桿狀病毒LEF-11蛋白自身相互作用關(guān)鍵區(qū)域的鑒定

蔣亞明，董戰(zhàn)旗，陳婷婷，胡楠，董非凡，黃亮，唐良彤，潘敏慧

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桿狀病毒LEF-11蛋白自身相互作用關(guān)鍵區(qū)域的鑒定

蔣亞明1，董戰(zhàn)旗1，陳婷婷1，胡楠1，董非凡1，黃亮1，唐良彤2，潘敏慧1

（1西南大學(xué)農(nóng)業(yè)部蠶桑生物學(xué)與遺傳育種重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，重慶400716；2重慶農(nóng)業(yè)機(jī)械化學(xué)校，重慶404000）

家蠶核型多角體病毒（nucleopolyhedrovirus，BmNPV）是蠶業(yè)上最常見且危害最為嚴(yán)重的病原微生物之一，其晚期表達(dá)因子（late expression factor，lef）LEF-11對(duì)病毒的增殖具有重要作用，相關(guān)研究證明LEF-11蛋白能夠發(fā)生自身相互作用形成寡聚體，本研究通過逐步截短探究LEF-11蛋白自身相互作用的關(guān)鍵區(qū)域。利用雙分子熒光互補(bǔ)（bimolecular fluorescence complementation）技術(shù)和熒光定位（fluorescent co-location）技術(shù)，首先根據(jù)BmNVP及各個(gè)截短片段序列和熒光蛋白序列設(shè)計(jì)引物，通過PCR技術(shù)擴(kuò)增回收得到所有片段以及熒光標(biāo)簽片段，并且通過限制性內(nèi)切酶處理回收后，將熒光標(biāo)簽片段分別連接到昆蟲細(xì)胞表達(dá)載體pIZ/V5-His上，構(gòu)建pIZ-DsRed和pIZ-EGFP質(zhì)粒，然后用相同方法構(gòu)建LEF-11全長(zhǎng)和逐步截短的LEF-11紅色熒光融合蛋白載體，分別與pIZ-LEF11-GFP共同轉(zhuǎn)染到家蠶BmN-SWU1細(xì)胞中，更換普通培養(yǎng)基48 h后固定細(xì)胞并制片，最后在熒光共聚焦顯微鏡下觀察熒光融合蛋白表達(dá)及定位情況，鑒定LEF-11蛋白自身相互作用的關(guān)鍵區(qū)域；熒光雙分子互補(bǔ)試驗(yàn)相關(guān)載體的構(gòu)建步驟與熒光融合表達(dá)載體構(gòu)建方法一致，轉(zhuǎn)染處理及熒光觀察方法也相同。桿狀病毒LEF-11蛋白2—61和62—112端均能與LEF-11蛋白全長(zhǎng)發(fā)生相互作用，分別共定位于細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞核；逐步截短過程中，LEF-11蛋白N-端2—61、12—61、22—61、32—61、42—61和2—51均能與LEF-11蛋白全長(zhǎng)共同定位于細(xì)胞質(zhì)中，但其52—61、2—41未發(fā)生共定位；C-端截短片段能夠與LEF-11蛋白全長(zhǎng)發(fā)生共定位的有62—112、72—112、82—112、72—101和72—91，但92—112和72—81區(qū)域未發(fā)現(xiàn)共定位現(xiàn)象；雙分子熒光互補(bǔ)試驗(yàn)結(jié)果驗(yàn)證LEF-11蛋白N-端片段與LEF-11蛋白全長(zhǎng)相互作用的有2—61、12—61、22—61、32—61、42—61、2—51，而2—41、52—61截短突變體則不能，與N-端片段熒光共定位結(jié)果保持一致。鑒定到了桿狀病毒LEF-11蛋白的42-51和82-91區(qū)域?yàn)槠渥陨硐嗷プ饔藐P(guān)鍵區(qū)域，可用于LEF-11相關(guān)功能研究。

