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    犬瘟熱病例消化系統(tǒng)的病理形態(tài)學(xué)研究

    2017-11-11 02:22:34劉志科潘耀謙張秋雨楊寧寧陳創(chuàng)夫
    關(guān)鍵詞:犬瘟熱二甲苯胰島

    劉志科,潘耀謙,張秋雨,楊寧寧,陳創(chuàng)夫

    犬瘟熱病例消化系統(tǒng)的病理形態(tài)學(xué)研究

    劉志科1,潘耀謙2,張秋雨2,楊寧寧1,陳創(chuàng)夫1

    (1.石河子大學(xué)動物科技學(xué)院,新疆石河子832003;2.河南科技學(xué)院動物科學(xué)學(xué)院,河南新鄉(xiāng),453003)

    為了解犬瘟熱病例消化系統(tǒng)的病理變化發(fā)生過程和機(jī)制,對3例自然感染犬瘟熱的藏獒病例進(jìn)行了臨床觀察和病理學(xué)研究.采取病犬胃、腸、肝臟、胰腺等組織器官,按照石蠟組織切片制作技術(shù)進(jìn)行切片.經(jīng)H.E染色、PAS糖原染色以及免疫ABC染色后觀察,可以清晰地觀察到細(xì)胞核與細(xì)胞質(zhì)的形態(tài)變化以及細(xì)胞漿出現(xiàn)的包涵體.結(jié)果顯示:這些病例的消化系統(tǒng)出現(xiàn)了嚴(yán)重病變.肝臟水腫,中央靜脈和竇狀隙擴(kuò)張,淋巴管擴(kuò)大且管腔內(nèi)含大量絲狀蛋白,肝細(xì)胞嚴(yán)重變性,在細(xì)胞漿內(nèi)或核內(nèi)有包涵體存在;胃腸道黏膜上皮細(xì)胞壞死,部分胞漿呈空泡狀,黏膜上皮腫脹、脫落,淋巴細(xì)胞浸潤;胰腺萎縮,H.E染色可見胰島細(xì)胞變性,細(xì)胞核濃縮.犬瘟熱病毒對消化器官的入侵,可發(fā)生明顯的機(jī)能障礙變化,這些病變?yōu)樘骄咳翢岬陌l(fā)病機(jī)制、診斷和預(yù)防工作奠定了基礎(chǔ).

    犬瘟熱;消化系統(tǒng);臨床癥狀;病理組織學(xué);發(fā)病機(jī)制

    犬瘟熱(canine distemper,CD),俗稱犬瘟,是由犬瘟熱病毒引起的犬科,特別是3~12月齡的幼犬的一種急性、高度接觸性、敗血性傳染病,該病發(fā)病率高,死亡率也極高,是犬病中致死性最高的傳染病[1-3].病毒主要侵害呼吸系統(tǒng)、消化系統(tǒng)和神經(jīng)系統(tǒng)[4].發(fā)病早期以雙相熱,并伴隨急性鼻卡他、支氣管炎和肺炎,以及非化膿性腦炎脊髓炎為特征;后期可見神經(jīng)癥狀出現(xiàn),如痙攣、抽搐[5-6].部分病例腳底表皮化膿和結(jié)痂.經(jīng)調(diào)查發(fā)現(xiàn)犬瘟熱常與犬細(xì)小病毒病、犬傳染性肝炎、肺炎、寄生蟲性腸炎(如小袋蟲、球蟲、隱孢子蟲)等伴發(fā)[7-9].此外有研究表明,犬瘟熱病毒與人類的麻疹病毒同樣屬于副黏病毒科,關(guān)系非常密切,在臨床診斷和病理組織學(xué)上的變化特征也頗為相似.在麻疹康復(fù)患者的血清中可以檢測到犬瘟熱病毒中和抗體,而麻疹患者在麻疹中和抗體增高的同時,犬瘟熱抗體效價隨之增高[10].并且大量研究發(fā)現(xiàn)人的佩吉特氏骨病可由犬瘟熱病毒所致.此病不僅嚴(yán)重影響犬類養(yǎng)殖業(yè)的經(jīng)濟(jì)效益,而且影響公共衛(wèi)生學(xué).近年來,有不同物種的動物出現(xiàn)犬瘟熱病例報(bào)道,一些靈長類動物和小熊貓也發(fā)生感染,從而引起更多學(xué)者的廣泛研究和關(guān)注[11].本文以自然感染犬瘟熱的病犬為試驗(yàn)對象,對患病犬消化系統(tǒng)的臨床癥狀、剖檢病變和組織病理學(xué)變化進(jìn)行了系統(tǒng)研究,旨在為進(jìn)一步探討犬瘟熱的發(fā)病機(jī)理、判斷預(yù)后和臨床用藥等方面提供理論依據(jù).

