• <tr id="yyy80"></tr>
  • <sup id="yyy80"></sup>
  • <tfoot id="yyy80"><noscript id="yyy80"></noscript></tfoot>
  • 99热精品在线国产_美女午夜性视频免费_国产精品国产高清国产av_av欧美777_自拍偷自拍亚洲精品老妇_亚洲熟女精品中文字幕_www日本黄色视频网_国产精品野战在线观看 ?

    鱘源病原菌HD0824的分離鑒定及藥敏特性研究

    2017-11-09 11:42:22楊移斌夏永濤楊先樂艾曉輝
    西南農(nóng)業(yè)學(xué)報 2017年5期
    關(guān)鍵詞:鱘魚西伯利亞水氣

    楊移斌,劉 洋,夏永濤,楊先樂,艾曉輝*

    (1.中國水產(chǎn)科學(xué)研究院長江水產(chǎn)研究所, 湖北 武漢 430223; 2.江西省奉新縣畜牧水產(chǎn)局, 江西 奉新 330700; 3.中國水產(chǎn)科學(xué)研究院北京院部, 北京 100039; 4.上海海洋大學(xué) 國家水生動物病原庫, 上海 201306)

    鱘源病原菌HD0824的分離鑒定及藥敏特性研究

    楊移斌1,劉 洋2,夏永濤3,楊先樂4,艾曉輝1*

    (1.中國水產(chǎn)科學(xué)研究院長江水產(chǎn)研究所, 湖北 武漢 430223; 2.江西省奉新縣畜牧水產(chǎn)局, 江西 奉新 330700; 3.中國水產(chǎn)科學(xué)研究院北京院部, 北京 100039; 4.上海海洋大學(xué) 國家水生動物病原庫, 上海 201306)

    【目的】對患病西伯利亞鱘進(jìn)行病原分離、鑒定及藥敏實驗,為鱘嗜水氣單胞菌病的防控提供參考?!痉椒ā繌幕疾〉奈鞑麃嗺\(Acipenserbaerii)的體內(nèi)分離到一株致病菌株HD0824,該菌株具有高致病性,能使小白鼠24 h 內(nèi)死亡。經(jīng)過人工感染,感染用魚出現(xiàn)與自然發(fā)病相同的癥狀,表明菌株HD0824為鱘魚此病病原?!窘Y(jié)果】菌株HD0824為革蘭氏陰性桿,無芽孢和莢膜,在兔血平板上能形成明顯的β-溶血,蛋白酶活性很強(qiáng)。經(jīng)過生理生化鑒定及16S rDNA序列分析,菌株HD0824為嗜水氣單胞菌(Aeromonashydrophila),同源性達(dá)99 %。此外,分離菌株HD0824對慶大霉素、強(qiáng)力霉素、氯霉素、丁胺卡那霉素、氟苯尼考、頭孢噻肟、阿奇霉素及左氧氟沙星8種藥物高度敏感,對新霉素中度敏感?!窘Y(jié)論】分離菌株HD0824是西伯利亞鱘病原菌,養(yǎng)殖時可選用慶大霉素及氟苯尼考等藥物進(jìn)行防控。

    嗜水氣單胞菌(Aeromonashydrophila);西伯利亞鱘(Acipenserbaerii);鑒定;藥敏特性

    【研究意義】鱘魚隸屬于鱘形目(Acipenseriformes)全身大部分是軟骨,常被稱為軟骨硬鱗魚類。鱘魚是大型經(jīng)濟(jì)魚類,因其肉質(zhì)鮮美、骨脆營養(yǎng)豐富、具有較高的食用經(jīng)濟(jì)價值,特別是用其卵加工而成的魚子醬富含高蛋白、微量元素和多種維生素,更是馳名中外的高檔食品,素有“黑色黃金”之稱?!厩叭搜芯窟M(jìn)展】目前中國鱘魚養(yǎng)殖種類主要有西伯利亞鱘、史氏鱘等,西伯利亞鱘因具有生長速度快、適應(yīng)能力強(qiáng)、成活率高、抗病力強(qiáng)、食用營養(yǎng)豐富、魚籽醬品質(zhì)好等特點(diǎn),使其成為鱘魚養(yǎng)殖產(chǎn)量最大的品種[1]。然而隨著人工養(yǎng)殖規(guī)模不斷擴(kuò)大,養(yǎng)殖節(jié)約化程度不斷提高。鱘魚養(yǎng)殖受到各種疾病困擾[2-8],病害已經(jīng)成為鱘魚健康養(yǎng)殖的一大阻力,因此對于鱘魚養(yǎng)殖中遇到的疾病進(jìn)行病原分離鑒定及藥敏試驗顯得尤為重要。2011年9月初在浙江省衢州市鱘魚養(yǎng)殖場發(fā)現(xiàn)西伯利亞鱘出現(xiàn)以肛門紅腫潰爛,肝臟充血出血,體壁充血,脾臟充血發(fā)黑,性腺潰爛甚至掉出體外,性腺上分布有出血點(diǎn),有大量血水流從生殖孔流出為主要癥狀的急性敗血癥,死亡率高達(dá)80 %,死亡個體大多在20 kg左右,最大個體達(dá)50 kg,損失極為嚴(yán)重?!颈狙芯壳腥朦c(diǎn)】本研究從發(fā)病的西伯利亞鱘體內(nèi)分離到一株細(xì)菌HD0824,動物攻毒試驗表明此細(xì)菌具有很強(qiáng)的致病力,經(jīng)常規(guī)生理生化鑒定,16S rDNA基因系列測定和系統(tǒng)發(fā)育分析的方法對該細(xì)菌進(jìn)行了分類鑒定,并進(jìn)一步研究其藥敏特性?!緮M解決的關(guān)鍵問題】以期豐富鱘魚疾病病原的生物學(xué)特性,為鱘魚疾病科學(xué)有效防控提供理論指導(dǎo)。

