皂角苷強化白腐真菌Phlebia brevispora降解林丹的研究

肖鵬飛，KONDO Ryuichiro

(1.東北林業(yè)大學林學院, 黑龍江 哈爾濱 150040; 2.九州大學農學院, 日本 福岡 8128581)

皂角苷強化白腐真菌Phlebiabrevispora降解林丹的研究

肖鵬飛1，KONDO Ryuichiro2

(1.東北林業(yè)大學林學院, 黑龍江 哈爾濱 150040; 2.九州大學農學院, 日本 福岡 8128581)

【目的】為了提高環(huán)境中持久性有機氯農藥的生物降解效果?！痉椒ā坷闷胶庹袷幏ㄑ芯苛松锉砻婊钚詣┰斫擒諏τ袡C氯農藥林丹的增溶作用，并通過液相培養(yǎng)法研究了皂角苷對白腐真菌Phlebiabrevispora生長以及降解林丹的強化效果?！窘Y果】皂角苷能大幅度增加林丹的溶解度，實驗濃度范圍內增溶倍數(shù)最高可達到7.4。皂角苷作為生長基質可促進P.brevispora的生長，提高其生物量，但濃度在達到1.0 g/L時，菌株生物量幾乎不再繼續(xù)增加。在0.05～1.0 g/L濃度范圍內，皂角苷能顯著提高菌株對溶液中林丹的降解效果(P<0.05)，且降解率隨著皂角苷濃度的增加而增加，降解率最大可提高14.1 %。添加0.5和1.0 g/L的皂角苷處理時，菌株胞內粗酶液對林丹的降解率顯著高于不添加皂角苷的處理(P<0.05)。皂角苷對林丹的增溶效果隨著無機鹽的加入而提高，20 mmol/L的NaCl和Na2SO4使林丹的溶解度提高了1.17和1.26倍； 而在含有皂角苷的降解體系中，NaCl的添加進一步促進了林丹的生物降解效果，降解率提高了10 %以上。【結論】本研究結果表明，利用皂角苷強化微生物降解去除環(huán)境中的有機污染物是可行的，具有一定的實際應用價值。

皂角苷; 林丹; 增溶作用; 白腐真菌; 生物降解; 胞內酶

【研究意義】我國于1952年開始生產有機氯農藥六六六(Hexachlorocyclohexane，HCH)并被廣泛使用于農業(yè)病蟲害防治。截止至1998年，我國六六六的累計用量達到446萬t，幾乎占全球使用量的一半[1]。六六六在我國被禁用多年，但仍有較高的環(huán)境殘留[2]，并可通過食物鏈、呼吸及皮膚接觸等途徑進入人體并產生毒害作用。據(jù)估計，2004年包括河北、北京、天津和山東部分地區(qū)在內的30萬km2區(qū)域內，表土中六六六殘留儲量達(430±110) t，且大部分地區(qū)的表土已從禁用前的匯轉變?yōu)槎挝廴驹碵3]。2009年，六六六的三種同分異構體α-HCH、β-HCH與γ-HCH(林丹)被增補列入《斯德哥爾摩公約》中的受控的持久性有機污染物名單中?？梢姡行コh(huán)境中殘留的六六六類農藥，對于保護糧食安全和人群健康尤為重要?！厩叭搜芯繜狳c】作為六六六中唯一具有殺蟲效果的林丹，化學性質穩(wěn)定、親脂性強、難以生物降解，環(huán)境殘留期長。近年來國內學者在林丹降解菌的分離篩選、工程菌構建、酶促降解及土壤生物修復等方面開展了一些研究工作[4-7]。但林丹疏水性強，在土壤中與土壤顆粒結合緊密，在實際應用過程中存在微生物利用效率低的問題，因此如何提高林丹的水溶解度和生物可利用性是解決生物修復效率問題的關鍵因素。表面活性劑由于其特殊的分子結構特點，具有親水、親油雙重特性，可通過膠束對疏水性有機污染物產生增溶效果，從而提高其生物可利用性，以達到強化生物修復效率的目的。目前該技術研究中多使用化學表面活性劑，其存在成本較高，用量大，容易對環(huán)境造成二次污染等問題。相比于化學表面活性劑，生物表面活性劑除了增溶效果好、用量少、成本低廉等特點外，還具有無毒、生物降解性好、無二次污染風險等一般化學表面活性劑不具備的特點[8]?！颈狙芯壳腥朦c】目前研究中受關注最多的生物表面活性劑是鼠李糖脂，而其它生物表面活性劑研究很少。皂角苷廣泛存在于植物中，它是以多環(huán)式化合物為配基的配糖體的總稱，具有良好的乳化、分散及增溶等性能，是一種優(yōu)良的天然表面活性劑，而且皂角苷從植物提取和分離較為容易，已廣泛用于醫(yī)藥和日用化工等方面[8-9]?！緮M解決的關鍵問題】作者前期研究了白腐真菌對一些持久性有機氯農藥的降解特性，但在降解效率等方面仍存在一定的制約[7,10]。因此，本文在前期研究的基礎上，擬進一步考察生物表面活性劑皂角苷對林丹的增溶效果，以及對菌株及其酶系降解水溶液中林丹的強化機制，探討皂角苷應用在有機物污染治理中的可行性，為完善有機污染土壤的修復技術提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試劑與儀器

