粉紅黏帚霉W-21對灰葡萄孢的抑菌活性

楊蕊,趙瑞麗,郎劍鋒,陸寧海,石明旺

粉紅黏帚霉W-21對灰葡萄孢的抑菌活性

楊蕊1,趙瑞麗2,郎劍鋒1,陸寧海1,石明旺1

（1.河南科技學(xué)院資源與環(huán)境學(xué)院,河南新鄉(xiāng)453003；2.河南科技學(xué)院新科學(xué)院,河南新鄉(xiāng)453003）

為研究粉紅黏帚霉W-21菌株對灰葡萄孢的抑菌活性,采用PDA平板和水瓊脂對峙培養(yǎng)法測定粉紅黏帚霉W-21菌株的抑菌作用,采用扣皿法測定揮發(fā)性代謝產(chǎn)物的抑菌作用,采用含毒介質(zhì)法測定發(fā)酵液的抑菌作用,測定了孢子懸浮液對灰葡萄孢菌核萌發(fā)的抑制作用.結(jié)果表明：灰葡萄孢菌落擴展受到明顯抑制,W-21菌株寄生病菌菌絲,導(dǎo)致菌絲細胞原生質(zhì)體顆?；?、潰解；孢子懸浮液對菌核萌發(fā)具有較強的抑制作用,浸泡24 h,菌核萌發(fā)率為2.2%；JM發(fā)酵液對病菌菌絲生長具有抑制作用,且第9天的抑菌活性最好,菌絲生長抑制率為60%；揮發(fā)性代謝產(chǎn)物對灰葡萄孢菌絲生長有一定的影響.

粉紅黏帚霉W-21；灰葡萄孢；抑菌活性

黏帚霉（Gliocladium spp.）是一類分布廣泛的土壤習(xí)居菌,在已知的30多個種中,粉紅黏帚霉（G.roseum）、綠色黏帚霉（G.virens）和鏈孢黏帚霉（G.catenulatum）具有較大的生防潛力.粉紅黏帚霉是一類重要的重寄生真菌[1],能夠侵染核盤菌（Sclerotinia sclerotiorum）[2]、禾谷鐮刀菌（Fusarium graminearum）[3]、立枯絲核菌（Rhizoctonia solanii）[4]、灰葡萄孢（Botrytis cinerea）[5]等多種植物病原真菌.因其具有分布廣泛、寄主范圍廣、寄生能力強及作用機理多樣等優(yōu)點,其生防作用日益受到人們的關(guān)注.

灰葡萄孢引起植物灰霉?。╣ray mould disease）,其寄主廣泛,危害葡萄、蔬菜、瓜果以及觀賞性植物等多種植物,造成巨大的經(jīng)濟損失[6-7].目前,生產(chǎn)上對灰霉病仍采取以化學(xué)防治為主的防治對策.由于化學(xué)防治所帶來的環(huán)境污染、農(nóng)藥殘留以及病菌抗藥性等問題,使得灰霉病的生物防治逐漸引發(fā)人們的關(guān)注.國外早已有綠黏帚霉（G.virens）鏈孢黏帚霉（G.catenulatum）（Primasto的商品化制劑問世.雖然粉紅黏帚霉極具生防潛力,但由于其貨架期和穩(wěn)定性等問題,至今還無大規(guī)模生產(chǎn)和應(yīng)用.目前,國內(nèi)大多數(shù)處于拮抗菌的篩選、鑒定和室內(nèi)生測等實驗室研究階段,尚未見商品化制劑的應(yīng)用報道.W-21菌株分離自被粉紅黏帚霉寄生的灰葡萄孢菌核,為研發(fā)灰霉病的高效粉紅黏帚霉生防制劑,筆者在此前的工作基礎(chǔ)上,從W-21菌株對灰葡萄孢菌絲生長、菌核萌發(fā)的影響,揮發(fā)性代謝產(chǎn)物、發(fā)酵液的抑菌活性等方面展開研究,以期探究此菌株的生防機理,評估其生防潛力,為高效生物農(nóng)藥的研發(fā)和應(yīng)用提供理論依據(jù).

1 材料與方法

1.1 試驗材料

1.1.1 供試菌株 粉紅黏帚霉菌株W-21和番茄灰霉病菌均由河南科技學(xué)院植物病理學(xué)實驗室分離和保存.

