糖尿病型牙周炎牙齦組織中炎癥因子表達(dá)及與細(xì)胞凋亡關(guān)系

陳鐵樓 張新海 徐爾理 唐大海 趙海軍 徐逸敏 張曉莉 欒瑋 劉進(jìn) 陳駿 馬麗婷

糖尿病型牙周炎牙齦組織中炎癥因子表達(dá)及與細(xì)胞凋亡關(guān)系

陳鐵樓 張新海 徐爾理 唐大海 趙海軍 徐逸敏 張曉莉 欒瑋 劉進(jìn) 陳駿 馬麗婷

目的探討糖尿病型牙周炎(diabetes associated periodontitis，DAP)牙齦組織中凋亡細(xì)胞發(fā)生及與IL-1β和TNFα表達(dá)的關(guān)系。方法納入DAP患者和健康齦(H)受試者各20 例，用HE染色和Tunnel法觀察牙齦細(xì)胞凋亡，透射電鏡觀察凋亡細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)；用免疫組化(IHC)檢測(cè)牙齦組織炎癥因子IL-1β和TNFα表達(dá)。結(jié)果DAP組牙齦上皮棘細(xì)胞層和基底細(xì)胞層見(jiàn)明顯細(xì)胞凋亡，固有層凋亡細(xì)胞較少；DAP組牙齦上皮棘細(xì)胞和基底細(xì)胞凋亡百分率高于H 組(P<0.01)；IHC染色發(fā)現(xiàn)DAP組IL-1β和TNFα表達(dá)明顯高于H組,主要陽(yáng)性表達(dá)細(xì)胞為巨噬細(xì)胞、漿細(xì)胞和淋巴細(xì)胞。結(jié)論DAP患者牙齦組織中IL-1β和TNFα在細(xì)胞凋亡中起重要作用。

細(xì)胞凋亡； 糖尿病型牙周炎(DAP)； 炎癥因子； 機(jī)制

糖尿病型牙周炎(diabetes associated periodontitis，DAP)可因血糖升高和糖耐量降低引起機(jī)體對(duì)牙周局部刺激因子抵抗力降低，出現(xiàn)牙齦炎癥、牙槽骨吸收和組織愈合緩慢[1]。糖尿病患者發(fā)生牙周炎危險(xiǎn)性比非糖尿病者高2.8～3.4 倍[2]。研究發(fā)現(xiàn)，在糖尿病高糖狀態(tài)時(shí)可影響牙周炎凋亡相關(guān)蛋白表達(dá),并可通過(guò)調(diào)節(jié)凋亡相關(guān)蛋白表達(dá)促進(jìn)胰島細(xì)胞凋亡和胰島分泌功能,影響牙周炎發(fā)生和發(fā)展，老年患者牙周炎牙齦組織中凋亡細(xì)胞增加[3]。白細(xì)胞介素1β(IL-1β)可刺激人牙周韌帶細(xì)胞中膠原酶合成，誘導(dǎo)基質(zhì)金屬蛋白酶13(MMP-13)表達(dá)，調(diào)控人成骨細(xì)胞擴(kuò)增和凋亡，MMP-13在牙周組織愈合和牙槽骨再生中起一定作用[4]。本文通過(guò)對(duì)DAP齦組織中IL-1β和TNFα分泌細(xì)胞、含量及與細(xì)胞凋亡和臨床指標(biāo)關(guān)系分析，以探討IL-1β和TNFα與DAP牙齦細(xì)胞凋亡關(guān)系。

1 材料與方法

1.1 病例選擇

DAP組20 例，年齡55～76 歲,平均69.5 歲，男11 例，女9 例，要求患者附著喪失(attachment loss，AL)大于5 mm，牙槽骨吸收大于根長(zhǎng)1/2；患者空腹血糖7.0 mmol/L，口服葡萄糖耐量2 h≥11.1 mmol/L[5]；健康組(H組)20 例，年齡13～18 歲,平均15.2 歲，男12 例，女8 例，AL為0，為正畸拔除牙。受檢者無(wú)心血管疾病及遺傳病，就診前6 月內(nèi)未做牙周治療，3 個(gè)月內(nèi)未用抗生素及免疫抑制劑，婦女未妊娠。

