響應(yīng)面優(yōu)化超臨界法萃取綠豆皮黃酮工藝

張楊，劉闖

（吉林農(nóng)業(yè)科技學(xué)院食品工程學(xué)院，吉林吉林132101）

響應(yīng)面優(yōu)化超臨界法萃取綠豆皮黃酮工藝

張楊，劉闖*

（吉林農(nóng)業(yè)科技學(xué)院食品工程學(xué)院，吉林吉林132101）

采用超臨界CO2技術(shù)萃取綠豆皮中黃酮類物質(zhì)，通過單因素和響應(yīng)面試驗對超臨界萃取綠豆皮黃酮工藝參數(shù)進行優(yōu)化，結(jié)果表明：當萃取壓力31 MPa、萃取溫度47℃、萃取時間3.58 h、原料/夾帶劑=1∶0.62（g/mL）時，綠豆皮黃酮的萃取率最高為87.64%。影響黃酮萃取率由強到弱的因素依次為萃取溫度＞萃取壓力＞萃取時間＞原料/夾帶劑。

綠豆皮；黃酮；超臨界法；萃?。豁憫?yīng)面試驗

綠豆作為主要的豆類，有著重要的地位作用，還可用于藥物中[1-2]，能夠起到消暑、抗氧化以及利尿的作用。在綠豆中，其含有大量的營養(yǎng)物質(zhì)，如綠豆淀粉、綠豆蛋白以及綠豆皮中的黃酮類化合物成分，都具有重要的作用，而主要的是綠豆中活性成分黃酮類物質(zhì)[3]，有研究表明，綠豆中黃酮類化合物能夠抗氧化等功效，作為活性成分主要存在于綠豆皮中。目前，提取綠豆皮中黃酮的方法主要為有機溶劑法、研究深入的還有微波、超聲波等輔助提取法[4-6]。超臨界CO2萃取技術(shù)是新興起的高新技術(shù)，其特點為節(jié)省人力物力，降低能耗，降低廢水排放、無污染等[7-8]，在食品領(lǐng)域得到廣泛應(yīng)用[9-10]。食品行業(yè)發(fā)展迅速，綠豆開發(fā)應(yīng)用的產(chǎn)品越來越多，產(chǎn)生的綠豆皮下腳料也越來越多，因此開發(fā)綠豆皮產(chǎn)品、對綠豆皮進行深加工以及提取綠豆皮功能成分就成為急需解決的問題，本試驗以綠豆皮為試驗材料，利用超臨界CO2萃取綠豆皮黃酮，可對綠豆皮綜合開發(fā)利用提供一定的技術(shù)參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

新鮮綠豆皮干粉：安徽鑫海藥業(yè)有限公司；蘆丁標準品：上?？道噬锟萍加邢薰?；硝酸鋁、亞硝酸鈉、氫氧化鈉：濰坊海之源化工有限公司（以上試劑均為分析純）。

1.2 儀器與設(shè)備

350 g型中藥粉碎機：廣州市番禺區(qū)立鶴五金交電商行；UTP-3000型電子分析天平：慈溪紅鉆衡器設(shè)備有限公司；721型可見分光光度計：北京華威興業(yè)科技有限公司；HWS-26型電熱恒溫水浴鍋：廣州越特科學(xué)儀器有限公司；WE-30型超臨界萃取儀：南通杜欣新能源科技有限公司。

1.3 綠豆皮黃酮提取工藝及測定方法[11-12]

取一定量綠豆皮，粉碎至160目，稱取粉碎后綠豆皮粉樣品3 kg，通過超臨界設(shè)備萃取后常壓過濾，將濾液移至50 mL容量瓶中，進行測定。測定方法參照參考文獻[11-12]的方法進行。

1.4 超臨界萃取綠豆皮黃酮的單因素試驗

1.4.1 萃取壓力對綠豆皮黃酮萃取率的影響

在萃取溫度45℃、萃取時間3.5 h、原料/夾帶劑為1∶0.6（g/mL）的條件下，以綠豆皮黃酮萃取率為考察指標，考核萃取壓力 20、25、30、35、40 MPa 對綠豆皮黃酮萃取率的影響。