    1 材料與方法

    1.1 供試材料

    1.1.1 病魚收集 自然患病鱘魚來源于浙江省衢州鱘魚養(yǎng)殖基地,取自然發(fā)病癥狀典型的鱘魚為備用材料。

    1.1.2 主要儀器 恒溫培養(yǎng)箱,冰箱,高壓蒸汽滅菌鍋,搖床,PCR儀,核酸電泳儀,顯微鏡,無菌操作臺,恒溫水浴鍋,電子爐。

    1.1.3 主要試劑 普通營養(yǎng)瓊脂、腦心浸出液、胰蛋白胨大豆瓊脂(TSA)、兔血營養(yǎng)瓊脂、10 g/L脫脂奶蔗糖胰蛋白胨瓊脂培養(yǎng)基、水解酪蛋白瓊脂(MH)按常規(guī)方法自配;細(xì)菌生化微量鑒定管購自杭州微生物試劑有限公司;細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒、PCR擴(kuò)增細(xì)菌16S rDNA試劑盒,TaqDNA聚合酶均購自上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司;藥敏紙片購自杭州微生物試劑有限公司;革蘭染料購自杭州微生物試劑有限公司。

    1.1.4 試驗動物 健康西伯利亞鱘,由浙江省衢州市鱘魚養(yǎng)殖基地提供;6周齡雌性12只小白鼠購自上海實驗動物中心。

    1.2 試驗方法

    1.2.1 流行病學(xué)調(diào)查 調(diào)查養(yǎng)殖場鱘魚發(fā)病率及死亡率,了解發(fā)病鱘魚種類及規(guī)格大小,掌握養(yǎng)殖水域環(huán)境狀況。查看鱘魚發(fā)病各個時期癥狀及解剖觀察,確定鱘魚此疾病的基本癥狀,取發(fā)病癥狀典型的病魚備用。

    1.2.2 病毒排除試驗 取病魚潰爛明顯的性腺作為病毒排除試驗材料,將其剪碎,其后在研缽中加玻璃珠繼續(xù)研磨,加等量生理鹽水,5000轉(zhuǎn)離心10 min,取上清液,加入每1 mL上清液中加入10 000單位的抗生素,包括青霉素和慶大霉素,經(jīng)5次凍融后使用。感染用鱘魚10尾平均分成2組,試驗組每尾西伯利亞鱘注射上清液0.2 mL,對照組每尾注射等量生理鹽水。試驗期間正常投喂,連續(xù)充氧,保持水溫26 ℃,水質(zhì)良好,溶氧正常。定期觀察鱘魚動態(tài),記錄發(fā)病及死亡情況。結(jié)果試驗組西伯利亞鱘未出現(xiàn)自然發(fā)病癥狀,更未出現(xiàn)死亡,故排除病原為病毒的可能性。

    1.2.3 病原菌分離純化 選具有典型自然發(fā)病癥狀瀕死的西伯利亞鱘,用75 %的酒精反復(fù)擦拭病魚體表后,在無菌條件下,取性腺、肝臟等病灶部位少許以及少量血水,分別于胰蛋白胨大豆瓊脂(TSA)培養(yǎng)基和普通營養(yǎng)瓊脂平板上劃線分離,置于28 ℃培養(yǎng)箱中恒溫培養(yǎng)24 h,挑起形態(tài)一致,優(yōu)勢度大的單一菌落進(jìn)一步劃線純化,并接種于TSA培養(yǎng)基斜面于4 ℃冰箱保存。

    1.2.4 動物攻毒試驗 分離純化后的菌株HD0824接種于營養(yǎng)瓊脂上28 ℃培養(yǎng)24 min,用無菌生理鹽水洗下菌苔,用麥?zhǔn)媳葷岱y定并調(diào)節(jié)菌懸液濃度為4×107CFU/mL。

    人工感染:選取健康的西伯利亞鱘,設(shè)1個試驗組和1個對照組。試驗組為6尾,對照組為4尾,每組設(shè)置2個重復(fù)。試驗組胸鰭基部注射菌懸液0.2 mL,對照組胸鰭基部注射等量無菌生理鹽水。試驗期間正常投喂,連續(xù)充氧,保持水溫20~22 ℃,水質(zhì)良好,溶氧正常。定期觀察鱘魚動態(tài),記錄發(fā)病及死亡情況,并對瀕死鱘魚及時進(jìn)行解剖和病原分離。

    毒力檢測試驗:選取健康小白鼠12只,平均分成A、B、C 3 組,A組注射菌懸液0.1 mL,B組注射菌懸液0.2 mL,C 組注射0.2 mL無菌生理鹽水,均采取腹腔注射。觀察24 h 內(nèi)小白鼠死亡情況。

    1.2.5 病原菌形態(tài)學(xué)觀察及理化特性檢測 將分離菌株HD0824接種于普通營養(yǎng)瓊脂平板、TSA平板、兔血營養(yǎng)瓊脂平板和10 g/L脫脂奶蔗糖胰蛋白胨瓊脂培養(yǎng)基平板,28 ℃培養(yǎng)24 h后觀察菌落的大小、形態(tài)、溶血狀況及蛋白酶活性,同時進(jìn)行革蘭氏染色,用光學(xué)顯微鏡進(jìn)行細(xì)菌形態(tài)學(xué)觀察,其他各項生理生化指標(biāo)的測定參照有關(guān)文獻(xiàn)進(jìn)行[9]。