1.2 主要試劑

兔抗IL-1β抗體和TNFα抗體(南京凱基生物科技有限公司)，免疫組化(IHC)SABC試劑盒(武漢博士德生物工程有限公司)，DAB顯色劑(北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司)。

1.3 樣本采集

拔牙時(shí)，腭側(cè)取牙齦組織，一部分立即放入4%甲醛固定作HE染色、Tunul染色和IHC染色；另一部分用4%多聚甲醛固定制作電鏡標(biāo)本。

1.4 指標(biāo)測(cè)定

1.4.1 臨床指標(biāo)測(cè)定 拔牙前測(cè)定SBI，GI，刻度探針測(cè)定PD和AL。

1.4.2 HE染色和TUNNEL染色法檢測(cè)凋亡細(xì)胞

取經(jīng)4%甲醛固定24 h牙齦組織，石蠟包埋切5 μm切片。①HE染色觀察牙齦上皮和固有層細(xì)胞凋亡情況；②Tunnel 染色觀察凋亡細(xì)胞比率，細(xì)胞凋亡陽(yáng)性表達(dá)位于細(xì)胞核，陽(yáng)性染色為棕黃色或褐色，每張切片陽(yáng)性細(xì)胞計(jì)數(shù)標(biāo)準(zhǔn)相同。高倍鏡(×40)下，用10×10網(wǎng)格分別對(duì)牙齦上皮陽(yáng)性細(xì)胞和視野下細(xì)胞總數(shù)計(jì)數(shù)，每張切片觀察5 個(gè)視野，計(jì)算基底層和棘層凋亡陽(yáng)性細(xì)胞表達(dá)百分率,PI=陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)/細(xì)胞總數(shù)×100%。

1.4.3 IL-1β和TNFα的IHC染色和顯微分光光度計(jì)定量 對(duì)固定包埋牙齦組織，5 μm連續(xù)切片,脫蠟,3%過(guò)氧化氫孵育，滴加山羊血清封閉非特異性抗體，加一抗(1∶100)，4 ℃冰箱過(guò)夜。滴加生物素標(biāo)記二抗、辣根酶標(biāo)記鏈霉卵白素工作液，室溫孵育各15 min；DAB顯色，蘇木素復(fù)染，固定封片；以PBS代替一抗做空白對(duì)照。陽(yáng)性細(xì)胞胞質(zhì)內(nèi)見(jiàn)黃褐色顆粒，高倍鏡下每切片選5 個(gè)視野，計(jì)數(shù)200 個(gè)細(xì)胞中陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)，計(jì)算陽(yáng)性細(xì)胞率=陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)/細(xì)胞總數(shù)×100%。

用MPV-3 型顯微分光光度計(jì)對(duì)IHC染色切片測(cè)定牙齦上皮層和固有層IL-1β和TNFα表達(dá)量，測(cè)定方法參照陳鐵樓[6]方法。

1.4.4 透射電鏡觀察[7]將4%多聚甲醛固定牙齦組織脫水和樹(shù)脂包埋，常規(guī)超薄切片，醋酸鈾、枸櫞酸鉛染色，透射電鏡觀察。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

用SPSS 13.0軟件分析，2 組間比較采用兩樣本t檢驗(yàn)和方差分析，P<0.05為有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 牙周臨床指標(biāo)

DAP組SBI，GI，PD，AL均高于H組(P<0.01，表 1)。

注： 與H組比, ①P<0.01

2.2 HE染色結(jié)果

DAP組牙齦上皮釘突增生并連接呈網(wǎng)狀，上皮層基底細(xì)胞和棘細(xì)胞凋亡細(xì)胞較多(圖 1A)，固有層大量炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)，以巨噬細(xì)胞和淋巴細(xì)胞多見(jiàn)。膠原纖維排列紊亂，部分纖維斷裂、水腫變性，血管增生；H組牙齦上皮未見(jiàn)明顯細(xì)胞凋亡，固有層炎細(xì)胞少，膠原纖維排列整齊(圖 1B)。

