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    海藻酸鈉包埋希瓦氏菌及其對(duì)活性艷紅X—3B脫色研究

    2017-11-09 10:23肖力彬劉柳汪聰蔡亞君
    農(nóng)家科技 2017年8期
    關(guān)鍵詞:懸液脫色微球

    肖力彬+劉柳+汪聰+蔡亞君

    摘 要:本研究分析腐敗希瓦氏菌4H菌株通過(guò)海藻酸鈉進(jìn)行固定化以后對(duì)偶氮染料活性艷紅X-3B的處理效果。首先以該菌培養(yǎng)至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的菌體為對(duì)象,確定了在CaCl2濃度為1.5%、海藻酸鈉濃度為2.5%、微球粒徑0.6mm時(shí)包埋得到的微球性能最佳。用包埋了腐敗希瓦氏菌4H菌體的微球分別在不同的pH、溫度、染料濃度等條件下處理活性艷紅X-3B,在pH為5和9時(shí),微球?qū)?0mg/L活性艷紅X-3B35℃靜置處理8h時(shí)的脫色率分別為70.8%和67.7%,而菌懸液只有34.2%和47.6%;在溫度分別為20℃和50℃時(shí),對(duì)50mg/L活性艷紅X-3B靜置處理12h時(shí)的脫色率分別為73.1%和62.7%,而菌懸液只有57.6%和27.3%;在染料濃度高達(dá)1600mg/L和3200mg/L時(shí),微球?qū)H7的活性艷紅X-3B在35℃靜置處理48h時(shí)的脫色率分別為95.3%和94.1%,菌懸液為92.3%和91.3%。結(jié)果顯示,腐敗希瓦氏菌4H菌經(jīng)海藻酸鈉包埋固定化后形成的微球?qū)Σ焕h(huán)境的耐受性更強(qiáng),且多次重復(fù)利用仍具較好的脫色效果,具有更好的實(shí)際應(yīng)用價(jià)值。

    關(guān)鍵詞:腐敗希瓦氏菌;固定化;海藻酸鈉;活性艷紅X-3B;脫色

    廢水生物處理是主要利用微生物的分解作用去除水中污染物的方法,成本低且無(wú)二次污染,是現(xiàn)代廢水處理中應(yīng)用最廣泛的方法之一,但印染廢水由于其有機(jī)物含量高、可生化性差、色度深、水質(zhì)變化大,對(duì)常規(guī)的活性污泥或生物膜等生物處理系統(tǒng)中的微生物(無(wú)論是天然微生物還是投加的功能菌)生長(zhǎng)代謝影響大,導(dǎo)致生物處理系統(tǒng)消耗快、效率低。針對(duì)這一問(wèn)題,本研究以一株染料脫色菌株為對(duì)象,比較將菌體通過(guò)海藻酸鈉固定化技術(shù)包埋在微球里后處理染料廢水時(shí)對(duì)環(huán)境條件的耐受度和脫色效果,從而分析利用包埋固定化技術(shù)提高印染廢水生物處理系統(tǒng)效率的可行性。

    一、材料和方法

    1.菌株來(lái)源 菌株Shewanella putrefaciens 4H為本實(shí)驗(yàn)室分離篩選。

    2.菌株的活化及生長(zhǎng)曲線的測(cè)定 將保藏菌種接種到5ml含50mg/L活性艷紅X-3B的LB培養(yǎng)基中35℃活化培養(yǎng),觀察脫色時(shí)間,如脫色時(shí)間過(guò)長(zhǎng)則重復(fù)此步驟,直至脫色時(shí)間穩(wěn)定之后,將菌液按1:100比例轉(zhuǎn)接至50ml含50mg/L活性艷紅X-3B的LB培養(yǎng)基中35℃培養(yǎng),定時(shí)取樣檢測(cè)培養(yǎng)物的OD600和OD525,根據(jù)OD600繪制生長(zhǎng)曲線,確定生長(zhǎng)曲線中對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的時(shí)間段。同時(shí)根據(jù) OD525 計(jì)算不同時(shí)間的脫色率,確定脫色完全所需時(shí)間。