    1 材料與方法

    1.1 試驗(yàn)病料

    病料采自自然感染犬瘟熱病毒的3只藏獒幼犬,同窩生,3月齡.

    1.2 儀器與試劑

    光學(xué)顯微鏡、熒光顯微鏡均購于德國ZEISS公司;組織切片機(jī)購于德國Leica公司;生物組織包埋機(jī)購于浙江省金華市益迪醫(yī)療設(shè)備廠;二甲苯、無水乙醇、蘇木精、伊紅、三氯化鐵、麗春紅、磷鉬酸、光綠、冰醋酸、高碘酸、希夫試劑、亞硫酸氫鹽等均購于北京索萊寶科技有限公司.

    1.3 試驗(yàn)方法

    1.3.1 石蠟切片制作、染色與顯微觀察 解剖死亡病例,取胃、腸、肝和胰臟等組織,先用體積分?jǐn)?shù)為10%的甲醛溶液進(jìn)行固定,然后脫水、透明、浸蠟、包埋、切片,再用蘇木精-伊紅(H.E)染色、PAS糖原染色和免疫組化ABC法染色,最后在顯微鏡下進(jìn)行觀察.

    H.E染色:二甲苯Ⅰ(10 min)→二甲苯Ⅱ(10 min)→100%乙醇(2 min)→90%乙醇(2 min)→80%乙醇(2 min)→70%乙醇(2 min)→蘇木精(10 min)→1%鹽酸乙醇(30 s)→伊紅(30 s)→70%乙醇(2 min)→80%乙醇(2 min)→90%乙醇(2 min)→100%乙醇(2 min)→二甲苯Ⅰ(10 min)→二甲苯Ⅱ(10 min)→樹膠封片.

    PAS糖原染色:二甲苯Ⅰ(10min)→二甲苯Ⅱ(10min)→100%乙醇Ⅰ(2min)→100%乙醇Ⅱ(2 min)→95%乙醇(2min)→85%乙醇(2min)→75%乙醇(2min)→高碘酸(5min)→蒸餾水洗→Schiff試劑(25min)→自來水洗→亞硫酸氫鹽Ⅰ(2 min)→亞硫酸氫鹽Ⅱ(2 min)→亞硫酸氫鹽Ⅲ(2 min)→自來水(10 min)→蒸餾水洗(2 min)→蘇木精(5 min)→藍(lán)化(10 min)→95%乙醇(2 min)→100%乙醇Ⅰ(2 min)→100%乙醇Ⅱ(2 min)→二甲苯Ⅰ(10 min)→二甲苯Ⅱ(10 min)→樹膠封片.

    免疫ABC染色:二甲苯Ⅰ(10min)→二甲苯Ⅱ(10min)→100%乙醇Ⅰ(2min)→100%乙醇Ⅱ(2min)→95%乙醇(2 min)→85%乙醇(2 min)→75%乙醇(2 min)→30 mL/L甲醇過氧化氫(10 min)→檸檬酸緩沖液,高壓滅菌(20 min)→滴加山羊血清→滴加一抗(4℃冰箱孵育)→充分水洗→滴加被標(biāo)記的二抗(30 min)→充分水洗→DAB顯色→蘇木精復(fù)染→95%乙醇(2 min)→100%乙醇Ⅰ(2 min)→100%乙醇Ⅱ(2 min)→二甲苯Ⅰ(10 min)→二甲苯Ⅱ(10 min)→樹膠封片.

    1.3.2 大體病變觀察 先對死亡病例用肉眼進(jìn)行大致觀察,注意患犬外觀變化,尤其是口、肛門等部位的變化.然后再仔細(xì)觀察剖檢時各組織器官的變化,注意消化系統(tǒng)的病變特征,如胃、腸、肝和胰臟的變化.

    2 結(jié)果與分析

    2.1 眼觀變化

    臨床癥狀:多數(shù)病例首先表現(xiàn)出精神委頓,體溫升高,咳嗽、厭食和嘔吐,呈癲癇樣癥狀,眼、鼻流漿液性分泌物,在1~2 d內(nèi)轉(zhuǎn)變?yōu)槟撔苑置谖?呼吸加快.病初為干咳,后轉(zhuǎn)為濕咳,呼吸困難,嚴(yán)重時發(fā)生腹瀉并混有血液.