1.4.2 萃取溫度對綠豆皮黃酮萃取率的影響

在萃取壓力30 MPa、萃取時間3.5 h、原料/夾帶劑為1∶0.6（g/mL）的條件下，以綠豆皮黃酮萃取率為考察指標，考核萃取溫度 35、40、45、50、55 ℃對綠豆皮黃酮萃取率的影響。

1.4.3 萃取時間對綠豆皮黃酮萃取率的影響

在萃取壓力30 MPa、萃取溫度45℃、原料/夾帶劑為1∶0.6（g/mL）的條件下，以綠豆皮黃酮萃取率為考察指標，考核萃取時間 2.5、3.0、3.5、4.0、4.5 h 對綠豆皮黃酮萃取率的影響。

1.4.4 夾帶劑用量對綠豆皮黃酮萃取率的影響

在萃取壓力30 MPa、萃取溫度45℃、萃取時間3.5 h的條件下，以綠豆皮黃酮萃取率為考察指標，以無水乙醇為夾帶劑，考核原料/夾帶劑為1∶0.4、1∶0.5、1 ∶0.6、1 ∶0.7、1 ∶0.8（g/mL）對綠豆皮黃酮萃取率的影響。

1.5 綠豆皮黃酮超臨界萃取工藝的優(yōu)化

根據(jù)單因素試驗結(jié)果，以萃取壓力（A），萃取溫度（B），萃取時間（C）和原料/夾帶劑（D）作為響應(yīng)因素，以黃酮萃取率（Y）為響應(yīng)值，設(shè)計四因素三水平的響應(yīng)面試驗，采用Design-Expert8.0.6軟件及Box-Behnken中心設(shè)計原理，確定最佳工藝參數(shù)。試驗設(shè)計因素水平見表1。

表1 Box-Behnken中心組合試驗因素水平表Table 1 Factors and their coded levels in the Box-Behnken experimental design

2 結(jié)果與分析

2.1 超臨界萃取綠豆皮黃酮的單因素試驗結(jié)果

2.1.1 萃取壓力對綠豆皮黃酮萃取率的影響

萃取壓力對綠豆皮黃酮萃取率的影響見圖1。

全球性的氣候問題以及極端天氣、自然災(zāi)害的頻繁發(fā)生常常導(dǎo)致我國部門農(nóng)產(chǎn)品供應(yīng)不足的現(xiàn)象，影響著我國農(nóng)業(yè)持續(xù)健康發(fā)展。此外，我國的城市化、工業(yè)化進程的不斷深化導(dǎo)致農(nóng)業(yè)耕地的減少也一定程度上影響著農(nóng)產(chǎn)品供應(yīng)。經(jīng)濟的快速發(fā)展、人民生活水平的提高拉動了國內(nèi)市場對農(nóng)產(chǎn)品的需求。因此，由于國內(nèi)外投資機構(gòu)蓄意炒作而導(dǎo)致的農(nóng)產(chǎn)品價格大幅度提升的現(xiàn)象時有發(fā)生，這一狀況也在一定程度上影響著物價的持續(xù)走高。對此，政府必須要加大對我國農(nóng)業(yè)生產(chǎn)的支持力度，在政策上，經(jīng)濟上都給予一定程度的扶持，保證我國市場農(nóng)副產(chǎn)品的充足供應(yīng)。

圖1 萃取壓力對綠豆皮黃酮萃取率的影響Fig.1 Effect of extraction pressure on the extraction rate of flavonoids from mung bean

根據(jù)圖1能夠得出，在萃取壓力為20 MPa～30 MPa范圍內(nèi)，隨著萃取壓力的升高，綠豆皮黃酮萃取率逐漸提高，但當萃取壓力由30 MPa升高到35 MPa后，萃取率逐漸下降，當萃取壓力為30 MPa時，綠豆皮黃酮萃取率最高，原因可能是壓力過大對黃酮造成了損失[13]。因此，選擇萃取壓力25、30、35 MPa為響應(yīng)面研究水平。