家蠶；BmNPV；LEF-11；雙分子熒光互補(bǔ)；自身相互作用

0 引言

【研究意義】桿狀病毒是一類以節(jié)肢動(dòng)物為專一性宿主進(jìn)行感染和傳播的、具有囊膜包裹的雙鏈環(huán)狀DNA病毒，其基因組大小為80—220 kb[1-3]。桿狀病毒分為顆粒型病毒屬（GV）和核型多角體病毒屬（NPV）兩個(gè)屬。根據(jù)病毒生活史中具有兩種不同的病毒粒子形態(tài)，又可分為包埋型的病毒粒子（occlusion-derived virus，ODV）和出芽型的病毒粒子（budded virus，BV），分別介導(dǎo)宿主之間的原發(fā)感染和細(xì)胞之間的繼發(fā)感染[4-5]。病毒基因組相對(duì)其他生物更為簡(jiǎn)單，嚴(yán)格的寄生生活使病毒缺乏新陳代謝所必需的結(jié)構(gòu)，所以病毒需要利用宿主的物質(zhì)和能量才能完成自身生命活動(dòng)[6-9]。桿狀病毒在其生活周期中，基因的表達(dá)屬于級(jí)聯(lián)模式，按表達(dá)時(shí)序可分為極早期基因、早期基因、晚期基因和極晚期基因。晚期基因的表達(dá)有賴于病毒基因組的復(fù)制和轉(zhuǎn)錄，同時(shí)需要一些特殊的蛋白進(jìn)行調(diào)控，即晚期表達(dá)因子（late expression factor，lef）。相關(guān)研究證明LEF-11和病毒DNA復(fù)制相關(guān)，而病毒編碼的小分子蛋白在病毒感染宿主過程中往往需要寡聚化，形成不同程度的寡聚體，以行使不同的功能。因此對(duì)LEF-11蛋白自身相互作用的研究對(duì)于解析桿狀病毒復(fù)制機(jī)制和培育抗病素材具有重要意義?！厩叭搜芯窟M(jìn)展】迄今為止已經(jīng)鑒定了至少19種晚期表達(dá)基因，統(tǒng)稱為基因家族。而此家族基因有些為DNA復(fù)制所必需，有些是在轉(zhuǎn)錄水平上進(jìn)行調(diào)控，所有家族基因均能調(diào)控晚期基因的表達(dá)，是晚期表達(dá)基因的必需因子[10-14]。LEF-11是桿狀病毒編碼的只有112個(gè)氨基酸殘基的小分子蛋白，大小為13.1 kD，除庫蚊核型多角體病毒（nucleopolyhedrovirus，CuniNPV）之外，所有已發(fā)現(xiàn)的桿狀病毒基因組中都存在它的同源基因[15-18]。2002年，Lin等[19]通過敲除試驗(yàn)確定苜蓿銀紋夜蛾核型多角體病毒（multiple nucleopolyhedrovirus，AcMNPV）是病毒DNA復(fù)制必需基因，能夠促進(jìn)晚期基因轉(zhuǎn)錄；2014年，Zhang等[20]在BmNPV中確定LEF-11具有一個(gè)保守的核定位基序，并通過免疫熒光證明LEF-11能夠與病毒DNA復(fù)制中心標(biāo)記物BrdU共定位到一起，更進(jìn)一步確定LEF-11可能在BmNPV DNA復(fù)制過程中起重要作用。此外，相關(guān)研究表明，LEF-11與細(xì)胞核入核受體蛋白importin-3和定位于核內(nèi)病毒DNA復(fù)制位點(diǎn)的病毒復(fù)制因子IE1有相互作用，這都表明LEF-11在病毒復(fù)制過程中扮演極其重要的角色。LEF-11能形成寡聚體，其寡聚體形式對(duì)其行使生理功能具有決定性作用[21]。【本研究切入點(diǎn)】病毒編碼的小分子蛋白LEF-11對(duì)于病毒DNA復(fù)制非常重要，相關(guān)研究表明病毒編碼的一些小分子蛋白以寡聚體的形式行使功能，但LEF-11自身相互作用具體機(jī)制仍不清楚。因此本研究通過逐步截短，鑒定LEF-11蛋白自身相互作用關(guān)鍵區(qū)域?！緮M解決的關(guān)鍵問題】通過對(duì)LEF-11自身相互作用的鑒定，找出關(guān)鍵的結(jié)合區(qū)域，為解析LEF-11功能和應(yīng)用于培育抗病毒品種打下基礎(chǔ)。

1 材料與方法

試驗(yàn)于2016年在西南大學(xué)農(nóng)業(yè)部蠶桑生物學(xué)與遺傳育種重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室完成。