    剖檢病變:患犬被毛粗亂,尸體消瘦,剖檢后可見黏膜蒼白、肌肉色淡、血液稀薄,病變部位主要在消化系統(tǒng)、呼吸系統(tǒng)和神經(jīng)系統(tǒng),尤以消化系統(tǒng)的病變最為嚴(yán)重[12].胃腸道黏膜有彌漫性的針尖狀的出血點(diǎn),消化道黏膜呈暗紅色,肝臟呈淡紅色,輕微腫大、質(zhì)地脆弱.胰腺腫大,出血.胃腸內(nèi)容物空虛,點(diǎn)狀出血(圖1-a).腸道出血(圖1-b),呈出血性卡他性腸炎(圖1-c),腸系膜淋巴結(jié)腫脹,膀胱內(nèi)壁出血,腸道淋巴結(jié)衰竭.

    圖1 犬瘟熱剖檢病變癥狀觀察Fig.1 Observation ofpathological changes ofcanine distemper

    2.2 病理組織學(xué)變化

    胃:杯狀細(xì)胞增多,胃幽門部的杯狀細(xì)胞增多尤為明顯,胃黏膜表面黏液增多,含大量糖原顆粒,PAS反應(yīng)為陽性;黏膜充血水腫,有的甚至壞死脫落[13].胃腺上皮細(xì)胞腫脹壞死,部分胞漿溶解出現(xiàn)空泡.

    腸道:黏膜下層淋巴細(xì)胞浸潤,在胞漿內(nèi)可見到包涵體[5],腸絨毛內(nèi)含大量細(xì)菌團(tuán)塊,H.E染色時呈藍(lán)色[14].胞質(zhì)中可見未分化細(xì)胞的包涵體,腺腔內(nèi)存在大量的病原體、脫落的上皮細(xì)胞和炎性細(xì)胞(圖2-a),部分腺上皮從基質(zhì)膜脫落,落入管腔,呈管套狀,固有膜可見嗜中性白細(xì)胞浸潤.出血性壞死性纖維素性腸炎,血管破裂,紅細(xì)胞大量逸出,黏膜局灶性壞死,細(xì)胞核崩解,腸淋巴小結(jié)疏松,淋巴小結(jié)頂端黏膜壞死,形成潰瘍,腸上皮細(xì)胞大面積變性、壞死、脫落,細(xì)胞核消失,毛細(xì)血管擴(kuò)張、充血、出血,部分血管壞死,纖維素凝固在血管周圍(圖2-b),腸腺細(xì)胞壞死(圖2-c和2-d).

    圖2 腸道組織的H.E染色Fig.2 H.E stainingofintestinal tissue

    肝臟:肝小葉結(jié)構(gòu)紊亂,肝臟彌漫性瘀血,肝竇擴(kuò)張(圖3-a),竇內(nèi)有大量紅細(xì)胞積聚.有的肝細(xì)胞輕度萎縮(圖3-b),腫脹、出現(xiàn)脂肪變性和顆粒變性,呈空泡狀,細(xì)胞核溶解,肝細(xì)胞內(nèi)及各級膽管中有大量膽色素沉著[13].肝臟瘀血嚴(yán)重、變形和壞死,竇狀隙有大量的紅細(xì)胞積聚,形成黃疸[4].

    圖3 肝臟組織的H.E染色Fig.3 H.E stainingofliver tissue

    胰腺:胰島整體變小,散在分布,胰島細(xì)胞變少(圖4-a),細(xì)胞的邊界不明顯,細(xì)胞核濃縮,發(fā)生退行性變性.胰島瘀血(圖4-b),細(xì)胞質(zhì)模糊不完整但細(xì)胞核清晰可見,胰島內(nèi)血管內(nèi)皮細(xì)胞出現(xiàn)脂肪變性,呈空泡狀.動脈管壁外膜增厚,內(nèi)皮細(xì)胞的細(xì)胞膜增厚.

    圖4 胰腺組織的H.E染色Fig.4 H.E stainingofpancreatic tissue

    胰腺充血,胰腺內(nèi)存在大量空泡和囊泡,胰腺細(xì)胞內(nèi)有大量糖原顆粒蓄積,PAS反應(yīng)呈陽性,見圖5.