    3.海藻酸鈉包埋固定化條件研究 以對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期菌體(無(wú)菌水洗滌三次)為對(duì)象,將菌體用無(wú)菌水懸浮至OD600值為1~2的菌懸液,然后取該菌懸液0.5mL與4.5mL的海藻酸鈉溶液充分混和,在無(wú)菌的100mL小燒杯中倒入60mL氯化鈣溶液,用注射器將菌懸液和海藻酸鈉的混合物滴入氯化鈣溶液之中,即可形成固定化微球。此后將燒杯置于4℃的冰箱中,18h之后取出,去除氯化鈣溶液,并用生理鹽水洗滌固定化微球3次,再置于4℃冰箱中,保存?zhèn)溆?。比較不同的海藻酸鈉濃度、氯化鈣濃度、注射器口徑對(duì)制得微球性能的影響,確定最佳的固定化條件。

    4.固定化微球?qū)钚云G紅X-3B的脫色研究 將固定化微球在不同溫度、pH、染料濃度的條件下處理活性艷紅X-3B,以等量菌懸液在相同條件下的處理為對(duì)照,分析固定化對(duì)菌株生長(zhǎng)及脫色性能的影響。并對(duì)固定化微球的重復(fù)利用效果進(jìn)行了分析。

    二、 結(jié)果與分析

    1.菌株S. putrefaciens 4H生長(zhǎng)曲線的測(cè)定

    將S. putrefaciens 4H菌株過(guò)夜活化培養(yǎng)后按1:100轉(zhuǎn)接至50ml含50mg/L活性艷紅X-3B的LB培養(yǎng)基中35℃、200rpm培養(yǎng),每2h檢測(cè)培養(yǎng)液的OD600值,以培養(yǎng)時(shí)間為橫坐標(biāo),以O(shè)D600值為縱坐標(biāo)繪得該菌在該培養(yǎng)條件下的生長(zhǎng)曲線。

    2.菌株S. putrefaciens 4H海藻酸鈉固定化研究

    將S. putrefaciens 4H菌株過(guò)夜活化培養(yǎng)后按1:100轉(zhuǎn)接至50 mL含50 mg/L活性艷紅X-3B的LB培養(yǎng)基中35℃、200rpm培養(yǎng),8h時(shí)將培養(yǎng)液離心取菌體,將菌體用無(wú)菌水洗滌三次后用無(wú)菌水懸浮至OD600值為1.2。將菌懸液按每份0.5ml等量分裝,在不同海藻酸鈉濃度、氯化鈣濃度、注射器口徑的條件下制備固定化微球。

    (1) 氯化鈣濃度對(duì)固定化微球性能的影響。首先,比較了海藻酸鈉溶液濃度為3.0%、注射器口徑為0.6mm時(shí),氯化鈣溶液濃度分別為1.0%、1.5%、2.0%、2.5%、3.0%時(shí)制備微球的性能。肉眼觀察到微球成球性能均良好。將微球分別轉(zhuǎn)接到5ml含50mg/L活性艷紅X-3B的LB液體培養(yǎng)基中35℃靜置培養(yǎng),每2h取樣,離心之后測(cè)上清的OD525,計(jì)算脫色率。結(jié)果顯示,不同氯化鈣濃度時(shí)制備得到的微球最終都能脫色完全,但氯化鈣濃度為1.5%時(shí)在整個(gè)處理過(guò)程中的表現(xiàn)最好。脫色完全之后觀察到的固定化微球的形態(tài)仍然良好,對(duì)微球外培養(yǎng)液OD600值的檢測(cè)也顯示無(wú)游離菌體的存在。