林丹(98.6 %)購于Dr. Ehrenstorfer公司。皂角苷(98 %)購自上海易利生物科技有限公司。PDA培養(yǎng)基和PDB培養(yǎng)基購于北京奧博星生物技術有限責任公司。其它試劑均為國產分析純。主要儀器有KQ-250VDB型雙頻數(shù)控超聲波清洗器(昆山超聲儀器)、HNY-1102C氣浴恒溫振蕩儀(天津歐諾)、超聲波細胞破碎機(上海生析)、H1650臺式高速離心機(湖南湘儀)、旋轉蒸發(fā)儀(上海亞榮)、HP6890-5973型氣相色譜-質譜聯(lián)用儀(美國Agilent)等。

1.2 菌株培養(yǎng)

將冷藏保存的白腐真菌PhlebiabrevisporaTMIC34596轉移接種至PDA固體培養(yǎng)基表面，30 ℃靜置培養(yǎng)至菌絲布滿培養(yǎng)基表面。將菌絲體刮下轉移至無菌水中，輕輕振蕩形成白色的孢子懸浮液。取少量菌懸液接種于裝有PDB液體培養(yǎng)基的大錐形瓶中，在30 ℃、150 r/min條件下活化培養(yǎng)。培養(yǎng)3～5 d后用平板計數(shù)法測定孢子數(shù)，當孢子數(shù)達到106個/mL以上時進行降解試驗。

1.3 胞內酶的提取方法

取一定量已經活化好的種子液，在5000 r/min條件下離心10 min，過濾后將菌絲體用pH 7.5的0.05 mol/L磷酸鹽緩沖液洗滌2次。再加入適量的緩沖液后，冰浴條件下細胞破碎處理20 min(破碎30 s后間歇30 s)，12 000 r/min離心10 min后，收集液相部分即為胞內粗酶液。

1.4 試驗方法

1.4.1 增溶實驗 采用批量平衡振蕩法，用去離子水配制不同濃度的皂角苷溶液，取20 mL溶液加入到錐形瓶中，添加稍過量的林丹粉末，蓋塞后置于超聲波清洗器中超聲溶解30 min。取出錐形瓶并放入空氣浴恒溫振蕩器中120 r/min、25 ℃振蕩12 h使溶解達到平衡。取出錐形瓶并將溶液轉移至離心管，為分離未溶解的林丹，6000 r/min下離心10 min。取適量上清液用等體積的乙酸乙酯萃取3次。萃取相合并后，用無水硫酸鈉脫水干燥，旋轉蒸發(fā)儀濃縮至微量，待測。

1.4.2 生長影響實驗 在錐形瓶中加入20 mL滅菌的PDB液體培養(yǎng)基和一定量的皂角苷溶液，使其濃度分別為0、0.05、0.1、0.2、0.5和1.0 g/L，再接種2 mL的白腐菌種子液，搖勻，30 ℃靜置培養(yǎng)，定時取樣。采用菌絲干重法測定生物量，通過離心、過濾得到的菌絲體，用清水反復洗滌，然后置于105 ℃下烘干至恒重稱量。