2.1.2 萃取溫度對綠豆皮黃酮萃取率的影響

萃取溫度對綠豆皮黃酮萃取率的影響見圖2。

圖2 萃取溫度對綠豆皮黃酮萃取率的影響Fig.2 Effect of extraction temperature on the extraction rate of flavonoids from mung bean

根據(jù)圖2可知，當萃取溫度為35℃時，黃酮萃取率最低，隨著萃取溫度的升高，萃取率先升高后降低，當溫度為45℃時，黃酮萃取率達到最高，原因可能是，當萃取溫度過低時，較低的溫度導(dǎo)致黃酮不能夠完全溶出，溫度過高對破壞黃酮類化合物。因此，選擇40、45、50℃為響應(yīng)面研究水平。

2.1.3 萃取時間對綠豆皮黃酮萃取率的影響

萃取時間對綠豆皮黃酮萃取率的影響見圖3。

根據(jù)圖3可知，當萃取時間較短，為2.5 h時，萃取率最低，當逐漸提高萃取時間，萃取率明顯升高，當萃取時間達到3.5 h后，萃取率幾乎不變，這說明綠豆皮中黃酮已完全被分離，故再提高萃取時間，萃取率也不會上升[14]，因此，選擇萃取時間為 3.0、3.5、4.0 h 為響應(yīng)面研究水平。

圖3 萃取時間對綠豆皮黃酮萃取率的影響Fig.3 Effect of extraction time on the extraction rate of flavonoids from mung bean

2.1.4 原料/夾帶劑比例對綠豆皮黃酮萃取率的影響原料/夾帶劑比例對萃取率的影響見圖4。

圖4 原料/夾帶劑比例對萃取率的影響Fig.4 Effect of ratio of solid to liquid on extraction rate

根據(jù)圖4可知，當原料/夾帶劑為1∶0.4（g/mL）時，黃酮萃取率最低，隨著夾帶劑量的增大，萃取率先升高，當原料/夾帶劑為 1 ∶0.6（g/mL）時，萃取率達到最高，繼續(xù)增加夾帶劑量后，萃取率幾乎不變，原因可能是，當夾帶劑過低時，較少的夾帶劑導(dǎo)致萃取不徹底，當夾帶劑達到一定量后，黃酮已經(jīng)完全被提出，因此繼續(xù)增大夾帶劑量后萃取率幾乎不變。因此，選擇原料/夾帶劑為 1 ∶0.5、1 ∶0.6、1 ∶0.7（g/mL）為響應(yīng)面研究水平。

2.2 超臨界萃取綠豆皮黃酮工藝參數(shù)的優(yōu)化

2.2.1 數(shù)學(xué)模型的建立與顯著性檢驗

采用Box-Benhnken中心組合試驗設(shè)計，以單因素試驗結(jié)果為基礎(chǔ)，進行四因素三水平的RSM（response surface methodology）分析試驗?？疾燧腿毫Γˋ），萃取溫度（B），萃取時間（C）和原料/夾帶劑（D）對黃酮萃取率（Y）的影響，試驗設(shè)計方案及結(jié)果見表2。

應(yīng)用Design-Expert8.0.6軟件將表2做出多元回歸擬合、方差分析及顯著性檢驗，能夠得出黃酮萃取率作為目標函數(shù)，關(guān)于每個因素編碼值二次回歸方程如下：

表2 Box-Benhnken的中心組合試驗設(shè)計及結(jié)果Table 2 Box-Benhnken central composite design arrangement and experimental results