1.1 細(xì)胞和培養(yǎng)基

BmN-SWU1細(xì)胞為西南大學(xué)家蠶基因組生物學(xué)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室保存，用TC-100培養(yǎng)基（United States Biological，Swampscott，MA，USA），添加10%（V/V）胎牛血清（FBS；PAA Laboratories），在27℃條件下恒溫培養(yǎng)。

1.2 質(zhì)粒構(gòu)建

以pIZ/V5-His（Invitrogen，Carlsbad，CA，USA）為空載，通過PCR獲得家蠶核型多角體病毒全長(zhǎng)及各個(gè)截短片段和EGPP、dsRed片段，先通過酶切、連接，構(gòu)建pIZ-DsRed和pIZ-EGFP質(zhì)粒。截短PCR片段包括N-端基因片段：2—61、12—61、22—61、32—61、42—61、52—61和2—41；C-端基因片段：62—112、72—112、82—112、92—112、72—101、72—91和72—81，全長(zhǎng)及所有片段分別通過酶切、連接，構(gòu)建了帶有dsRed標(biāo)簽的質(zhì)粒，同時(shí)全長(zhǎng)構(gòu)建了帶EGFP融合的質(zhì)粒。pBiFC-VC155質(zhì)粒和pBiFC-VN173質(zhì)粒為安徽蚌埠醫(yī)學(xué)院呂合作教授惠贈(zèng)，筆者實(shí)驗(yàn)室保存，相應(yīng)的BiFC載體構(gòu)建方法與熒光載體構(gòu)建方法相同，所有構(gòu)建質(zhì)粒都經(jīng)測(cè)序分析，本研究所用引物見表1。

1.3 轉(zhuǎn)染

將對(duì)數(shù)期生長(zhǎng)的BmN-SWU1細(xì)胞平鋪到有蓋玻片的24孔板中，每孔按單轉(zhuǎn)0.8 μg質(zhì)粒、共轉(zhuǎn)各0.5 μg質(zhì)粒轉(zhuǎn)染，將質(zhì)粒與2.5 μl轉(zhuǎn)染試劑X-tremeGENE HP DNA Transfection Reagent（Roche）分別加到100 μl的無抗生素TC100培養(yǎng)基中，輕柔混勻，室溫孵育30 min后將轉(zhuǎn)染復(fù)合物逐滴加入到細(xì)胞中，于27℃恒溫培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)。

1.4 免疫熒光

按照1.3所述方法轉(zhuǎn)染48 h后，用1×PBST輕洗細(xì)胞3次，每次5 min。加入4%的多聚甲醛溶液，室溫固定15 min，1×PBST同上輕洗。由于本試驗(yàn)所構(gòu)建質(zhì)粒均融合熒光蛋白標(biāo)簽，能在激光條件下發(fā)出熒光，故可不用進(jìn)行免疫一抗、二抗處理。最后取出蓋玻片在Olympus激光共聚焦掃描顯微鏡下觀察拍照。

表1 本試驗(yàn)所用引物

下劃線代表酶切位點(diǎn)The restriction enzyme sites were underlined

1.5 熒光雙分子互補(bǔ)

BiFC載體構(gòu)建方法與1.2一致，構(gòu)建的載體分別命名為pBiFC-VN-LEF-11（aa2—61）、pBiFC-VN- LEF-11（aa12—61）、pBiFC-VN-LEF-11（aa22—61）、pBiFC-VN-LEF-11（aa32—61）、pBiFC-VN-LEF-11（aa42—61）、pBiFC-VN-LEF-11（aa52—61）、pBiFC-VN-LEF-11（aa2—51）和pBiFC-VC-LEF-11；表達(dá)產(chǎn)物簡(jiǎn)寫為VN-LEF-11（2—61）、VN-LEF-11（12—61）、VN-LEF-11（22—61）、VN-LEF-11（32—61）、VN-LEF-11（42—61）、VN-LEF-11（52—61）、VN-LEF-11（2—51）、 VN-LEF-11（2—41）以及VC-LEF-11。將相應(yīng)的VN載體分別與VC載體共同轉(zhuǎn)染到細(xì)胞中，轉(zhuǎn)染48 h后，通過共聚焦顯微觀察是否有黃色熒光激發(fā)。轉(zhuǎn)染和免疫熒光按1.3與1.4所述操作。