2.3 超微結(jié)構(gòu)變化

DAP組凋亡細(xì)胞核固縮與胞質(zhì)分離出現(xiàn)間隙，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)疏松形成空泡，細(xì)胞質(zhì)濃縮，線粒體腫脹(圖 1C)，嚴(yán)重時(shí)胞膜內(nèi)陷形成凋亡小體。H組膠原纖維排列整齊，成纖維細(xì)胞內(nèi)線粒體和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)未見(jiàn)明顯水腫和變性，無(wú)明顯核固縮(圖 1D)。

2.4 TUNEL結(jié)果

DAP組陽(yáng)性細(xì)胞位于基底細(xì)胞層和棘細(xì)胞層，染為強(qiáng)陽(yáng)性(圖 1E)，陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)明顯多于H組(圖 1F)；DAP組牙齦上皮層凋亡細(xì)胞指數(shù)(57.9%)顯著高于H組(25.3%,表 2)。

圖 1 2 組牙齦組織中凋亡細(xì)胞 (A、D： ×400； C： ×600； F： ×200)

Fig 1 Cell apoptosis of human gingival tissue of the 2 groups (A，D： ×400； C： ×600； F： ×200)

表 2 2 組牙齦上皮層凋亡細(xì)胞率比較

Tab 2 Comparison of apoptosis cell ratio in gingival epithelium between 2 groups

(±s，%)

注： ①與H組比,P<0.01

注： ①與H組比，P<0.01

2.5 IHC染色定量

DAP組牙齦固有層IL-1β和TNFα染色均顯示強(qiáng)陽(yáng)性，陽(yáng)性細(xì)胞為巨噬細(xì)胞、漿細(xì)胞和淋巴細(xì)胞(圖 2A～C)，TNFα在上皮基底細(xì)胞層也有陽(yáng)性細(xì)胞(圖 2C)；H組炎細(xì)胞少，IHC染色I(xiàn)L-1β和TNFα呈陰性(圖 2D)或弱陽(yáng)性。根據(jù)Lamber-Beer定律，組織中IL-1β和TNFα含量可用吸光度值來(lái)反映，DAP組牙齦組織中IL-1β和TNFα吸光度值明顯大于H組(表 3)。

圖 2 IHC染色測(cè)定2 組牙齦IL-1β和 TNFα表達(dá) (×200)

Fig 2 IL-1β and TNFα expression in human gingival tissue examined by IHC staining (×200)

3 討 論

Kerr[8]于1972 年首次提出細(xì)胞凋亡為細(xì)胞收縮和核濃縮，伴有特異蛋白降解。據(jù)報(bào)道，伴放線放線桿菌可導(dǎo)致牙齦上皮細(xì)胞凋亡[9],牙齦卟啉菌產(chǎn)生蛋白酶可誘導(dǎo)牙齦成纖維細(xì)胞凋亡[10]。本研究發(fā)現(xiàn)，DAP組牙齦上皮層基底細(xì)胞和棘細(xì)胞凋亡，牙齦組織凋亡細(xì)胞比率明顯大于對(duì)照組；電鏡發(fā)現(xiàn)凋亡細(xì)胞體積變小，線粒體腫脹，胞膜內(nèi)陷，核染色體固縮，表明DAP牙齦上皮細(xì)胞出現(xiàn)明顯凋亡。

Alikhani[11]報(bào)道，細(xì)菌脂多糖在TNFα作用下可增加Caspase-8活性，促進(jìn)成纖維細(xì)胞凋亡。牙齦卟啉單胞菌侵入牙齦上皮2h時(shí)，凋亡促進(jìn)蛋白Bax瞬時(shí)增加。牙周厭氧菌能激活人單核細(xì)胞產(chǎn)生IL-1β，刺激成纖維細(xì)胞產(chǎn)生膠原酶和前列腺素E2，誘導(dǎo)骨吸收。炎癥時(shí)中性粒細(xì)胞浸潤(rùn)和激活,合成和釋放TNFα和IL-1β增多，促進(jìn)炎癥反應(yīng)。糖尿病長(zhǎng)期高血糖導(dǎo)致活性氧族生成,直接損傷牙周組織或胰島β細(xì)胞,激活氧化應(yīng)激敏感信號(hào)通路,包括NF-kB、蛋白激酶C(protein kinase C,PKC)等通路,導(dǎo)致TNFα等炎性細(xì)胞因子產(chǎn)生并激活膠原酶和破骨細(xì)胞引起牙周組織破壞[12]。本研究發(fā)現(xiàn)DAP牙齦固有層IL-1β和TNFα表達(dá)增強(qiáng)，主要陽(yáng)性細(xì)胞為巨噬細(xì)胞、漿細(xì)胞、淋巴細(xì)胞；牙齦IL-1β和TNFα表達(dá)與SBI和GI顯著正相關(guān)。