    1.2.6 分離菌株HD0824的16S rDNA基因序列測定與分析 (1)PCR模板的制備:將細(xì)菌HD0824接種于腦心浸出液培養(yǎng)基(BHI)中,28 ℃搖菌18 h后12 000 r/min離心收集菌體,按細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒說明書提取細(xì)菌總DNA,作為PCR的模板DNA。

    (2)16S rDNA基因系列的擴(kuò)增與測序:用于16S rDNA的PCR反應(yīng)的引物由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司合成。

    正向引物為27F:5’-AGAGTTTGATC(C/A)TGGCTCAG-3’(對應(yīng)于E.coli的16S rRNA基因的第8~27 bp位置);反向引物1492R:5’-GGTTACCTTGTTACGACTT-3’(對應(yīng)于E.coli的16S rRNA基因的第1492~1510 bp位置);PCR反應(yīng)條件為:95 ℃變性3 min,94 ℃平衡35 s,55 ℃退火35 s,72 ℃延伸1 min,此階段35個循環(huán),72 ℃溫育10 min。經(jīng)PCR擴(kuò)增后的產(chǎn)物進(jìn)行1.0 %的瓊脂糖凝膠電泳檢測以證明PCR 擴(kuò)增得到的片段是否是目的片段后,將PCR的最終產(chǎn)物送上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司進(jìn)行純化和序列測定。

    (3)構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹:將菌株HD0824的16S rDNA序列用運(yùn)用NCBI數(shù)據(jù)庫中細(xì)菌的16S rDNA進(jìn)行比對,分離菌株HD0824從中選取數(shù)株與該株菌基因序列最相似的菌株和幾種水產(chǎn)常見病原菌,采用Clustal w軟件進(jìn)行多序列匹配分析,用MEGA5.1軟件包中的Neighbor-Joining法構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹,通過1000 次 Bootstrap檢驗置信度。

    1.2.7 藥敏試驗 藥敏試驗采用標(biāo)準(zhǔn)的K-B法,將菌株HD0824接種于腦心浸出液(BHI)培養(yǎng)基,置于28 ℃搖床培養(yǎng)18 h 后涂布于水解酪蛋白瓊脂(MH)平板。選擇 17 種藥敏紙片均勻貼于平板,每個平板貼 5 片,置28 ℃下培養(yǎng)24 h 后測量抑菌圈直徑(mm)。根據(jù)《現(xiàn)代診斷學(xué)手冊》[10]標(biāo)準(zhǔn)判定菌株對藥物的敏感性特性。

    2 結(jié)果與分析

    2.1 自然發(fā)病流行情況調(diào)查及臨床診斷

    2011年9月初浙江省衢州市鱘魚養(yǎng)殖基地鱘魚出現(xiàn)鱘魚死亡,發(fā)病后死亡率高達(dá)80 %,發(fā)病水溫在20 ℃及以上,發(fā)病個體在5~30 kg。發(fā)病初期病魚精神不振,或靜止不動,或狂游不止,有時也貼緊池壁游動,嚴(yán)重者身體失去平衡形成腹部露出水面的現(xiàn)象,幾乎不進(jìn)食。出現(xiàn)癥狀多數(shù)一周內(nèi)死亡,病魚受到刺激后可能數(shù)小時內(nèi)死亡。發(fā)病鱘魚主要集中在西伯利亞鱘,癥狀表現(xiàn)為鱘魚肛門一側(cè)出現(xiàn)細(xì)線紅腫,有開始潰爛癥狀,解剖后看到肝臟充血腫大而且出血,脾臟嚴(yán)重充血發(fā)黑,腎臟充血,腹腔有大量出血導(dǎo)致倒提鱘魚從生殖孔流出體外,體壁嚴(yán)重充血,也有體壁未充血的,性腺有大量出血點(diǎn),產(chǎn)生潰爛,更嚴(yán)重的是生殖孔與腹腔相連的膈膜爛穿,肛門一側(cè)潰爛開口,性腺掉出,直至鱘魚死亡。此病流行于水溫在20 ℃及以上,水溫低于20 ℃亦可能發(fā)病,但較少。發(fā)病鱘魚集中在西伯利亞鱘,其余鱘魚發(fā)病較少,雌雄鱘魚都可能發(fā)病。發(fā)病鱘魚個體目前發(fā)現(xiàn)最小3齡,據(jù)調(diào)查其他養(yǎng)殖基地也有類似疾病。

    2.2 病原菌分離純化

    從具有典型發(fā)病癥狀瀕死的病魚取性腺、肝臟等病灶部位少許以及少量血水劃線于普通營養(yǎng)瓊脂平板和TSA平板上,置于28 ℃恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)24 h 后經(jīng)純化獲得一株優(yōu)勢細(xì)菌,編號HD0824。該菌在營養(yǎng)瓊脂平板和TSA平板上生長良好,形成圓形,表面光滑,邊緣整齊,中央菌落呈凸起狀,直徑0.9~1.1 mm的透明的菌落。

    2.3 動物攻毒試驗

    2.3.1 人工感染 試驗組注射菌懸液12 h后,試驗用魚出現(xiàn)精神不振,或靜止不動,或狂游不止,肛門出現(xiàn)紅腫潰爛,14 h 后出現(xiàn)死亡,24 h 試驗組全部死亡,而對照組無任何異常。解剖后看到肝臟充血腫大而且出血,脾臟嚴(yán)重充血發(fā)黑,腎臟充血,腹腔有大量出血導(dǎo)致倒提鱘魚從生殖孔流出體外,體壁嚴(yán)重充血,性腺有大量出血點(diǎn),產(chǎn)生輕微潰爛,性腺未因肛門爛開而掉出體外,與自然發(fā)病鱘魚癥狀基本一致。并從感染死亡鱘魚肝臟、性腺及血水中分離到與菌株HD0824形態(tài)、生理生化特性和16S rDNA基因序列分析一致的細(xì)菌,表明菌株HD0824是西伯利亞鱘此病病原菌。