2 結(jié)果

2.1 LEF-11蛋白N-端、C-端與LEF-11全長(zhǎng)的相互作用

為探究LEF-11相互作用及其關(guān)鍵區(qū)域，將只有112個(gè)氨基酸殘基的LEF-11蛋白分為N-端LEF-11（2—61）和C-端LEF-11（62—112），并與DsRed融合表達(dá)，分別與pIZ-LEF-11-EGFP共同轉(zhuǎn)入BmN-SWU1細(xì)胞，對(duì)照分別為pIZ-DsRed和pIZ-DsRed-LEF11。結(jié)果顯示各熒光標(biāo)簽融合片段均能夠在細(xì)胞中正常表達(dá)，LEF-11分布于細(xì)胞核內(nèi)。對(duì)照組DsRed蛋白彌散分布于細(xì)胞質(zhì)與細(xì)胞核，與LEF-11-EGFP沒有共定位；LEF-11全長(zhǎng)與N-端、C-端分別共定位在細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞核，表明兩段都含有與全長(zhǎng)發(fā)生共定位的區(qū)域，同時(shí)N-端缺失核定位信號(hào)，無法定位在細(xì)胞核（圖1）。

2.2 LEF-11 N-端自身相互作用關(guān)鍵區(qū)域

上述試驗(yàn)結(jié)果表明LEF-11在N-端具有能與LEF-11全長(zhǎng)發(fā)生共定位的區(qū)域，為找到這個(gè)關(guān)鍵區(qū)域，將N-端按照每次遞減10個(gè)氨基酸殘基逐步截短，與紅色熒光標(biāo)簽DsRed融合，并分別與pIZ-GFP-LEF11共轉(zhuǎn)染BmN-SWU1細(xì)胞，在共聚焦顯微鏡下觀察到各個(gè)截短片段融合熒光標(biāo)簽后，能在細(xì)胞中穩(wěn)定表達(dá)（圖2）。2—61、12—61、22—61、32—61、42—61和2—51均能和全長(zhǎng)共同定位于細(xì)胞質(zhì)中，52—61和2—41則沒有該現(xiàn)象。通過對(duì)比發(fā)現(xiàn)，沒有共定位現(xiàn)象的截短片段缺少42—51區(qū)域，彌散分布，說明該區(qū)域?yàn)镹端自我相互作用關(guān)鍵區(qū)域（圖3）。

圖1 LEF-11-EGFP分別與LEF-11蛋白N-端、C-端熒光共定位

圖2 LEF-11-EGFP分別與LEF-11 N-端各截短片段熒光共定位

圖3 N-端截短相互作用示意圖

2.3 LEF-11 C-端自身相互作用關(guān)鍵區(qū)域

N-端發(fā)生自我相互作用關(guān)鍵區(qū)域已經(jīng)被鑒定，用相同的方法得到C-端截短區(qū)段共7個(gè)，分別命名為L(zhǎng)EF-11（62—112）、LEF-11（72—112）、LEF-11（82—112）、LEF-11（92—112）、LEF-11（72—101）、LEF-11（72—91）和LEF-11（72—81），與DsRed融合后，分別與全長(zhǎng)載體pIZ-GFP-LEF11共轉(zhuǎn)染于BmN-SWU1細(xì)胞，結(jié)果顯示各片段均能正常表達(dá)，其中能與全長(zhǎng)發(fā)生共定位的有5個(gè)：62—112、72—112、82—112、72—101和72—91，而缺少82—91區(qū)域的72—81、92—112卻沒有發(fā)生共聚現(xiàn)象，紅色熒光分布整個(gè)細(xì)胞，呈現(xiàn)彌散狀態(tài)，說明82—91對(duì)于C-端發(fā)生自我相互作用極為重要。82—91位于LEF-11核定位信號(hào)72—101中，72—91和82—112含有部分核定位信號(hào)，共定位在細(xì)胞核中，但彌散分布（圖4、圖5）。

