精準定量。馬俊等[6]利用ELISA 和薄層色譜法（TLC）分別檢測飼料中黃曲霉毒素B1 含量，ELISA 回收率為在94.0%～105.0%，而TLC 回收率為84.6%～90.08%，雖然TLC 檢測方法的抗干擾能力強，但前期樣本處理步驟繁瑣，且獲得的回收率和精密度不如ELISA，因此對于飼料中曲霉毒素B1 的檢測，ELISA 方法更具有優(yōu)勢。

3 ELISA 檢測的實驗條件

ELISA 檢測方法屬于超微量級別的分析技術(shù)，其檢測范圍在ng 和pg 水平之間，因此在實驗過程中對各種試劑、物料以及不同實驗步驟的反應條件和實驗者的操作等均有嚴格的要求。

3.1 對試劑及物料的條件要求

進行ELISA 檢測實驗使用的試劑可分為主體試劑和輔助性試劑兩類。現(xiàn)在ELISA 檢測實驗中常使用的ELISA 商品試劑盒中包括了已經(jīng)被包被的抗體微孔板、酶標記物的濃縮液、標準液以及酶基質(zhì)、發(fā)色劑和停止液等足夠進行96 個測量的主體試劑及使用的物料。實驗者在使用ELISA 試劑盒進行檢測時必須嚴格按照試劑盒所附說明書進行操作，并且在一次檢驗中必須使用同一批號的與試劑盒相對應的試劑，嚴禁使用過期的試劑或者物料。在一次實驗中沒有使用完的試劑以及微孔板應置于2～8 ℃的溫度下進行密封保存，且不可重復使用微量孔。制備緩沖液、洗滌液以及樣本稀釋液等輔助性試劑時，應采取現(xiàn)用現(xiàn)配的原則。進行ELISA實驗，對實驗所用的蒸餾水的要求非常高，不合格的蒸餾水會導致實驗失敗的幾率增加，使空白值升高，實驗者應使用新鮮的雙蒸餾水來進行實驗試劑的制備。

3.2 對操作步驟的條件要求

在ELISA 實驗正式開始前，實驗人員應該提前將試劑盒與待檢測的樣品等置于20～25 ℃的環(huán)境中進行回溫，在實驗過程中，不同的樣品以及不同的試劑均應該使用一次性的單獨吸嘴，避免造成交叉污染，導致實驗失敗。在加樣時則應注意操作的準確度，將樣品加入至孔底，并且不能有氣泡出現(xiàn)。在進行孵育培養(yǎng)時，由于ELISA 試驗通常情況下都存在二次抗原抗體的反應，實驗者應注意各ELISA 條板溫度的迅速平衡性。當實驗室溫度超過20 ℃時，實驗人員可將ELISA 板置于避光的試驗臺上，以方便隨時觀測。在進行ELISA 試驗的洗滌步驟時應提高警惕，洗滌的程度決定著整個試驗的成敗，由于洗滌的目的是將反應液中未與固相的抗體或者抗原結(jié)合的其他物質(zhì)，以及實驗反應過程中的一些非特異性吸附在固相載體上的干擾性物質(zhì)去除，如果反應板洗滌得不徹底，尤其是在最后一次中有酶結(jié)合物等非特異性的吸附物，則會導致空白值升高[1]。同時在洗板添加蒸餾水時應該將移液槍頭的尖端置于微板孔的上方1 cm 左右的位置，將蒸餾水打出，切忌將板孔中的液體濺到或者接觸到移液槍頭上。

4 結(jié) 語

綜上所述，ELISA 是一種超微量檢測和分析方法，因此實驗操作中要嚴格按照說明書步驟操作，每次試驗必須應用同批次、有效期內(nèi)的試劑，確保結(jié)果準確。蒸餾水在ELISA 檢測中具有重要意義，若水質(zhì)不符合要求，可能會出現(xiàn)假陽性或增高空白值，因此檢測過程中要保證各個試劑符合實驗要求，同時檢測人員要配戴無菌手套，以免交叉污染。