    (2)海藻酸鈉濃度對(duì)固定化微球性能的影響。在氯化鈣溶液濃度為1.5%、注射器口徑為0.6mm時(shí),比較海藻酸鈉濃度分別為2.0%、2.5%、3.0%、3.5%、4.0%時(shí)制備得到的微球的性能。肉眼觀察到微球成球性能均良好。將微球分別轉(zhuǎn)接到5ml含50mg/L活性艷紅X-3B的LB液體培養(yǎng)基中35℃靜置培養(yǎng),每2h取樣,離心之后測(cè)上清的OD525,計(jì)算脫色率。結(jié)果顯示,海藻酸鈉濃度為2.5%時(shí)制備得到的微球的脫色效果最好。脫色完全之后觀察到的固定化微球的形態(tài)仍然良好,對(duì)微球外培養(yǎng)液OD600值的檢測(cè)也顯示無(wú)游離菌體的存在。

    (3) 微球直徑對(duì)固定化微球性能的影響。在氯化鈣溶液濃度為1.5%、海藻酸鈉濃度為2.5%時(shí),比較注射器口徑分別為0.45mm、0.5mm、0.6mm、0.7mm時(shí)制備得到的微球的性能。肉眼觀察到由口徑為0.5mm、0.6mm、0.7mm的注射器制備得到的微球成球性能均良好。將微球分別轉(zhuǎn)接到5ml含50mg/L活性艷紅X-3B的LB液體培養(yǎng)基中35℃靜置培養(yǎng),每2h取樣,離心之后測(cè)上清的OD525,計(jì)算脫色率。結(jié)果顯示,由口徑為0.6mm的注射器制備得到的固定化微球的脫色效果最好。直徑為0.5mm、0.6mm、0.7mm的固定化微球脫色完全之后觀察到的形態(tài)仍然良好,對(duì)微球外培養(yǎng)液OD600值的檢測(cè)也顯示無(wú)游離菌體的存在;而直徑為0.45mm的微球有部分破碎現(xiàn)象,取樣測(cè)定OD600值,也檢測(cè)到有部分游離菌的存在。endprint

    3.菌株S. putrefaciens 4H固定化微球?qū)钚云G紅X-3B的脫色效果

    將固定化微球和等菌量的菌懸液分別轉(zhuǎn)接入不同pH 、含不同濃度活性艷紅X-3B的LB液體培養(yǎng)基中,于不同溫度靜置培養(yǎng),每2h取樣,離心之后取上清檢測(cè)OD525,計(jì)算脫色率。

    (1)固定化微球?qū)H的耐受性研究。將固定化微球和菌懸液分別接入5ml pH分別為5、6、7、8、9的含50mg/L活性艷紅X-3B染料的LB液體培養(yǎng)基中35℃靜置培養(yǎng)。脫色率檢測(cè)結(jié)果顯示,在pH為6、7、8時(shí),菌懸液的脫色效果優(yōu)于微球,6h脫色率分別為90%左右和70%-80%;而pH為5時(shí),菌懸液濃度不增加,8h脫色率最高僅34.2%,微球8h脫色率為 70.8%;pH為9時(shí),菌懸液濃度增加少,8h脫色率為47.6%,微球?yàn)?7.7%。

    (2)固定化微球?qū)囟鹊哪褪苄匝芯?。將固定化微球和菌懸液分別接入5ml pH 7的含50mg/L活性艷紅X-3B染料的LB液體培養(yǎng)基中,分別于20℃、30℃、35℃、40℃、50℃靜置培養(yǎng)。脫色率檢測(cè)結(jié)果顯示,在溫度為30、35、40℃時(shí),菌懸液的脫色效果優(yōu)于微球,6h脫色率分別為90%左右和70%左右;而溫度為20℃時(shí),菌懸液濃度增加少,菌懸液12h脫色率最高僅57.6.2%,微球12h脫色率為 73.1%;溫度為50℃時(shí),菌懸液濃度不增加,12h脫色率為27.3%,微球?yàn)?2.7%。