1.1.2 培養(yǎng)基 本研究中使用的培養(yǎng)基包括以下4種：

馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基（potatodextrose agar,簡稱PDA）：去皮馬鈴薯200 g,葡萄糖20 g,瓊脂20 g,蒸餾水1 000 mL,121℃滅菌25 min備用.

馬鈴薯葡萄糖液體培養(yǎng)基（potatodextrosebroth,簡稱PDB）：馬鈴薯200g,葡萄糖20g,蒸餾水1000mL,121℃滅菌25 min備用.

水瓊脂培養(yǎng)基（water agar,簡稱WA）：瓊脂20 g,蒸餾水1 000 mL.

JM液體培養(yǎng)基：淀粉30 g,蛋白胨2 g,蒸餾水1 000 mL.

1.2 試驗方法

1.2.1 W-21對灰葡萄孢菌絲生長的抑制作用測定 分別采用PDA平板對峙法和2%水瓊脂（WA）玻片對峙法測定W-21對灰葡萄孢菌絲生長的影響.具體方法分別為：PDA平板（直徑9 cm）接種新鮮培養(yǎng)的W-21菌餅（直徑5 mm）,25℃恒溫培養(yǎng)4 d后,接種病菌菌餅（直徑5 mm）,菌餅中心相距5 cm,以僅接病菌平板為對照,3次重復(fù).25℃恒溫培養(yǎng)3～5 d,逐日觀察菌落生長情況并鏡檢；將少量2%WA倒入放有無菌載玻片的培養(yǎng)皿中,以在載玻片上形成一層水瓊脂薄膜為好,待WA冷卻凝固后,載玻片一端先接種W-21菌餅（直徑5 mm）,25℃恒溫培養(yǎng)3 d后,載玻片另一端接種病菌菌餅,6次重復(fù).25℃恒溫培養(yǎng),逐日觀察并鏡檢.

1.2.2 W-21對灰葡萄孢菌核萌發(fā)的抑制作用測定 W-21菌株P(guān)DA平板培養(yǎng)7 d,無菌水洗脫孢子,血球計數(shù)板調(diào)節(jié)孢子懸浮液至每mL含孢子約1×107個）,將PDA平板培養(yǎng)15 d的病菌菌核置于孢子懸浮液中,分別浸泡0.5、2、24、48和72 h,以無菌水浸泡相應(yīng)時間為對照,每處理15個菌核,3次重復(fù).分別在設(shè)定時間后取出菌核,移植到PDA平板,25℃培養(yǎng)48 h后,取樣觀察菌核萌發(fā)數(shù),計算菌核萌發(fā)率.

1.2.3 W-21發(fā)酵液的抑菌作用測定 采用含毒介質(zhì)法測定W-21不同培養(yǎng)基發(fā)酵液的抑菌活性.將直徑5 mm的W-21菌餅分別接種至JM和PDB液體培養(yǎng)基上,150 r/min、30℃振蕩培養(yǎng)6、9和12 d后分別取樣,培養(yǎng)物經(jīng)2層擦鏡紙過濾,4 000 r/min離心15 min,上清液分別經(jīng)0.45 μm、0.22 μm濾膜過濾,收集無菌發(fā)酵液,-20℃保存?zhèn)溆?將發(fā)酵液以20%比例（V/V）與50℃左右的PDA混合搖勻倒皿,制成含藥平板.平板中央接種灰葡萄孢菌餅（直徑5 mm）,以無菌水與PDA混合為對照,3次重復(fù).各平板25℃培養(yǎng)48 h后測定病菌菌落直徑,計算菌絲生長抑制率.菌絲生長抑制率/%=（對照菌落直徑-處理菌落直徑）/對照菌落直徑×100[9].

1.2.4 W-21揮發(fā)性代謝產(chǎn)物的抑菌作用測定 采用扣皿法[10],將新鮮培養(yǎng)的W-21菌餅（直徑5 mm）接種至PDA平板上,25℃恒溫培養(yǎng),待菌落直徑達到5 cm時,在上方蓋上雙層圓形無菌濾紙（直徑10 cm）,再在濾紙上方扣上已接種病菌菌餅的PDA平板（撤去培養(yǎng)皿蓋,直徑9 cm）,用透明膠帶固定密封好.以未接種W-21的PDA平板和只接種病菌的平板對扣處理為對照,3次重復(fù).25℃恒溫培養(yǎng),逐日觀察并測量病菌菌落直徑.