    2.3.2 毒力檢測試驗 試驗組小白鼠在24 h 內(nèi)死亡率達(dá)100 %,注射劑量為0.2 mL的試驗組先出現(xiàn)死亡,解剖后發(fā)現(xiàn)小白鼠肝臟嚴(yán)重出血并且壞死,腸道也出現(xiàn)出血現(xiàn)象。

    2.4 病原菌形態(tài)學(xué)觀察

    分離菌株HD0824為革蘭氏陰性短桿菌,沒有芽胞和莢膜。在TSA平板上菌落呈圓形,表面光滑,邊緣整齊,中央菌落呈凸起狀,直徑0.9~1.1 mm的透明的黃色菌落。在普通營養(yǎng)瓊脂平板上菌落呈淡黃色,圓形,表面光滑,中央菌落呈凸起狀,直徑0.6~0.9 mm的透明的菌落。

    2.5 病原菌理化特性檢測

    分離菌株HD0824為具有運(yùn)動能力的G-桿菌,在兔血營養(yǎng)瓊脂平板能產(chǎn)生β-溶血,蛋白酶活性檢測呈陽性,其它的生理生化特征見表1。

    2.6 分離菌株HD0824的16S rDNA基因PCR擴(kuò)增結(jié)果及系統(tǒng)發(fā)育分析

    PCR擴(kuò)增分離株HD0824獲得的16S rDNA基因片段約1500 bp。測序結(jié)果得出此系列1420 bp,把測序結(jié)果與NCBI中已收錄的相關(guān)性較高的16S rDNA序列進(jìn)行比對分析表明,從發(fā)病西伯利亞鱘體內(nèi)分離的細(xì)菌16S rDNA基因序列與嗜水氣單胞菌(Aeromonashydrophila)同源性最高,均為99 %,選取了檢索的部分16S rDNA用Neighbor-Joining方法進(jìn)行系統(tǒng)發(fā)育學(xué)分析,其系統(tǒng)發(fā)育樹如圖1所示。在系統(tǒng)發(fā)育樹上菌株HD0824與嗜水氣單胞菌(A.hydrophila)聚為一個分支。根據(jù)分離菌的形態(tài)特征及理化特性,結(jié)合16S rDNA序列測定與系統(tǒng)發(fā)育分析結(jié)果,判定該菌為嗜水氣單胞菌(A.hydrophila)。

    表1 HD0824菌株的生理生化特征

    注:“+”表示陽性,“-”表示陰性,“(+)”表示陽性反應(yīng)超過24h,“(-)”表示陰性反應(yīng)超過24h,“d”表示11 %~89 %菌株為陽性。

    Note:‘+’ means positive; ‘-’ means negative; ‘(+)’ The time of positive reaction exceed 24 h; ‘(-)’ The time of negative reaction exceed 24h; ‘d’ means 11 %-89 % strain is positive.

    2.7 藥敏試驗結(jié)果

    從表2可以看出,分離菌株HD0824對慶大霉素、強(qiáng)力霉素、氯霉素、丁胺卡那霉素、氟苯尼考、頭孢噻肟、阿奇霉素及左氧氟沙星8種藥物高度敏感,對新霉素中度敏感。

    3 討 論

    本研究從發(fā)病西伯利亞鱘肝臟、性腺及少量血水中均分離到一株優(yōu)勢度達(dá)99 %病原菌HD0824,為革蘭氏陰性短狀桿菌。通過動物攻毒試驗,發(fā)現(xiàn)其屬高致病性病原菌,人工感染西伯利亞鱘后產(chǎn)生肛門出現(xiàn)紅腫潰爛,肝臟充血腫大而且出血,脾臟嚴(yán)重充血發(fā)黑,腎臟充血,腹腔有大量出血導(dǎo)致倒提鱘魚從生殖孔流出體外,體壁嚴(yán)重充血,性腺有大量出血點(diǎn),產(chǎn)生輕微潰爛與自然發(fā)病鱘魚癥狀一致,表明此細(xì)菌為鱘魚此病的病原菌之一。根據(jù)細(xì)菌的形態(tài)學(xué)特征和生理生化特性初步確定為嗜水氣單胞菌(A.hydrophila),但由于其在利用D-甘露糖等與嗜水氣單胞菌標(biāo)準(zhǔn)菌株存在一定差異(表1),故而不能進(jìn)行準(zhǔn)確的鑒定,這也是細(xì)菌生化鑒定的弱點(diǎn)所在,每個反應(yīng)的程度受到各方面的影響,很難統(tǒng)一,故需尋找一種更為準(zhǔn)確的方法加以鑒定,和生化鑒定結(jié)合達(dá)到準(zhǔn)確分類鑒定細(xì)菌的目的。目前隨著科學(xué)技術(shù)的快速發(fā)展,特別是分子生物領(lǐng)域取得突破性進(jìn)展,細(xì)菌的鑒定也進(jìn)入到分子生物學(xué)時代,多種基因型分類方法也應(yīng)運(yùn)而生,如DNA雜交、rDNA指紋圖、質(zhì)粒圖譜、(G+ C)mol %、16S rDNA序列分析及Gyrb序列分析等。目前,由于16S rDNA 序列分析已廣泛應(yīng)用于水產(chǎn)動物病原菌的鑒定[11-12]。本研究基于HD0824菌株的16S rDNA基因序列構(gòu)建了系統(tǒng)發(fā)育樹,結(jié)果表明該菌與嗜水氣單胞菌同源性達(dá)到了99 %,同時結(jié)合形態(tài)學(xué)和理化特征鑒定該菌為嗜水氣單胞菌。本次西伯利亞鱘發(fā)病水溫在20 ℃左右,出現(xiàn)的癥狀與報道的敗血癥有一定的相似之處,但是不同的是本次發(fā)病鱘魚出現(xiàn)了性腺嚴(yán)重潰爛,甚至掉出體外,值得關(guān)注,潰爛的原因可能是嗜水氣單胞菌被解體后釋放毒素造成的,這提示治療包括嗜水氣單胞菌在內(nèi)的革蘭氏陰性菌引起的疾病應(yīng)注意使用抗菌藥后,需對體內(nèi)細(xì)菌釋放的內(nèi)毒素加以清除,才能達(dá)到更好的治療效果。