2.4 BiFC探究LEF-11蛋白N-端自身相互作用關(guān)鍵區(qū)域

為驗(yàn)證LEF-11蛋白共定位現(xiàn)象與自身相互作用關(guān)系，采用雙分子熒光互補(bǔ)技術(shù)（BiFC）對(duì)N-端截短各蛋白進(jìn)行分析，結(jié)果如圖6所示，LEF-11N-端截短突變體VN-LEF-11（2—61）、VN-LEF-11（12—61）、VN-LEF-11（22—61）、VN-LEF-11（32—61）、VN-LEF-11（42—61）和VN-LEF-11（2—51）均可與VC-LEF-11激發(fā)出熒光，VN-LEF-11（52—61）、VN-LEF-11（2—41）與VC-LEF-11則無熒光激發(fā)，表明LEF-11N-端截短突變體2—61、12—61、22—61、32—61、42—61、2—51與全長(zhǎng)LEF-11可發(fā)生相互作用，缺失42—51的2—41、52—61突變體則不能，結(jié)果顯示N-端截短突變體共定位和相互作用保持一致。

圖4 LEF-11-EGFP分別與LEF-11 C-端各截短片段熒光共定位

圖5 C-端截短相互作用示意圖

圖6 LEF-11-GFP分別與LEF-11蛋白N-端截短片段雙分子熒光互補(bǔ)

3 討論

本研究主要采用熒光定位和雙分子熒光互補(bǔ)技術(shù)探究了BmNPV晚期表達(dá)因子LEF-11自身相互作用，發(fā)現(xiàn)LEF-11蛋白N-端和C-端能夠與全長(zhǎng)發(fā)生共定位，并且通過BiFC試驗(yàn)初步證明，N-端各個(gè)截短突變體與LEF-11全長(zhǎng)共定位和相互作用是一致的；通過逐步截短，發(fā)現(xiàn)了缺少42—51（氨基酸序列：VCAHMLDIVS）和82—91（氨基酸序列：HKRIARLLGI）區(qū)域的片段，喪失了與全長(zhǎng)發(fā)生共定位的能力，說明這兩個(gè)區(qū)域?qū)τ贚EF-11蛋白自身相互作用具有關(guān)鍵作用。同源比對(duì)分析桿狀病毒LEF-11的結(jié)構(gòu)域，發(fā)現(xiàn)LEF-11自身相互作用關(guān)鍵區(qū)域結(jié)構(gòu)域中疏水性氨基酸是非常保守的，先前研究表明一般二聚體結(jié)構(gòu)都是有疏水性氨基酸或二硫鍵維持，因此筆者認(rèn)為L(zhǎng)EF-11結(jié)構(gòu)域中疏水氨基酸殘基對(duì)于維持自身相互作用具有關(guān)鍵作用，這些疏水基團(tuán)的缺失能夠使LEF-11喪失了自身相互作用的能力，因而呈彌散分布。對(duì)比發(fā)現(xiàn)，非自身相互作用關(guān)鍵區(qū)域?qū)τ贚EF-11自身相互作用的穩(wěn)定也有著重要作用。LEF-11核定位信號(hào)在72—101[22]，缺失全部或者部分核定位信號(hào)的突變體，定位均發(fā)生變化，N-端各個(gè)突變體缺失全部核定位信號(hào)，定位在細(xì)胞質(zhì)中，且不影響自身相互作用；C-端片段中，自身相互作用關(guān)鍵區(qū)域?yàn)?2—91，位于核定位信號(hào)中，缺失82—91不僅影響自身相互作用，也影響定位。同時(shí)還發(fā)現(xiàn)，即使保留82—91，其他區(qū)域的缺失對(duì)共定位也存在影響，這些區(qū)域可能對(duì)于自身相互作用的穩(wěn)定具有一定作用。自身相互作用關(guān)鍵區(qū)域結(jié)構(gòu)域和核定位信號(hào)是重疊的，根據(jù)多聚體功能域疏水性氨基酸和核定位信號(hào)分析它們保守氨基酸并不一致，在研究自身相互作用關(guān)鍵區(qū)域共定位時(shí)，核定位發(fā)生變化可能是由于截短突變了核定位信號(hào)的緣故。

作為桿狀病毒極晚期表達(dá)因子，LEF-11已被證實(shí)對(duì)病毒的復(fù)制極其重要[22]。相關(guān)研究已發(fā)現(xiàn)其能夠與病毒或宿主關(guān)鍵因子發(fā)生相互作用，如LEF-11與細(xì)胞核入核受體importin-3具有相互作用，能夠促進(jìn)其進(jìn)入細(xì)胞核；和IE-1共定位于核內(nèi)病毒DNA復(fù)制位點(diǎn)，可能直接參與了病毒的復(fù)制過程；與LEF-3的相互作用，可能是其募集其他因子，對(duì)病毒DNA復(fù)制進(jìn)行調(diào)控。