    圖5 胰腺組織的PAS染色Fig.5 PASstainingofpancreatic tissue

    2.3 免疫ABC法

    通過免疫ABC染色,胃腺的分泌上皮細(xì)胞、胃腸的基底顆粒細(xì)胞、小腸絨毛中的柱狀細(xì)胞、大腸黏膜上皮中的杯狀細(xì)胞、散在于上皮細(xì)胞之間的內(nèi)分泌細(xì)胞和集合淋巴小節(jié)的淋巴細(xì)胞反應(yīng)均呈陽性[15].此外,在斷裂的腸絨毛和脫落上皮內(nèi)的陽性反應(yīng)也較明顯,含大量病毒顆粒,見圖6.

    圖6 免疫ABC染色Fig.6 Immunization with ABCstaining

    3 討論

    3.1 感染犬瘟熱所引起的腹瀉與病犬死亡的關(guān)系

    犬瘟熱病毒屬于負(fù)鏈RNA病毒,有囊膜,對上皮細(xì)胞和淋巴細(xì)胞有很強(qiáng)的親嗜性,改變細(xì)胞的顯微結(jié)構(gòu),出現(xiàn)炎癥反應(yīng),導(dǎo)致體溫升高,引起犬食欲不振,逐漸轉(zhuǎn)為食欲廢絕[16].由于消化機(jī)能紊亂,胃腸黏膜壞死,上皮脫落,往往導(dǎo)致消化吸收障礙.感染初期常出現(xiàn)便秘,不久便轉(zhuǎn)為腹瀉,由于胃腸道內(nèi)大量杯狀細(xì)胞增生,分泌大量黏液,并混雜有壞死脫落的消化道上皮細(xì)胞、中性白細(xì)胞、單核細(xì)胞等,此外腸道微血管常常破裂,所以糞便中含大量黏液,有惡臭,有時混有血液和氣泡.腹瀉嚴(yán)重者可導(dǎo)致機(jī)體脫水和酸中毒,長期可導(dǎo)致重度營養(yǎng)不良,酸中毒可使毒素在胃腸道聚集,進(jìn)而導(dǎo)致體溫升高[17].有時在病患交界處,健康處血管擴(kuò)張充血,而患處腸腺腺腔內(nèi)壞死脫落的上皮細(xì)胞產(chǎn)生大量毒素,毒素可被臨近擴(kuò)張的血管吸收,進(jìn)而導(dǎo)致自體中毒,嚴(yán)重的還可使患犬昏迷.由于血紅蛋白水平下降,血液中的紅細(xì)胞數(shù)量減少,進(jìn)而引起貧血表現(xiàn),甚至可出現(xiàn)營養(yǎng)不良性水腫.由于腹瀉引起血管破裂,黏膜壞死,引起腸道菌群失調(diào),繼而引發(fā)細(xì)菌感染,犬瘟熱病毒侵嗜淋巴細(xì)胞,降低機(jī)體免疫機(jī)能,嚴(yán)重的可引起患犬死亡.

    3.2 胰腺病變與血糖含量的關(guān)系

    可能由于病毒在胰臟內(nèi)寄生,導(dǎo)致胰腺萎縮,胰島整體減小,并散在存在,胰島細(xì)胞減少,細(xì)胞變性.胰島中主要有胰島A細(xì)胞和胰島B細(xì)胞,分別分泌胰高血糖素和胰島素,維持血糖濃度平衡[18].使血糖含量升高的激素不止胰高血糖素,還有甲狀腺激素和腎上腺素等,而胰島素則是唯一的降低血糖濃度的激素[19].當(dāng)胰島素與細(xì)胞膜上的相應(yīng)受體結(jié)合后,就啟動了細(xì)胞內(nèi)部一系列的變化,使細(xì)胞膜的葡萄糖通道打開,將細(xì)胞外的葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)到細(xì)胞內(nèi),再把葡萄糖變成“糖原”的形式儲存起來,從而使血糖降低.當(dāng)血糖降低時,胰高血糖素動員體內(nèi)脂肪和蛋白質(zhì)分解,所以剖檢時病犬尸體消瘦,被毛較亂.由于胰島受損,胰島素含量降低,使血糖濃度高于腎糖閾,臨床上出現(xiàn)糖尿,血液檢查時血糖含量較高.此外,由于胰腺發(fā)生退行性病變,使胰液的分泌量減少,也可導(dǎo)致消化吸收障礙.