1.3 數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析

采用SAS 8.0軟件中的方差分析程序（ANOVA）分析上述試驗處理間的差異顯著性.灰葡萄孢萌發(fā)百分率和菌絲生長抑制百分率數(shù)據(jù)在分析之前先進行反正弦轉(zhuǎn)換,變成角度值,分析結(jié)束后再將平均值轉(zhuǎn)換成正常的百分率數(shù)值.采用Duncan氏新復(fù)極差法比較處理之間的差異.

2 結(jié)果和分析

2.1 W-21對灰葡萄孢菌絲生長的抑制作用

粉紅黏帚霉W-21對灰葡萄孢菌絲生長的抑制作用見圖1,對灰葡萄孢的重寄生作用見圖2.

圖1 粉紅黏帚霉W-21對灰葡萄孢菌絲生長的抑制作用Fig.1 Inhibition effect ofGliocladium roseum strain W-21 on the mycelial growth ofBotrytis cinerea

圖2 粉紅黏帚霉W-21對灰葡萄孢的重寄生作用Fig.2 MycoparasitismofGliocladium roseum strain W-21 toBotrytis cinerea

由圖1可知,粉紅黏帚霉W-21菌株對灰葡萄孢菌絲生長具有明顯的抑制作用,PDA平板對峙培養(yǎng)5 d后,對照病菌菌落平均半徑達到55.7 mm,而處理病菌菌落平均半徑為28.3 mm,t檢驗結(jié)果表明,處理與對照間存在極顯著性差異（P=0.001 6）.由圖2的水瓊脂玻片對峙結(jié)果可知,灰葡萄孢菌落生長受到抑制,產(chǎn)生明顯的抑菌帶,菌落邊緣褐變,且隨著培養(yǎng)時間的延長,逐漸被W-21菌株菌落所覆蓋.顯微觀察也發(fā)現(xiàn),W-21對灰葡萄孢具有重寄生作用,其菌絲纏繞寄生灰葡萄孢菌絲.正?；移咸焰呔z質(zhì)地均勻,而受到W-21作用的灰葡萄孢菌絲出現(xiàn)細胞原生質(zhì)顆?；⒔猬F(xiàn)象.

2.2 W-21對灰葡萄孢菌核萌發(fā)的抑制作用

W-21對灰葡萄孢菌核萌發(fā)的抑制效果見圖3.

圖3 W-21對灰葡萄孢菌核萌發(fā)的抑制作用Fig.3 Inhibition effect ofGliocladium roseum strain W-21 on germination ofBotrytis cinerea sclerrotia

由圖3可知,W-21菌株分生孢子懸浮液對灰葡萄孢菌核的萌發(fā)具有較強的抑制作用.灰葡萄孢菌核經(jīng)W-21分生孢子液浸泡不同時間后,PDA平板培養(yǎng)48 h觀察發(fā)現(xiàn),對照菌核萌發(fā)率為100%,而W-21 分生孢子液浸泡 0.5、2、24、48、72 處理,菌核萌發(fā)率依次為 100%、66.7%、20%、2.2%、0%、0%.各個處理間存在顯著性差異（P＜0.05）；孢子液浸泡2 h與24 h、48 h、72 h處理間差異顯著；孢子液浸泡菌核24 h與48 h、72 h處理間無顯著差異.W-21分生孢子液浸泡菌核24 h,菌核萌發(fā)率僅有2.2%,浸泡48 h以上,菌核不萌發(fā),且隨著培養(yǎng)時間的延長,菌核被W-21菌株寄生,腐爛、潰解.

2.3 W-21發(fā)酵液的抑菌作用

W-21菌株JM和PDB發(fā)酵液對灰葡萄孢抑菌作用測定結(jié)果如圖4所示：

圖4 W-21發(fā)酵液對灰葡萄孢菌絲生長的影響（48 h）Fig.4 Effect ofcultural filtrate ofGliocladium roseum strain W-21 on the mycelial growth ofBotrytis cinerea

PDB發(fā)酵液的抑菌活性低于JM發(fā)酵液.JM培養(yǎng)液培養(yǎng)6、9、12 d的發(fā)酵液對灰葡萄孢菌絲生長的抑制率分別為3%、60%、30%,其中發(fā)酵9 d的濾液抑菌率最高.PDB培養(yǎng)6、9、12 d的發(fā)酵液對灰葡萄孢菌絲生長的抑制率分別為26%、15%、18.6%,其中發(fā)酵6 d的濾液抑菌率最高.