1.4.3 菌株降解實驗 配制一定濃度的林丹丙酮溶液并加入到錐形瓶，將其置于通風廚中使溶劑揮發(fā)。將PDB液體培養(yǎng)基高溫滅菌后取20 mL加入錐形瓶，并接種2 mL活化好的菌株種子液。取適量的皂角苷溶液加入錐形瓶，液相中林丹的初始濃度為50 μmol/L。將錐形瓶搖勻，充氧30 s后蓋塞。將錐形瓶放置于30 ℃培養(yǎng)箱中靜置培養(yǎng)，定時取樣。對照處理中將菌株種子液高溫滅菌(121 ℃、20 min)處理后按同樣方法進行。取出錐形瓶后，將樣品轉入離心管，使用高速勻質機將菌塊均勻化后，3000 r/min、10 min離心處理，取出上清液，用等體積的乙酸乙酯萃取，脫水、濃縮至微量，待測。

1.4.4 菌株胞內酶降解實驗 取適量林丹的丙酮溶液移入反應瓶，待溶劑揮發(fā)后加入磷酸鹽緩沖液(pH 6.0)以及皂角苷溶液，將反應瓶置于30 ℃水浴鍋預熱10 min，然后加入1.0 mL的胞內粗酶液，反應液總體積為10 mL。反應體系中林丹的初始濃度為50 μmol/L。30 ℃、100 r/min條件下反應2 h后取出，用三氯醋酸終止反應。將培養(yǎng)液用20 mL乙酸乙酯萃取3次，萃取液合并后經無水硫酸鈉脫水、濃縮至微量，待測。設加入高溫(121 ℃、20 min)失活的酶液作對照組。

1.5 分析條件

氣相色譜柱為DB-5MS (30 m×0.25 mm×0.25 μm)。載氣為高純氦氣，流量為1 mL/min。進樣口溫度250 ℃，不分流進樣，進樣量1 μl。升溫程序為：起始溫度80 ℃，保持3 min后以20 ℃/min升至300 ℃并保持2 min。采用內標準法定量。本研究中每個處理均做3個重復。

2 結果與分析

2.1 皂角苷對林丹的增溶效果

如圖1所示，在低濃度(0.05和0.1 g/L)皂角苷溶液中，林丹的溶解度相比于水溶解度(7.9 mg/L)雖略有增加但并不明顯；而當皂角苷濃度大于其臨界膠束濃度(CMC，0.145 g/L)時，林丹的溶解度顯著升高。在0.4 g/L的皂角苷溶液中，林丹的溶解度達到27.4 mg/L，隨著皂角苷濃度的增加，林丹的溶解度也呈線性增加，在1.0 g/L的皂角苷溶液中，林丹的溶解度達到58.3 mg/L，相比于水溶解度提升了7.4倍。這是由于皂角苷濃度達到CMC值以上時產生了大量的膠束，林丹分子被分配到膠束分子中從而產生了增溶現(xiàn)象，使其溶解度大幅度提高。吳應琴等[8]研究了皂角苷對多環(huán)芳烴蒽的增溶作用，發(fā)現(xiàn)無論是CMC值以下還是以上，皂角苷對蒽都具有一定的增溶效果，當皂角苷濃度為0.6 g/L時，對蒽的增溶率比非離子表面活性劑TritonX100高出54.91 %。而楊娟娟等[9]同樣以皂角苷為增溶劑研究了對芘的增溶效果，發(fā)現(xiàn)當皂角苷濃度為0.4 g/L時，芘的表觀溶解度為17.4 mg/L，是水溶解度的133倍，增溶效果同樣高于非離子表面活性劑。