將以上結(jié)果做出顯著性檢驗，表3是方差分析結(jié)果，表4是可信度分析結(jié)果。

分析表 3、表 4，能夠得出，此結(jié)果，p＜0.000 1，遠小于0.01，表明此數(shù)據(jù)分析結(jié)果極顯著，回歸數(shù)學(xué)模型和實際測定數(shù)值能夠完全擬合，實驗誤差較小，因此，能夠利用此數(shù)學(xué)回歸方程模擬實驗結(jié)果，同時用它進行計算。R2=98.49%，理論值和實際測定的數(shù)值有很高的相關(guān)聯(lián)性，表明此方程較可靠。在回歸模型中，一次項 A、B，交互項 AC、BC，二次項 A2、B2、C2、D2，均表現(xiàn)出了極顯著水平，交互項BD，一次項C，均表現(xiàn)出了顯著水平。方差分析結(jié)果表明，影響黃酮萃取率由強到弱的因素為萃取溫度＞萃取壓力＞萃取時間＞原料/夾帶劑。

表3 回歸方程方差分析表Table 3 Analysis of variance for fitted quadratic regression equation

表4 回歸模型的可信度分析Table 4 Reliability analysis of the established regression model

2.2.2 交互作用對黃酮萃取率影響的響應(yīng)面分析

交互作用極顯著因素響應(yīng)面及等高線圖見圖5。

等高線是反應(yīng)因素之間的相互作用的，能夠從圖中直接明顯看出[15-16]。若等高線圖中圓圈是橢圓，代表因素之間作用顯著，若圖是圓形，代表因素之間不顯著。萃取壓力與萃取時間、萃取溫度與萃取時間交互情況極顯著，具體表現(xiàn)為等高線中的圖形呈明顯的橢圓形，萃取溫度與原料/夾帶劑交互情況顯著，等高線圖呈現(xiàn)出橢圓，而萃取壓力與萃取溫度、萃取壓力與原料/夾帶劑、萃取時間與原料/夾帶劑交互情況不顯著，具體表現(xiàn)為等高線圖幾乎呈現(xiàn)為圓形。

圖5 交互作用極顯著因素響應(yīng)面及等高線圖Fig.5 Response surfaces and contour plots showing the interactive effects

2.2.3 優(yōu)化擠出酶解復(fù)合法液化工藝參數(shù)

為了能夠明確最優(yōu)參數(shù)，要把回歸數(shù)學(xué)方程對每個參數(shù)求一階偏導(dǎo)數(shù)，并設(shè)其是0，得到四元一次方程如下：

求解得：A＝0.151、B＝0.327、C＝0.154、D＝0.204，即最佳工藝參數(shù)為萃取壓力30.75MPa、萃取溫度46.63℃、萃取時間 3.58 h、原料/夾帶劑=1∶0.62（g/mL），在此參數(shù)下，黃酮萃取率是87.32%。為便于實際操作，將參數(shù)修正為萃取壓力31 MPa、萃取溫度47℃、萃取時間3.58 h、原料/夾帶劑=1 ∶0.62（g/mL），采用此參數(shù)做 3次平行試驗，黃酮萃取率是87.64%，實際測定值和理論預(yù)測值比較相近，表明此模型可優(yōu)化萃取綠豆皮黃酮工藝。

3 結(jié)論

采用超臨界CO2萃取技術(shù)萃取綠豆皮黃酮，通過單因素和響應(yīng)面試驗對超臨界萃取綠豆皮黃酮工藝條件進行優(yōu)化，最佳萃取條件為：萃取壓力31 MPa、萃取溫度 47℃、萃取時間 3.58 h、原料/夾帶劑 =1∶0.62（g/mL），此條件下綠豆皮黃酮的萃取率為87.64%。方差分析結(jié)果表明，影響黃酮萃取率由強到弱的因素為萃取溫度＞萃取壓力＞萃取時間＞原料/夾帶劑。

[1]李積華.綠豆酶法水解特性及全綠豆新型飲品的開發(fā)研究[D].南昌:南昌大學(xué),2007

[2] 李梅青,張瑜,代蕾莉,等.Plackett-Burman試驗設(shè)計及響應(yīng)面法優(yōu)化超聲輔助提取明綠豆SOD工藝[J].食品科學(xué),2015,36(2):69-74