    (3)固定化微球?qū)θ玖蠞舛鹊哪褪苄匝芯?。將固定化微球和菌懸液分別接入5ml pH 7的活性艷紅X-3B濃度分別為50mg/L、100 mg /L、200 mg /L、400 mg /L、800 mg /L、1600 mg /L、3200mg/L的LB培養(yǎng)基中,35℃靜置培養(yǎng)。脫色率檢測(cè)結(jié)果顯示,在染料濃度≤800 mg /L時(shí),菌懸液的脫色效果優(yōu)于微球,如對(duì)濃度≤200 mg /L的染料,微球處理6h脫色率均80%左右,菌懸液均90%左右;對(duì)400 mg /L的染料,微球處理6h脫色率為60%左右,菌懸液80%左右;對(duì)800 mg /L的染料,微球處理6h脫色率為50%左右,菌懸液60%左右。當(dāng)染料濃度為1600 mg/L時(shí),菌懸液對(duì)染料的脫色率最初優(yōu)于微球,但是在12h之后微球的脫色效果優(yōu)于菌懸液,48h時(shí)微球脫色率為95.3%,菌懸液為92.3%。當(dāng)染料濃度為3200 mg/L時(shí),微球的脫色效果優(yōu)于菌懸液,48h時(shí)微球脫色率為94.1%,菌懸液為91.3%。

    (4)固定化微球的重復(fù)利用性研究。將微球轉(zhuǎn)接入5ml pH7的含50mg/L活性艷紅X-3B的LB培養(yǎng)基中,測(cè)定起始OD525值及處理6h后OD525值,計(jì)算6h脫色率。然后將固定化微球取出后用生理鹽水洗滌三次,再轉(zhuǎn)入新的含50mg/L活性艷紅X-3B的LB培養(yǎng)基中,檢測(cè)6h脫色率。重復(fù)上述步驟,直到固定化微球破損較為嚴(yán)重。

    在第6次重復(fù)使用時(shí),其6h脫色率僅比第1次的下降5%左右,脫色性能保持較好,但總體來(lái)說(shuō)隨使用次數(shù)的增加而呈下降趨勢(shì)。在前3次重復(fù)使用時(shí)固定化微球形態(tài)良好,沒(méi)有出現(xiàn)破損,但從第4次開(kāi)始微球開(kāi)始出現(xiàn)破損,第6次后固定化微球發(fā)生崩解。

    三、討論

    本研究結(jié)果顯示,菌株S. putrefaciens 4H通過(guò)海藻酸鈉包埋固定化后得到的微球?qū)Σ焕h(huán)境的耐受性增強(qiáng),且可重復(fù)利用,表明該菌通過(guò)包埋固定化后在對(duì)溫度、pH、染料濃度等水質(zhì)參數(shù)變化大的印染廢水的生物處理中具有了更好的應(yīng)用前景。而包埋形成的微球之所以能夠在不利環(huán)境中發(fā)揮降解作用,主要是由于固定化載體起到了一個(gè)保護(hù)屏障的作用,使細(xì)胞不直接與外界環(huán)境相接觸,從而可以抵御土著微生物的惡性競(jìng)爭(zhēng)、防止或減緩噬菌體、毒性物質(zhì)及高滲透壓物質(zhì)的吞噬和毒害等;其次,固定化載體內(nèi)部有較高的孔隙度,可以容納細(xì)胞的增殖,同時(shí)細(xì)胞分泌的胞外酶可經(jīng)過(guò)孔隙釋放到外界降解污染物,或細(xì)胞本身可將從孔隙進(jìn)入的低濃度的污染物直接降解而不受到高濃度污染物的毒害。

    本研究所用菌株屬于希瓦氏菌屬,該屬菌株呼吸類(lèi)型多樣,能利用有機(jī)物產(chǎn)生能量,能還原金屬鹽[5-10]、硝酸鹽和腐殖酸等有機(jī)污染物[7,10],也能將染料脫色,此外,還發(fā)現(xiàn)多個(gè)希瓦氏菌株能產(chǎn)電。目前,希瓦氏菌在醫(yī)學(xué)、環(huán)境科學(xué)、電化學(xué)、海洋生物學(xué)等多個(gè)領(lǐng)域均得到應(yīng)用,具有很高的研究?jī)r(jià)值。而本文對(duì)希瓦氏菌固定化的研究,也有助于該屬細(xì)菌在各個(gè)領(lǐng)域的更好應(yīng)用。

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