圖1 林丹在皂角苷溶液中的溶解度Fig.1 Water solubility of γ-HCH in saponin solutions

2.2 皂角苷對P. brevispora生長的影響

一些表面活性劑生物降解性好，可被微生物作為碳源利用而提高微生物的生長和代謝活性；而有些表面活性劑在一定濃度下會對降解菌產生毒性，使其數(shù)量和活性下降。因此，在污染物的生物處理過程中，選擇合適的表面活性劑類型及濃度對于提高處理效率至關重要。由圖2可知，在未添加皂角苷的對照處理中，菌株在經過前期的適應階段后生物量隨時間的延長迅速提高，至第8天后菌絲干重達到2.54 g/L，之后由于培養(yǎng)基的消耗，其生物量變化不大。在不同濃度的皂角苷溶液中，除第2天與對照處理在生物量沒有明顯差異外，第4天之后的不同濃度處理與對照相比均有不同程度的提高，尤其在高濃度處理中的生物量顯著高于對照和低濃度處理(P<0.05，下同)。如在0.5 g/L的皂角苷溶液中，培養(yǎng)4 d后的生物量不僅比對照處理均提高了20 %以上，表明適當提高皂角苷濃度有利于提高菌株的生長。但在1.0 g/L的皂角苷溶液中，菌株生物量相比于0.5 g/L的濃度處理并沒有明顯提高。該結果與一些學者報道的生物表面活性劑對微生物生長的影響效果一致[10-12]。王芳芳等[11]研究發(fā)現(xiàn)皂角苷在0.01～0.2 g/L濃度范圍內，可作為蘇云金芽孢桿菌的碳源對其生長起促進作用，而0.5 g/L的皂角苷則會不利于菌株的生長。本研究結果表明，皂角苷在一定的濃度范圍(0～0.5 g/L)內會促進菌株的生長和繁殖速度，提高其生物量，但濃度進一步提高對菌株生長沒有明顯的促進效果。

不同字母表示各處理間差異顯著(P<0.05)Different letter indicate significant difference (P<0.05)圖2 P. brevispora在含不同濃度皂角苷的培養(yǎng)基中的生物量Fig.2 The biomass of P. brevispora on medium with saponin at different concentration

2.3 皂角苷對P. brevispora降解林丹的影響

如圖3所示。在未加皂角苷的對照處理中，菌株對林丹顯示出一定的降解效果，且隨著培養(yǎng)時間的延長降解率逐漸增加，在處理18 d后降解率可達到72.3 %。而在添加皂角苷處理中，林丹的降解率相比于對照處理均發(fā)生了不同程度的變化。在降解開始后的第3和6天，幾乎所有濃度梯度的皂角苷溶液中，林丹的降解率均顯著高于對照處理?？梢娫斫擒盏奶砑用黠@促進了P.brevispora對水溶液中林丹的降解效果。同時隨著處理時間的增加，不同濃度皂角苷處理間林丹降解率的差異也逐漸顯現(xiàn)出來，且呈現(xiàn)出皂角苷濃度越高，林丹降解率越大的趨勢。如處理12、15和18 d，1.0 g/L的皂角苷溶液中林丹的降解率均達到同時期處理中最高，分別為57.6 %、75.8 %和86.4 %，分別比對照提高了10.0 %、12.3 %和14.1 %，同時也顯著高于低濃度(0.05～0.2 g/L)皂角苷溶液中的林丹降解率。

本研究中，當皂角苷濃度低于0.1 g/L時，由于沒達到其CMC值(0.145 g/L)，膠束生成量較少，增溶作用并不是強化降解率的主要因素，但可作為生長基質刺激菌株的生長代謝活性[12]。還有研究指出一些表面活性劑可在較低濃度時改變細胞膜通透性，提高酶活力和催化能力[13]。當皂角苷濃度高于CMC值時，膠束的大量生成對林丹起到較好的增溶作用，增加了林丹與降解菌的接觸機會，使林丹的生物可降解性增加。即使在對菌株的生長開始產生抑制作用的高濃度(1.0 g/L)的皂角苷溶液中，林丹的降解率相比于0.5 g/L的皂角苷添加體系仍有增加?？梢姡斫擒諒娀值さ慕到鈾C制包括增加林丹的生物可利用性和影響菌株生理活性兩方面的綜合結果。