桿狀病毒LEF-11是一個(gè)小分子蛋白，很容易發(fā)生多聚化，很多細(xì)胞蛋白都會(huì)發(fā)生多聚化現(xiàn)象，從單體前體到多聚化是蛋白功能特征的進(jìn)化，也是蛋白質(zhì)行使不同作用的重要形式[23]。因此很多DNA病毒包括HSV、WSSV和桿狀病毒編碼多聚化蛋白，并且這些多聚化在病毒復(fù)制增殖中都具有很重要的作用。目前研究表明很多桿狀病毒蛋白，如IE-1、IE-2、LEF-3、LEF-5、DBP、CG30和HA44都能多聚化，對(duì)病毒DNA復(fù)制是必要的。另外，AcMNPV LEF-3能夠自身發(fā)生相互作用形成同源二聚體，在AcMNPV擴(kuò)散過程中，調(diào)控病毒DNA復(fù)制所必需[24-25]。LEF-11具有兩個(gè)獨(dú)立的自我相互作用位點(diǎn)，可能直接影響其寡聚化，進(jìn)而影響病毒DNA復(fù)制。同時(shí)，LEF-11具有核定位信號(hào)（NLS），這為其進(jìn)核及定位在相關(guān)位置提供了極為有利的條件，熒光定位顯示，LEF-11在缺失核定位信號(hào)后，在核內(nèi)外均有分布。相關(guān)試驗(yàn)證明LEF-11和病毒復(fù)制中心IE1及宿主DNA復(fù)制中心BrdU能夠共定位到一起，這不僅說明了LEF-11自身相互作用，同時(shí)共定位在核內(nèi)也是其行使功能不可缺少的條件。

本研究表明LEF-11擁有兩個(gè)自身相互作用功能域，并且自身相互作用不僅在細(xì)胞質(zhì)中，也發(fā)生在細(xì)胞核，結(jié)合其定位在核內(nèi)DNA復(fù)制關(guān)鍵區(qū)域，筆者推測(cè)LEF-11的兩個(gè)相互作用位點(diǎn)能夠保證其在胞質(zhì)合成后寡聚化，說明LEF-11在胞質(zhì)中具有相應(yīng)功能，寡聚化可能就是在胞質(zhì)中行使這個(gè)功能所必要的形式，考慮到LEF-11影響DNA復(fù)制的功能需要在細(xì)胞核中完成，且具有核定位信號(hào)，推測(cè)LEF-11在胞質(zhì)中自我相互作用形成寡聚體，同時(shí)募集相關(guān)物質(zhì)，在核定位信號(hào)和入核受體的作用下進(jìn)入細(xì)胞核，進(jìn)而影響病毒DNA復(fù)制。桿狀病毒LEF-11蛋白在病毒復(fù)制過程中是必要的，在病毒感染過程中LEF-11同樣存在多聚體。這些結(jié)果為以后研究LEF-11調(diào)控病毒復(fù)制以及病毒和宿主相互作用提供了理論依據(jù)，為家蠶抗病毒研究提供了基礎(chǔ)數(shù)據(jù)。

有趣的是，具有核定位信號(hào)蛋白的相互作用共定位的區(qū)域往往因?yàn)楹硕ㄎ恍蛄械娜笔Щ蛲蛔兌淖?，這可能是由于蛋白相互作用后被一同轉(zhuǎn)運(yùn)。筆者已經(jīng)利用這項(xiàng)技術(shù)，探究了一些蛋白之間的相互作用，通過熒光定位，更加直觀地了解蛋白質(zhì)之間的相互關(guān)系，為胞內(nèi)大分子相互作用研究提供了一個(gè)新的方法，但其進(jìn)核機(jī)制及其調(diào)控過程仍不清晰，還需要更深入地研究。