    嗜水氣單胞菌是在自然界中廣泛存在的[13],是一種典型的人-畜-魚共患病病原菌。嗜水氣單胞菌(A.hydrophica),屬弧菌科(Virbhonaceae),氣單胞菌屬(Aeromonas),為革蘭陰性短桿菌,極端單鞭毛,無芽孢和莢膜,散在排列。對環(huán)境要求不高,普遍存在于淡水、污水、淤泥、土壤和人類糞便中,專性需氧,生長溫度5~40 ℃,最適溫度28 ℃,pH 6~11,最適為pH 7,分為致病性和非致病性菌株[14]。致病性菌株可感染魚類、兩棲類、爬行類、鳥類和哺乳類等動物,主要癥狀為急性出血性敗血癥,慢性感染癥狀一般為皮膚潰爛。該菌可引起淡水魚細(xì)菌性敗血癥,蛙類的紅腿病,中華鱉的紅脖子病、紅底斑病、穿孔病、腐皮病等[14-15]。尤其是每年的7-9月份,由于氣溫較高,應(yīng)激較大,往往造成該病爆發(fā)[14]。自20世紀(jì)90年代以來,該病原菌常引起我國淡水養(yǎng)殖魚類的暴發(fā)性敗血癥,給水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)造成了極大的經(jīng)濟(jì)損失[2-5]。本次研究中從發(fā)病西伯利亞鱘體內(nèi)分離到的嗜水氣單胞菌使鱘魚性腺潰爛掉出體外尚屬第一次報到,其具有較高的溶血素及蛋白酶活性,毒力很強(qiáng)。隨著養(yǎng)殖規(guī)模的擴(kuò)大,養(yǎng)殖水域環(huán)境日益惡化,及鱘魚產(chǎn)品貿(mào)易來往,為嗜水氣單胞菌的傳播提供了途徑和場所,使得其危害不斷增大,流行區(qū)域大增。因此在鱘魚養(yǎng)殖過程中要重視嗜水氣單胞菌的感染,對其感染產(chǎn)生的新癥狀加以分析,及時找到防治方法減少養(yǎng)殖生產(chǎn)損失。

    圖1 根據(jù)16S rDNA基因序列同源性構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育樹Fig.1 Phylogenetic tree based on 16S rDNA sequence homolog

    藥物Drug抑菌直徑判斷標(biāo)準(zhǔn)(mm)Judgmentstandardofinhibitionzonediameter耐藥Resistant中度敏感Mediumsensitivity高度敏感Highlysensitive藥物含量(μg·disc-1)Dose抑菌直徑(mm)Inhibitionzonediameter敏感性Sensitivity強(qiáng)力霉素≤1213~15≥163022S丁胺卡那霉≤1415~16≥173023S氟苯尼考≤1213~17≥187528S鏈霉素≤1112~14≥151014R氯霉素≤1213~17≥183020S頭孢噻肟≤1415~22≥233025S先鋒霉素V≤1415~17≥183014R青霉素≤1920~27≥2810U0R紅霉素≤1314~22≥231512R克林霉素≤1415~20≥2120R阿莫西林≤1314~17≥18100R阿奇霉素≤1314~17≥181525S利福平≤1617~19≥20515R左氧氟沙星≤1314~16≥17530S痢特靈≤1415~16≥1730013R慶大霉素≤1213~14≥151023S新霉素≤1213~16≥173014I

    注:S表示高度敏感,I表示中度敏感,R表示耐藥。

    Note:S is highly sensitive, I is medium sensitivity, and R is resistant.

    分離菌株HD0824對慶大霉素、強(qiáng)力霉素、氯霉素、丁胺卡那霉素、氟苯尼考、頭孢噻肟、阿奇霉素及左氧氟沙星8種藥物高度敏感,對新霉素中度敏感,與孟彥等分離到的嗜水氣單胞菌的藥敏特性不同[3],也與李圓圓等[4]和褚衛(wèi)華等[16]分離到的嗜水氣單胞菌的藥敏特性不同[4],產(chǎn)生這些藥敏特性差異的原因可能是不同地區(qū)嗜水氣單胞菌所處環(huán)境,水域條件,氣候狀況,及接觸的藥物不同導(dǎo)致耐藥性不同[17]。在生產(chǎn)上可以選用本研究中高敏藥物進(jìn)行防治,但是由于是理論研究,故不是所有的藥物都可以用于生產(chǎn),更多是研究此病原菌的藥敏特性,如氯霉素就可以用氟苯尼考替代用于養(yǎng)殖生產(chǎn)疾病防治。從藥敏試驗結(jié)果來看,化學(xué)藥物是疾病防治的有效手段,但是由于長期使用,病原菌對常用抗生素已經(jīng)產(chǎn)生了極強(qiáng)的耐藥性,這樣必能導(dǎo)致疾病防治失敗,這就警示我們在養(yǎng)殖生產(chǎn)中需慎重考慮使用抗生素,盡可能尋找生物防治等辦法控制疾病發(fā)生,避免造成更大損失。

    [1]崔 禾,何建湘,鄭維中. 我國鱘魚產(chǎn)業(yè)現(xiàn)狀分析及發(fā)展建議[J]. 中國水產(chǎn),2006(6):8-9.