2.4 皂角苷對P. brevispora胞內粗酶液降解林丹的影響

前期研究已經證實，P.brevispora對林丹的降解是胞內酶和胞外酶共同催化完成的，但胞內酶降解占主導作用[7]，因此本研究進一步考察了皂角苷對胞內粗酶液降解林丹的促進效果。由圖4可見，林丹的降解率的變化與酶降解時間及皂角苷濃度有關。在酶處理30 min后，雖然添加皂角苷處理時降解率略有增加但與對照相比并不顯著；在60 min時，添加1.0 g/L的皂角苷處理中林丹降解率顯著高于對照和0.5 g/L濃度處理；在90 min時，添加皂角苷處理中的林丹降解率顯著高于對照處理；在120 min時，各濃度處理之間的降解率均呈現(xiàn)顯著差異，此時1.0 g/L的皂角苷溶液中林丹降解率比對照和0.5 g/L濃度處理分別提高了10.0 %和4.8 %，達到了70.2 %?？梢娏值ねㄟ^皂角苷的增溶作用增加了和降解酶的接觸，從而增加了降解效率。本結果發(fā)現(xiàn)，處理時間越長，皂角苷對林丹酶促降解的強化效果越好，這可能與增溶的平衡時間有關。在增溶作用達到平衡之前，振蕩處理時間越長，通過增溶作用進入液相的林丹分子越多，酶降解率就越高。

圖3 皂角苷對P. brevispora降解林丹的影響Fig.3 Effects of saponin on degradation of γ-HCH by P. brevispora

2.5 無機鹽對增溶作用及生物降解的影響

以NaCl和Na2SO4為例研究不同濃度的無機鹽對1.0 g/L的皂角苷增溶林丹的影響。如圖5所示，在添加較低濃度的無機鹽時，林丹的溶解度即可大幅提高。當NaCl和Na2SO4濃度為10 mmol/L時，林丹溶解度從58.3 mg/L分別提高到66.0和69.4 mg/L，隨著無機鹽濃度的繼續(xù)升高，林丹溶解度仍呈現(xiàn)繼續(xù)增加的趨勢，當NaCl和Na2SO4濃度達到20 mmol/L時，林丹溶解度分別增加到68.3和73.2 mg/L，分別提高了1.17和1.26倍。王歡等[14]、郭利果[15]等均發(fā)現(xiàn)鈉鹽在較低濃度下即對多環(huán)芳烴的增溶有較強的促進效應。皂角苷是非離子型表面活性劑，一般認為，無機鹽通過對疏水基的鹽析作用，降低非離子表面活性劑的濁點，降低其CMC值，增加膠束聚集數(shù)，從而締合成更大的膠束。還有研究認為，皂角苷分子中含有部分帶電基團(羧基等)，金屬離子強度的增大可減弱皂角苷分子間的靜電排斥作用，降低皂角苷溶液的CMC值，增大皂角苷的增溶能力[8]。有研究已經證實當NaCl濃度從0.01 mol/L增大到1.0 mol/L時, 皂角苷溶液CMC值由約50.0 mg/L降低到約8.6 mg/L[16]。

圖4 皂角苷對胞內粗酶液降解林丹的影響Fig.4 Effects of saponin on degradation of γ-HCH by intracellular enzyme from P. brevispora

圖5 無機鹽對皂角苷增溶林丹的影響Fig.5 Effects of inorganic salts on solubilization of γ-HCH by saponin

基于以上結果，設定皂角苷濃度為0.5 g/L，將不同濃度的NaCl加入菌株降解體系，擬進一步探討無機鹽對皂角苷強化菌株降解林丹的影響。如圖6所示，降解第3天，添加高濃度(6～10 mmol/L)NaCl處理中的降解率顯著高于對照和低濃度處理(2～4 mmol/L)；而降解第6天之后不同處理間的降解率差異更加明顯，高濃度處理顯著高于低濃度處理，低濃度處理又顯著高于對照處理。如添加10 mmol/L的NaCl處理中林丹的15 d降解率為85.1 %，顯著高于濃度為2 mmol/L時的降解率79.9 %和對照處理的降解率74.6 %。即在本試驗濃度范圍內，呈現(xiàn)出NaCl濃度越高，林丹生物降解率越高的規(guī)律。如前文所述，無機鹽的添加可降低皂角苷的CMC值，增大皂角苷增溶林丹的能力，使其生物可降解性進一步增加，從而提高了降解率。此外，金屬離子還可以提高白腐真菌的生物降解活性。何寶燕等[17]研究發(fā)現(xiàn)Fe2+等金屬離子在一定濃度范圍內可促進白腐真菌黃孢原毛平革菌對十溴聯(lián)苯醚的降解，并一定程度提高菌株分泌的胞外酶的活力。盧永等[18]也報道了Cu2+等金屬離子對黃孢原毛平革菌降解苯酚有明顯的強化效果，縮短苯酚降解時間。