    3.3 腸淋巴細(xì)胞與黏膜免疫的關(guān)系

    腸消化道淋巴組織中的淋巴細(xì)胞構(gòu)成機(jī)體免疫的第一道防線,可以抵御消化道內(nèi)的病原體入侵.胃腸道激素與消化道淋巴組織共同組成一個復(fù)雜的免疫系統(tǒng),分泌免疫球蛋白[20].黏膜免疫由廣泛分布于機(jī)體的胃腸道、呼吸道和泌尿道等淋巴組織構(gòu)成,其中起主要作用的細(xì)胞是M細(xì)胞.犬瘟熱病毒對淋巴細(xì)胞和上皮細(xì)胞親嗜性較強(qiáng).犬瘟熱病毒首先侵襲機(jī)體的靶器官是分布于淋巴系統(tǒng)各組織的器官[21],犬瘟熱病毒易于在淋巴細(xì)胞細(xì)胞內(nèi)增殖,引起淋巴細(xì)胞損傷,T細(xì)胞對絲裂原反應(yīng)與B細(xì)胞抗體生成機(jī)能明顯下降.對病犬進(jìn)行病理組織學(xué)檢查時,發(fā)現(xiàn)其免疫系統(tǒng)嚴(yán)重受損,其中腸上皮固有層淋巴細(xì)胞明顯萎縮,淋巴小結(jié)數(shù)量減少、體積縮小,導(dǎo)致免疫抑制,黏膜抵抗力下降,導(dǎo)致腸黏膜壞死,如果引起細(xì)菌繼發(fā)感染,會出現(xiàn)白細(xì)胞增多,導(dǎo)致發(fā)熱、腹瀉、脫水,甚至自體中毒.

    4 結(jié)論

    研究通過對自然感染的藏獒病例進(jìn)行臨床和病理學(xué)診斷,采取了典型的病變組織臟器制作石蠟切片,進(jìn)行H.E染色、PAS糖原染色和免疫ABC染色觀察,發(fā)現(xiàn)細(xì)胞核濃縮嚴(yán)重,腸絨毛內(nèi)含大量的藍(lán)色細(xì)菌團(tuán)塊,在網(wǎng)狀內(nèi)皮系統(tǒng)和腎盂上皮細(xì)胞內(nèi)有嗜酸性包涵體形成.研究結(jié)果充實(shí)了犬瘟熱組織病料學(xué)研究內(nèi)容,為犬瘟熱病確診和發(fā)病機(jī)制研究奠定了一定的科學(xué)理論基礎(chǔ).

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    Pathomorphological research about the digestive system of canine distemper

    LIU Zhike1,PAN Yaoqian2,ZHANG Qiuyu2,YANG Ningning1,CHEN Chuangfu1
    (1.College ofAnimal Science and Technology,Shihezi University,Shihezi 832003,China;2.College ofAnimal Science,Henan Institute ofScience and Technology,Xinxiang453003,China)

    In order to understand the pathological changes,process and mechanism of digestive system in canine distemper,the clinical observation and pathological study of 3 cases of Tibetan mastiff infected with canine distemper were carried out.The stomach,intestines,liver,pancreas and other tissues of the diseased dog were taken and sliced according to the technique of paraffin section.After H.E staining,PAS staining and ABC staining,the morphological changes of the nucleus and cytoplasm and the inclusion bodies of the cytoplasm were observed.The results showed severe digestive disease in these cases.Liver edema,central vein and sinusoidal dilatation,lymphatic lumen expansion,and contains a large number of filamentous protein,liver cells had serious degeneration,inclusion bodies in the cytoplasm or nucleus;gastrointestinal mucosal epithelial cell necrosis,cytoplasmic vacuoles appeared,epithelial swelling and shedding of lymphocytes.Pancreatic atrophy and H.E staining showed islet degeneration and nuclear condensation.The invasion of canine distemper virus into the digestive organs could lead to obvious dysfunction.These series of lesions have laid the foundation for the study of the pathogenesis,diagnosis and prevention of canine distemper.

    canine distemper;digestive system;clinical symptoms;histopathology;pathogenesis

    S852.65

    A

    1008-7516(2017)05-0048-06

    10.3969/j.issn.1008-7516.2017.05.009

    2017-05-15

    西部地區(qū)高發(fā)人獸共患傳染性疾病防治協(xié)同創(chuàng)新項(xiàng)目(2013-179)

    劉志科(1989―),男,河南新鄉(xiāng)人,碩士研究生.主要從事基礎(chǔ)獸醫(yī)學(xué)研究.

    陳創(chuàng)夫(1962―),男,廣東揭西人,博士,教授,博士生導(dǎo)師.主要從事人畜共患病研究.

    (責(zé)任編輯:盧奇)

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