    [2]楊治國. 鱘魚嗜水氣單胞菌的分離及鑒定[J]. 淡水漁業(yè),2001,31(5):40-41.

    [3]孟 彥,肖漢兵,張 林,等. 施氏鱘出血性敗血癥病原茵的分離和鑒定[J]. 華中農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報,2007,26(6):822-826.

    [4]李圓圓,曹海鵬,何 珊,等. 鱘源致病性嗜水氣單胞菌X1的分離鑒定與藥敏特性研究[J]. 微生物學(xué)通報,2008,35(8):1186-1191.

    [5]曹海鵬,楊先樂,高 鵬,等. 鱘細(xì)菌性敗血綜合征致病菌的初步研究[J]. 淡水漁業(yè),2007,37(2):53-56.

    [6]潘厚軍,劉曉勇,常藕琴,等. 西伯利亞鱘停乳鏈球菌的分離、鑒定與致病性[J]. 中國水產(chǎn)科學(xué),2009,16(6):891-904.

    [7]Bauer O N, Pugachev O N, Voronin V N. Review study of parasites and diseases of sturgeons in Russia:a review[J]. J Appl Ichthyol,2002,18:420-429.

    [8]Hua Y P, Wang D. A review of sturgeon virosis[J]. J For Res,2005,16(1):79-82.

    [9]東秀珠,蔡妙英. 常見細(xì)菌系統(tǒng)鑒定手冊[M]. 北京:科學(xué)出版社,2001.

    [10]王淑娟. 現(xiàn)代診斷學(xué)手冊[M]. 北京:北京醫(yī)科大學(xué)中國協(xié)和醫(yī)科大學(xué)聯(lián)合出版社,1995.

    [11]周素明,李安興,馬 躍,等. 養(yǎng)殖魚類鏈球菌病病原的分離鑒定及其16S rDNA分析[J]. 中山大學(xué)學(xué)報,2007,46(2):68-71.

    [12]王國良,祝璟琳,金 珊. 養(yǎng)殖大黃魚(Pseudosciaenacrocea)3種致病弧菌的分子鑒定及其系統(tǒng)發(fā)育學(xué)分析[J]. 海洋與湖沼,2008,39(1):162-167.

    [13]Hristo D. The importance ofAeromonashydrophilain food safety[J]. Food Control,2006,17:474-483.

    [14]黃琪琰. 水產(chǎn)動物疾病學(xué)[M]. 上海:上海科學(xué)技術(shù)出版社,1998:103-139.

    [15]陸承平. 致病性嗜水氣單胞菌及其所致魚病綜述[J]. 水產(chǎn)學(xué)報,1992(16):282-288.

    [16]儲衛(wèi)華,于 勇. 鱘魚嗜水氣單胞菌的分離與鑒定[J]. 淡水漁業(yè),2003,33(2):16-17.

    [17]李愛華,蔡桃珍,吳玉深,等. 我國魚類病原-嗜水氣單胞的耐藥性研究[J]. 微生物學(xué)報,2001,28(1):58-63.

    IsolationandIdentificationPathogenicBacteriaHD0824fromAcipenserbaeriiandItsAntibioticSensitivity

    YANG Yi-bin1,LIU Yang2,XIA Yong-tao3,YANG Xian-le4,AI Xiao-hui1*

    (1.Yangtze River Fisheries Research Institute, Chinese Academy of Fishery Sciences, Hubei Wuhan 430223, China; 2.Animal Husbandry and Aquatic Products Bureau of Fengxin County, Jiangxi Fengxin 330700, China; 3.Chinese Academy of Fishery Sciences, Beijing 100039, China; 4.State Collection Center of Aquatic Pathogen, Shanghai Ocean University, Shanghai 201306, China)

    【Objective】The study was aimed at the isolation, identification and antibiotic sensitivity of pathogen from sickedAcipenserbaerii, which would provide a reference for control and prevention disease forAcipenserbaerii.【Method】The pathogenic bacterial strain HD0824 from Siberian sturgeon(Acipenserbaerii) suffering diseases was isolated, which could make laboratory rat die within 24 hours. The typical diseased symptoms as naturally occurred were experimentally reproduced after artificial infection, indicating the strains HD0824 was the pathogen of this diseases of sturgeon. 【Result】Strain HD0824 was gram negative, no spore and capsule, which had β-hemolytic activity on rabbit blood agar and had strong protease activity. By means of physiological and biochemical identification and 16S rDNA sequence analysis, strain HD0824 was identified asAeromonashydrophilawith 99 % homology. In addition, strain HD0824 was highly sensitive to gentamicin, doxycycline, chloramphenicol, amikacin, florfenicol, cefotaxime, azithromycin and levofloxacin and intermediately sensitive to one kind of antibiotics including neomycina. 【Conclusion】The isolated strain HD0824 was the pathogenic bacteria ofAcipenserbaerii, which could be prevented by administering drugs such as gentamicin and florfenicol in fisheries farming.