3 結 論

(1)在0～1.0 g/L濃度范圍內，皂角苷可有效增加林丹的溶解度，且增溶效果隨皂角苷濃度的增加而顯著增加；在1.0 g/L的皂角苷溶液中，林丹的溶解度相比于水溶解度提升了7.4倍。0～0.5 g/L的皂角苷可促進菌株P.brevispora的生長繁殖，增加其生物量；但濃度繼續(xù)升高至1.0 g/L時，菌株的生長受到一定程度的影響，生物量幾乎不再繼續(xù)增加。

圖6 無機鹽對P. brevispora降解林丹的影響Fig.6 Effects of inorganic salts on degradation of γ-HCH by P. brevispora

(2) 皂角苷可通過對林丹的增溶和對菌株生長的促進作用影響P.brevispora對林丹的降解效果。高濃度的皂角苷更有利于菌株對林丹的降解，相比于對照處理，當皂角苷濃度為1.0 g/L時的林丹降解率最高可增加14.1 %。林丹經菌株胞內粗酶液降解60 min后，0.5和1.0 g/L的皂角苷同樣能顯著提高林丹的酶促降解效果，相比于對照處理，降解率最高可提高10 %。

(3) 無機鹽的加入可提高皂角苷的增溶能力，20 mmol/L的NaCl和Na2SO4使林丹的溶解度相比于不添加無機鹽處理分別提高了1.17和1.26倍。此外，NaCl的添加進一步提高了皂角苷對菌株降解林丹的強化效果，林丹降解率提高10 %以上。本研究結果表明，利用皂角苷強化白腐真菌降解去除環(huán)境中的有機污染物是可行的，具有一定的實際應用潛力。

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EnhancementofSaponinforBiodegradationofγ-HCHbyWhiteRotFungusPhlebiabrevispora

XIAO Peng-fei1, KONDO Ryuichiro2

(1. College of Forestry, Northeast Forestry University, Heilongjiang Harbin 150040, China; 2. Faculty of Agriculture, Kyushu University, Fukuoka 8128581，Japan )

【Objective】The present study was conducted to improve the effect on biodegradation of persistent organochlorine pesticides.【Method】The effects of biosurfactant saponin on solubilization of chlorinated pesticidesγ-HCH, and biodegradation ofγ-HCH by fungusPhlebiabrevisporawere investigated using balance vibration method and liquid culture method respectively. 【Result】The results of solubilization indicate that the solubility ofγ-HCH could be enhanced by saponin at 0.05-1.0 g/L. The fungal biomass ofP.brevisporawith saponin of high concentration were larger than that without saponin and that with saponin of low concentration. The saponin could significantly increase the degradation rate ofγ-HCH byP.brevisporaand the degradation efficiency increased with incresing saponin concentration. The highest efficiency was increased by 14.1 % compared to the control. It was also found that saponin at 0.5 and 1.0 g/L significantly increased degradation rate ofγ-HCH by intracellular enzyme fromP.brevispora, after 60 min of degradation. The solubility and biodegradation rate ofγ-HCH were enhanced by addition of inorganic salts including NaCl and Na2SO4of 20 mmol/L. 【Conclusion】The results confirmed the workability of saponin-white rot fungus augmented remediation of contaminated environments.

Saponin;γ-HCH; Solubilization;P.brevispora; Biodegradation; Intracellular enzyme

1001-4829(2017)5-1109-06

10.16213/j.cnki.scjas.2017.5.022

2016-06-24

國家自然科學基金項目(41201307)；教育部留學回國人員科研啟動基金([2013]693)

肖鵬飛(1978-)，男，博士，副教授，主要從事有機物污染土壤的修復技術研究，E-mail:xpfawd@nefu.edu.cn。

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(責任編輯 李山云)