2.4 W-21揮發(fā)性代謝產(chǎn)物的抑菌作用

W-21揮發(fā)性代謝產(chǎn)物抑菌測定結(jié)果見表1.

表1 W-21揮發(fā)性代謝產(chǎn)物對灰葡萄孢菌絲生長的影響Tab.1 Effect ofvolatile metabolites ofGliocladiumroseumstrain W-21 on the mycelial growth of Botrytis cinerea

由表1可知：共培養(yǎng)1 d,對照灰葡萄孢菌落平均直徑為44.7 mm,處理菌落平均直徑為24.3 mm,二者之間差異顯著；共培養(yǎng)2 d,對照（灰葡萄孢菌落平均直徑63 mm）與處理（菌落平均直徑57.7 mm）差異不顯著；3 d后,無論是對照還是處理平板,灰葡萄孢均已長滿平板.這表明W-21揮發(fā)性代謝產(chǎn)物對灰葡萄孢菌絲有一定程度的毒害效應(yīng),但無致死作用.

3 結(jié)論與討論

營養(yǎng)競爭和重寄生被認為是粉紅黏帚霉防治灰霉病的主要機制[10].本試驗結(jié)果表明,粉紅黏帚霉W-21菌株對灰葡萄孢菌絲生長和菌核萌發(fā)具有明顯的抑制作用.研究中發(fā)現(xiàn),粉紅黏帚霉W-21菌株菌落逐步覆蓋灰葡萄孢菌落,灰葡萄孢菌絲被W-21菌株菌絲纏繞,導(dǎo)致菌絲生長異常、潰解.W-21孢子懸浮液處理過的灰葡萄孢菌核的萌發(fā)受到抑制,且隨著處理時間的延長,菌核萌發(fā)率明顯下降.粉紅黏帚霉可以寄生核盤菌菌核,該菌孢子24 h內(nèi)可侵入大部分核盤菌菌核,導(dǎo)致菌核腐爛潰解[2].本研究中也發(fā)現(xiàn),W-21菌株寄生灰葡萄孢菌核,孢子懸浮液浸泡菌核24 h后,菌核萌發(fā)率僅有2.2%.真菌重寄生菌產(chǎn)生葡聚糖酶、幾丁質(zhì)酶和蛋白酶等多種細胞壁降解酶作用真菌的細胞壁.粉紅黏帚霉寄生核盤菌菌核過程可能涉及多種細胞壁降解酶的參與,葡聚糖酶可能是粉紅黏帚霉67-1菌株寄生核盤菌菌核的關(guān)鍵酶[2].粉紅黏帚霉W-21菌株寄生灰葡萄孢菌核過程,是否存在多種細胞壁降解酶的作用,還有待于進一步研究確認.

粉紅黏帚霉還可以通過抗菌物質(zhì)來抑制灰霉病的發(fā)生.本研究中發(fā)現(xiàn),W-21不同培養(yǎng)基發(fā)酵液影響抗菌物質(zhì)的產(chǎn)生,JM培養(yǎng)物濾液的抑菌活性高于PDB培養(yǎng)物濾液.W-21發(fā)酵液抑菌活性成分以及最佳發(fā)酵條件,還有待于做進一步的研究.W-21菌株揮發(fā)性代謝產(chǎn)物對灰葡萄孢菌絲生長具有不穩(wěn)定的抑制作用,揮發(fā)性代謝產(chǎn)物雖對灰葡萄孢菌絲的生長有一定的影響,但最終無法抑制菌落的擴展.

粉紅黏帚霉W-21菌株對灰葡萄孢菌絲和菌核具有較強的重寄生作用,發(fā)酵液、揮發(fā)性代謝產(chǎn)物也具有抑菌活性,這說明W-21對灰葡萄孢引起的灰霉病具有良好的生防潛力.今后,將進一步展開W-21菌株防病效果的測定以及在自然界中的消長動態(tài),為W-21菌株生防制劑的研發(fā)和推廣應(yīng)用提供理論依據(jù).