    Aeromonashydrophila;Acipenserbaerii; Identification; Antibiotic sensitivity

    1001-4829(2017)5-1239-06

    10.16213/j.cnki.scjas.2017.5.044

    2016-05-20

    公益性行業(yè)(農(nóng)業(yè))科研專項(201203085)

    楊移斌(1988-),男,助理研究員,主要從事水生動物病害臨床診斷及其防控技術(shù)研究,E-mail:yangyb19888@126.com;*為通訊作者:艾曉輝(1968-),男,研究員,研究方向:水產(chǎn)動物藥理學(xué),E-mail:aixh@ yfi.ac.cn。

    S941

    A

    (責(zé)任編輯 陳 虹)

    猜你喜歡
    鱘魚西伯利亞水氣
    遼中區(qū)患病草魚體內(nèi)嗜水氣單胞菌分離、鑒定與致病力測定
    海上邊水氣藏利用試井資料確定水侵狀況研究
    海洋石油(2021年3期)2021-11-05 07:42:26
    歷史時期長江上游鱘魚資源的開發(fā)研究
    西伯利亞的熊媽媽
    小讀者(2019年20期)2020-01-04 02:13:32
    西伯利亞博亞雷巖畫與歐亞大草原的青銅時代
    100歲的鱘魚
    大自然探索(2017年1期)2017-02-14 00:13:36
    醫(yī)院感染嗜水氣單胞菌的臨床治療分析
    來啦!西伯利亞!
    探索地理(2013年3期)2014-01-09 06:37:28
    鱘魚魚皮膠原蛋白的提取及其理化性能分析
    基于分形幾何的裂縫型底水氣藏產(chǎn)能模型
    我要搜黄色片| 久久精品国产清高在天天线| 国产精品久久久久久亚洲av鲁大| 三级经典国产精品| 久久久久久久久久成人| 久久亚洲国产成人精品v| 日韩,欧美,国产一区二区三区 | 麻豆国产97在线/欧美| 九九热线精品视视频播放| 久久这里只有精品中国| 精品人妻视频免费看| 日本色播在线视频| 久久99热这里只有精品18| 黑人高潮一二区| 久久精品影院6| 亚洲av美国av| 久久这里只有精品中国| 天堂√8在线中文| 国产成年人精品一区二区| 美女大奶头视频| 久久精品国产亚洲av香蕉五月| 丰满乱子伦码专区| 一级毛片久久久久久久久女| av视频在线观看入口| 日韩强制内射视频| 观看美女的网站| 美女黄网站色视频| 你懂的网址亚洲精品在线观看 | 麻豆久久精品国产亚洲av| 中文字幕av在线有码专区| 美女被艹到高潮喷水动态| 免费黄网站久久成人精品| 欧美丝袜亚洲另类| 老司机影院成人| 岛国在线免费视频观看| 校园人妻丝袜中文字幕| 国产精品三级大全| 一a级毛片在线观看| 久久热精品热| 看十八女毛片水多多多| 国内精品久久久久精免费| 亚洲久久久久久中文字幕| 午夜福利成人在线免费观看| 国产中年淑女户外野战色| 欧美成人一区二区免费高清观看| 女人十人毛片免费观看3o分钟| 嫩草影院新地址| 久久韩国三级中文字幕| 国产精品三级大全| 久久久久久久久久黄片| 久久久久久大精品| 亚洲内射少妇av| 一个人免费在线观看电影| а√天堂www在线а√下载| 亚洲精品国产av成人精品 | 国产精品亚洲美女久久久| 午夜日韩欧美国产| 国产伦一二天堂av在线观看| 欧美绝顶高潮抽搐喷水| 婷婷亚洲欧美| 99久久九九国产精品国产免费| 日韩欧美在线乱码| 看十八女毛片水多多多| 悠悠久久av| 午夜福利在线在线| 久久精品国产自在天天线| 99久久中文字幕三级久久日本| 丰满人妻一区二区三区视频av| 国国产精品蜜臀av免费| 91久久精品国产一区二区三区| 97在线视频观看| 色哟哟·www| 国产精品精品国产色婷婷| 一区二区三区四区激情视频 | 精品久久久久久久久av| 舔av片在线| 欧美成人a在线观看| 免费观看的影片在线观看| 美女 人体艺术 gogo| 色av中文字幕| 中文在线观看免费www的网站| 精品久久久久久久人妻蜜臀av| 欧美激情国产日韩精品一区| 日本-黄色视频高清免费观看| 人人妻,人人澡人人爽秒播| 免费电影在线观看免费观看| 免费观看人在逋| 一个人观看的视频www高清免费观看| 美女内射精品一级片tv| 麻豆国产av国片精品| 国产日本99.免费观看| 中文字幕免费在线视频6| 国产成人freesex在线 | 好男人在线观看高清免费视频| 欧美3d第一页| 高清毛片免费看| 中文在线观看免费www的网站| 看黄色毛片网站| 亚洲国产精品合色在线| 免费av不卡在线播放| 日本黄大片高清| 日韩av不卡免费在线播放| 一区二区三区高清视频在线| 91午夜精品亚洲一区二区三区| 久久这里只有精品中国| 床上黄色一级片| 一级毛片久久久久久久久女| 亚洲婷婷狠狠爱综合网| 精品无人区乱码1区二区| 国产91av在线免费观看| 99久久精品一区二区三区| 中文字幕久久专区| 午夜精品一区二区三区免费看| 在线播放无遮挡| 在线a可以看的网站| 色在线成人网| 欧美精品国产亚洲| 日韩欧美免费精品| 国内精品宾馆在线| 亚洲精品久久国产高清桃花| 