本研究揭示了桿狀病毒晚期表達(dá)因子LEF-11能夠發(fā)生自身相互作用，并且通過一系列截短試驗(yàn)，找到了其在N-端和C-端具有的兩個(gè)相互作用關(guān)鍵區(qū)域。結(jié)合相關(guān)研究，筆者推測(cè)LEF-11在胞質(zhì)合成后，通過自身相互作用形成寡聚體，募集其他因子，可能在入核受體蛋白importin-3的作用下進(jìn)入細(xì)胞核，利用自身核定位序列定位于相關(guān)區(qū)域，并且和LEF-3等蛋白相互作用[20]，進(jìn)而形成一個(gè)復(fù)合體結(jié)構(gòu)，直接調(diào)控病毒DNA合成。當(dāng)然，這個(gè)假設(shè)仍有很多問題沒有被闡明，如LEF-11寡聚體是否募集了其他因子，這些因子對(duì)于病毒感染過程又有什么作用，LEF11-11入核機(jī)制和調(diào)控病毒DNA復(fù)制的模式又是什么，相關(guān)問題的研究也是正在探索的方向。

4 結(jié)論

通過免疫熒光和雙分子熒光互補(bǔ)技術(shù)，鑒定了家蠶核型多角體病毒晚期表達(dá)蛋白LEF-11 N-端和C-端均具有獨(dú)立的相互作用區(qū)域，同時(shí)通過截短確定42—51和82—91為其相互作用關(guān)鍵區(qū)域。

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（責(zé)任編輯 岳梅）

Identification the key areas ofNucleopolyhedrovirus LEF-11 self-interaction

JIANG YaMing1, DONG ZhanQi1, CHEN TingTing1, HU Nan1, DONG FeiFan1, HUANG Liang1, Tang LiangTong2, PAN MinHui1,2

(1Key Laboratory of Sericultural Biology and Genetic Breeding, Ministry of Agriculture, Southwest University, Chongqing 400716;2Chongqing Agricultural Mechanization School, Chongqing 404000)

nucleopolyhedrovirus (BmNPV) is one of the most common and most serious pathogenic microorganisms in sericulture, and LEF-11, one of the late expression factors of baculovirus, has been verified essential for virus proliferation.Related research proves that LEF-11 has the ability to form oligomers by self-interaction.the objective of this study is to explore the key areas of LEF-11 self-interaction via gradually truncated.Bimolecular fluorescence complementation (BiFC) and fluorescent co-localization were utilized in this study. Firstly, the primers were designed based on the sequence of BmNPVeach truncated fragment as well as fluorescent protein sequence, all of the fragments were treated with restriction endonuclease after PCR. Then, pIZ/V5-His, the insect cell expression vector, was used to construct fluorescence fusion protein vector. Next, each truncated fragment fluorescence fusion protein vector was transfected together with pIZ-LEF11-GFP in BmN-SWU1, respectively. Cells were fixed after 48 h of the replacement of ordinary medium. Finally, the expression and localization of fluorescent fusion protein were observed under fluorescence confocal microscopy. As for the BiFC essay, the construction of vectors and the way of post processing were the same with fluorescence fusion protein.Both the 2-61 and 62-112 of the baculovirus LEF-11 protein could interact with the full length of the LEF-11 protein, and co-located in cytoplasm and nucleus, respectively. In the process of gradual truncation, LEF-11 protein N-terminal 2-61, 12-61, 22-61, 32-61, 42-61 and 2-51 could co-located with the full length of LEF-11 protein in cytoplasm, but N-terminal 52-61 and 2-41 did not co-locate. LEF-11 protein C-terminal 62-112, 72-112, 82-112, 72-101 and 72-91 could co-located with the full length of LEF-11 protein, but C-terminal 92-112 and 72-81 did not co-locate. The result of BiFC essay indicated that LEF-11 protein N-terminal 2-61, 12-61, 22-61, 32-61, 42-61 and 2-51 could interact with the full length of LEF-11 protein, but the 2-41 and 52-61 truncated fragments did not interact with the full length of LEF-11 protein. It was compatible with the result of N-terminal fragments fluorescence localization.The 42-51 and 82-91 truncated fragments were identified as the key areas for the baculovirus LEF-11 protein self-interaction and could be used in LEF-11 protein related functional studies.

; BmNPV; LEF-11; bimolecular fluorescence complementation; self-interaction

2017-04-17；接受日期：2017-05-12

國(guó)家自然科學(xué)基金（31472152）、國(guó)家蠶桑產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系（CARS-22）

蔣亞明，E-mail：437313028@qq.com。通信作者潘敏慧，E-mail：pmh047@126.com