[1]SCHROERS H J,SAMUELS G J,SEIFERT K A,et al.Classification of the mycoparasite Gliocladium roseum in Clonostachys as C.rosea,its relationship toBionectria ochroleuca,and notes on other Gliocladium-like fungi[J].Mycologia,1999,91（2）：365-385.

[2]張擁華,高會蘭,馬桂珍,等.粉紅黏帚霉67-1菌株寄生核盤菌研究[J].植物病理學(xué)報,2004,34（3）：211-214.

[3]楊蕊,郎劍鋒,陸寧海,等.粉紅黏帚霉對玉米莖基腐病的抑菌防病作用[J].河南科技學(xué)院學(xué)報（自然科學(xué)版）,2016,44（5）：28-33.

[4]馬桂珍,王淑芳,暴增海,等.粉紅黏帚霉67-1菌株對水稻紋枯病的抑菌防病作用研究[J].作物雜志,2011（6）：77-80.

[5]趙士振.粉紅黏帚霉防治果蔬灰霉病的研究[D].武漢：華中農(nóng)業(yè)大學(xué),2015：3-5.

[6]WILLIAMSON B,TUDZYNSKI B,TUDZYNSKI P,et al.Botrytis cinerea：The cause of grey mould disease[J].Molecular Plant Pathology,2007,8（5）：561-580.

[7]白曉蒙,靜大鵬,李雙民,等.不同培養(yǎng)條件對秦皇島地區(qū)葡萄灰霉病菌菌絲生長的影響[J].河北科技師范學(xué)院學(xué)報,2016,30（1）：30-34.

[8]鄭錦.綠色黏帚霉對玉米大斑病生物防治研究[D].雅安：四川農(nóng)業(yè)大學(xué),2011：10.

[9]王秀平,齊慧霞,溫曉蕾.氧化石墨烯對葡萄灰霉病菌（Botrytis cinerea）和炭疽病菌（Colletortrichum gloeosporioides）的離體抑菌活性[J].河北科技師范學(xué)院學(xué)報,2016,30（3）：45-48,54.

[10]NOBRE S A M,MAFFIA L A,MIZUBUTI E S G,et al.Selection of Clonostachys rosea isolates from Brazilian ecosystems evective in controllingBotrytis cinerea[J].Biological Control,2005,34（2）：132-143.

Antifungal activities of Gliocladium roseum strain W-21 to Botrytis cinerea

YANG Rui1,ZHAO Ruili2,LANG Jianfeng1,LU Ninghai1,SHI Mingwang1
（1.School ofResources and Environmental Sciences,Henan Institute ofScience and Technology,Xinxiang453003,China；2.Xinke College,Henan Institute ofScience and Technology,Xinxiang 453003,China）

The purpose of this study was to evaluate the antifungal activities of Gliocladium roseum strain W-21 to Botrytis cinerea.Confrontation culture in PDA and WA plate were used to test the inhibitory effect of W-21 on mycelial growth of B.cinerea.Dish buckle and toxic media was used to test the inhibitory effect of volatile metabolites and cultural filtrates,respectively.Conidia suspension was used to test the inhibitory effect on germination of sclerotia.The results showed that the colony expansion of B.cinerea was inhibited in confrontation culture plates,and the hyphae were parasitized by W-21.The inhibited mycelia of B.cinerea showed severe abnormal symptoms including cytoplasma granulation and outward leakage,cellular swelling and collapse.The germination of sclerotia was significantly suppressed by conidia suspension of W-21,after incubation for 24 h,the rate was only 2.2%.Volatile metabolites had some inhibitory effect on mycelial growth of B.cinerea.The mycelial growth of B.cinerea were suppressed by the JM cultural filtrate,especially on 9th day,mycelial growth inhibition rate was 60%.

Gliocladium roseum strain W-21；Botrytis cinerea；antifungal activities

S476

A

1008-7516（2017）05-0032-05

10.3969/j.issn.1008-7516.2017.05.006

2017-09-30

河南省教育廳高等學(xué)校重點科研項目（17A210006）

楊蕊（1980—）,女,河南新鄉(xiāng)人,碩士,講師.主要從事植物病害生物防治方面的研究.

（責(zé)任編輯：鄧天福）