我們知道，IL-1β和TNFα為炎癥細(xì)胞因子可促進(jìn)炎細(xì)胞浸潤(rùn)，正反饋調(diào)節(jié)炎癥因子加重牙周炎。He等[13]將牙眼葉啉單胞菌接種于糖尿病小鼠顱骨發(fā)現(xiàn)糖尿病組新骨形成被抑制。AI-Mashat等[14]報(bào)道，糖尿病可增加前凋亡基因表達(dá)和caspase活性，促進(jìn)成纖維細(xì)胞和成骨細(xì)胞凋亡，引起DAP牙周組織破壞。DAP長(zhǎng)期高血糖導(dǎo)致高級(jí)糖基化終產(chǎn)物增加，通過(guò)絲裂原活化蛋白激酶刺激細(xì)胞凋亡與細(xì)胞表面受體結(jié)合導(dǎo)致IL-1β和TNFα分泌，促進(jìn)成纖維細(xì)胞凋亡，影響牙周組織修復(fù)[15]。本組資料表明DAP細(xì)胞凋亡和炎癥組織破壞與組織中IL-1β和TNFα過(guò)表達(dá)相關(guān)。

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Therelationshipbetweeninflammatoryfactorexpressionandcellapoptosisingingivaltissueofthesubjectswithdiabetesassociatedperiodontitis

CHENTielou1,ZHANGXinhai1,XUErli2,TANGDahai3，ZHAOHaijun1,XUYimin1，ZHANGXiaoli4,LUANWei1,LIUJin1,CHENJun1,MALiting1.

1. 200081Shanghai,DepartmentofPeriodontal,OralResearchCenterofPLA, 2.DepartmentofEndocrinology, 3.DepartmentofMedicalLaboratory, 4.DepartmentofPathology,Hospital411ofPLA,China

Objective: To study the relationship between IL-1β and TNFα expression and cell apoptosis in gingival tissue of the subjects with diabetes associated periodontitis(DAP).Methods20 cases of DAP(group DAP) and 20 cases of health controls(group H) were included. The cell apoptosis and the ultrastructural changes in gingival tissue were observed by Tunnel staining and transmission electron microscope(TEM). IL-1β and TNFα expression in gingival tissue were detected by immunohistochemical staining. SBI, GI，PD and AL of the subjects were measured. The relationship between the level of IL-1β，TNFα and the cell appotosis was analyzed.ResultsApoptosis was obvious in prickle cells and basal cells of gingival tissue of DAP group. The percentage of apoptosis cells of DAP group was significantly higher than that of group H(P<0.01). The expression of IL-1β and TNFα in group DAP was significant higher than that of group H(P<0.01), and the mainly positive expression cells were macrophages, plasmocytes and lymphocytes.ConclusionIL-1β and TNFα play a role in cell apoptosis in the gingival tissue of the patients with DAP.

Cellapoptosis；Diabetesassociatedperiodontitis(DAP)；Inflammatorycytokine;Mechanism

總后面上項(xiàng)目(編號(hào)： CHJ13J035)； 上海市衛(wèi)計(jì)委項(xiàng)目(編號(hào)： 20134418)； 上海市區(qū)重點(diǎn)課題(編號(hào)： 1002-04)； 上海市區(qū)面上課題(編號(hào)： 1503-31)

200081 上海， 解放軍411醫(yī)院全軍口腔中心牙周科(陳鐵樓 張新海 趙海軍 徐逸敏 欒瑋 劉進(jìn) 陳駿 馬麗婷)， 內(nèi)分泌科(徐爾理)， 醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)科(唐大海)， 病理科(張曉莉)

陳鐵樓 021-81867179 E-mail: chentielou2010@sina.com

R780.2

A

10.3969/j.issn.1001-3733.2017.04.019

(收稿： 2016-10-12 修回： 2017-03-04)