[3] Jiaqiang Luo,Weixi Cai,Wu Tong,et al.Phytochemical distribution in hull and cotyledon of adzuki bean(Vigna angularisL.)and mung bean(Vigna radiateL.),and their contribution to antioxidant,antiinflammatory and anti-diabetic activities[J].Food Chemistry,2016,36(4):55-62

[4] S D Chandrasiri,R Liyanage,J K Vidanarachchi,et al.Does Processing have a Considerable Effect on the Nutritional and Functional Properties of Mung Bean(Vigna Radiata)[J].Procedia Food Science,2016,6(4):65-71

[5] Lan Peng,Jialong Fan,Chunyi Tong,et al.An ultrasensitive fluorescence method suitable for quantitative analysis of mung bean nuclease and inhibitor screening in vitro and vivo[J].Biosensors and Bioelectronics,2016,86(3):115-119

[6] 梁紅,唐超文,曾志成,等.銀杏黃酮處理綠豆黃化幼苗生產(chǎn)保健芽菜的工藝研究[J].食品科學(xué),2007,28(10):214-218

[7] 樊紅秀,劉婷婷,劉鴻鋮,等.超臨界萃取人參皂苷及HPLC分析[J].食品科學(xué),2013,34(20):121-126

[8] 陳嵐,滿瑞林.超臨界萃取技術(shù)及其應(yīng)用研究[J].現(xiàn)代食品科技,2006,27(1):199-202

[9] 楊柏崇,李元瑞.獼猴桃籽油的超臨界二氧化碳萃取研究[J].食品科學(xué),2003,24(7)104-108

[10]樊文樂,武文潔.超臨界萃取中夾帶劑的概述[J].食品科技,2005,30(2):39-42

[11]孫倩.基于液質(zhì)聯(lián)用技術(shù)的大小薊多組分分析與黃酮類成分的藥物代謝動力學(xué)研究[D].石家莊:河北醫(yī)科大學(xué),2013

[12]張青青.泡桐花總黃酮提取工藝的研究[D].楊凌:西北農(nóng)林科技大學(xué),2014

[13]黃江艷,李秀娟,潘思軼.固相微萃取技術(shù)在食品風味分析中的應(yīng)用[J].食品科學(xué),2012,33(7):289-298

[14]范文來,胡光源,徐巖.頂空固相微萃取-氣相色譜-質(zhì)譜法測定藥香型白酒中萜烯類化合物[J].食品科學(xué),2012,14:110-116

[15]侯學(xué)敏,李林霞,張直峰,等.響應(yīng)面法優(yōu)化薄荷葉總黃酮提取工藝及抗氧化活性[J].食品科學(xué),2013,34(6):124-128

[16]胡成旭,侯欣彤,馮永寧,等.響應(yīng)面法優(yōu)化云芝多糖提取條件的研究[J].食品工業(yè)科技,2007,28(7):124-126,130

Supercritical Extraction of Flavonoids from Mung Bean Skin by Response Surface Methodology

ZHANG Yang，LIU Chuang*
（College of Food Engineering，Jilin Agricultural Science and Technology College，Jilin 132101，Jilin，China）

Supercritical CO2extraction was used to extract flavonoids from mung bean hulls.The optimum conditions were as follows：extraction pressure 31 MPa，extraction temperature 47℃，extraction time 3.58 h and the ratio of raw material/entrainer=1 ∶0.62（g/mL）.Under these conditions，the extraction rate of flavonoids was 87.64%.The results of analysis of variance also showed that the factors influencing flavonoid extraction rate from strong to weak were extraction temperature＞ extraction pressure＞ extraction time＞ raw material/entrainer.

mung bean husk；flavonoids；supercritical method；extraction；response surface test

10.3969/j.issn.1005-6521.2017.22.012

吉林農(nóng)業(yè)科技學(xué)院大學(xué)生科技創(chuàng)新科研項目（吉農(nóng)院合字[2016]第2016041號）

張楊（1996—），女（漢），本科在讀，食品科學(xué)與工程專業(yè)。

*通信作者：劉闖，男，本科，研究方向：食品科學(xué)與體育運動學(xué)。

2017-01-10