1024手机看黄色片| 在线免费观看不下载黄p国产| 亚洲一区高清亚洲精品| 日本在线视频免费播放| 日韩大尺度精品在线看网址| 真实男女啪啪啪动态图| 久久久a久久爽久久v久久| 成年av动漫网址| or卡值多少钱| 黑人高潮一二区| 久久久精品欧美日韩精品| 听说在线观看完整版免费高清| 91在线精品国自产拍蜜月| 嫩草影院入口| 高清毛片免费观看视频网站| 97超级碰碰碰精品色视频在线观看| 国产乱人偷精品视频| 成人美女网站在线观看视频| 99热精品在线国产| 欧美不卡视频在线免费观看| 22中文网久久字幕| 日日撸夜夜添| 欧美色视频一区免费| 国产精品野战在线观看| 久久国产乱子免费精品| 亚洲欧美清纯卡通| 小蜜桃在线观看免费完整版高清| 97人妻精品一区二区三区麻豆| 欧美成人a在线观看| 淫妇啪啪啪对白视频| 国产高潮美女av| 国产一区二区三区在线臀色熟女| 99热这里只有精品一区| 国产乱人视频| 卡戴珊不雅视频在线播放| 国内久久婷婷六月综合欲色啪| 高清午夜精品一区二区三区 | 一边摸一边抽搐一进一小说| 97超碰精品成人国产| 日韩中字成人| 日本一二三区视频观看| 久久久久久久久中文| 欧美日韩精品成人综合77777| 午夜老司机福利剧场| 精品久久久噜噜| 久久热精品热| 天堂动漫精品| 久久久久九九精品影院| 亚洲av不卡在线观看| 十八禁国产超污无遮挡网站| 国产精品野战在线观看| av在线亚洲专区| 黄色一级大片看看| 国产精品亚洲一级av第二区| 国产白丝娇喘喷水9色精品| 在线天堂最新版资源| 大型黄色视频在线免费观看| 村上凉子中文字幕在线| 99久久中文字幕三级久久日本| 久久久久久久久大av| 综合色丁香网| 乱系列少妇在线播放| 极品教师在线视频| 老女人水多毛片| 欧美绝顶高潮抽搐喷水| 在线观看66精品国产| av中文乱码字幕在线| 日本 av在线| 久久精品影院6| 久久久久久大精品| 六月丁香七月| 毛片女人毛片| 人妻久久中文字幕网| 十八禁国产超污无遮挡网站| 欧美高清成人免费视频www| 日韩国内少妇激情av| 免费无遮挡裸体视频| 日韩欧美 国产精品| 亚洲精品日韩av片在线观看| 一进一出好大好爽视频| 有码 亚洲区| 观看美女的网站| 国产精华一区二区三区| 亚洲国产色片| 欧美丝袜亚洲另类| 日韩欧美国产在线观看| 国产aⅴ精品一区二区三区波| 99精品在免费线老司机午夜| 婷婷亚洲欧美| 你懂的网址亚洲精品在线观看 | 免费观看人在逋| 日本a在线网址| 在线观看午夜福利视频| 韩国av在线不卡| 中文字幕免费在线视频6| 尤物成人国产欧美一区二区三区| 乱码一卡2卡4卡精品| 啦啦啦韩国在线观看视频| 亚洲欧美成人精品一区二区| 天天一区二区日本电影三级| 国产成人freesex在线 | 少妇猛男粗大的猛烈进出视频 | 深夜a级毛片| 色噜噜av男人的天堂激情| 五月玫瑰六月丁香| 夜夜爽天天搞| 国产成人影院久久av| 最近在线观看免费完整版| 国产精品久久电影中文字幕| 中文在线观看免费www的网站| 国产色婷婷99| 国产精品不卡视频一区二区| 高清午夜精品一区二区三区 | 不卡一级毛片| 欧美+亚洲+日韩+国产| 国产精品无大码| 久久精品夜夜夜夜夜久久蜜豆| 嫩草影视91久久| 黄片wwwwww| 床上黄色一级片| 国产成人a∨麻豆精品| 日韩亚洲欧美综合| 特大巨黑吊av在线直播| 99久久精品一区二区三区| 欧美激情久久久久久爽电影| 99久久久亚洲精品蜜臀av| 国产精品av视频在线免费观看| 亚洲无线在线观看| 高清毛片免费观看视频网站| 一级av片app| 国产精品野战在线观看| 伦理电影大哥的女人| 成人av一区二区三区在线看| 无遮挡黄片免费观看| 美女黄网站色视频| 免费观看人在逋| 97热精品久久久久久| 国产成人aa在线观看| 尤物成人国产欧美一区二区三区| 一级毛片aaaaaa免费看小| 久久精品国产亚洲av涩爱 | 欧美+日韩+精品| 久久精品91蜜桃| 18禁黄网站禁片免费观看直播| 精品免费久久久久久久清纯| 久久久久性生活片| 国产伦在线观看视频一区| 嫩草影视91久久| 丰满乱子伦码专区| 亚洲精品国产av成人精品 | 国产午夜精品久久久久久一区二区三区 | 免费看日本二区| 两性午夜刺激爽爽歪歪视频在线观看| 最好的美女福利视频网| 俄罗斯特黄特色一大片| 一进一出抽搐动态| 亚洲,欧美,日韩| 深夜a级毛片| 日日干狠狠操夜夜爽| 蜜桃亚洲精品一区二区三区| 欧美+日韩+精品| 国产高清激情床上av| 插阴视频在线观看视频| 黄色欧美视频在线观看| 国产三级中文精品| 国产一区二区亚洲精品在线观看| 午夜爱爱视频在线播放| 日韩一区二区视频免费看| 97人妻精品一区二区三区麻豆| 欧美在线一区亚洲| 久久久久精品国产欧美久久久| 永久网站在线| 国产精品三级大全| 国产美女午夜福利| 啦啦啦韩国在线观看视频| 国产午夜精品久久久久久一区二区三区 | 国产女主播在线喷水免费视频网站 | 最好的美女福利视频网| 嫩草影院新地址| 亚洲美女搞黄在线观看 | 一级毛片我不卡| 国产av麻豆久久久久久久| 国产精品久久久久久亚洲av鲁大| 男女视频在线观看网站免费| 成人综合一区亚洲| 成人毛片a级毛片在线播放| 最新中文字幕久久久久| 日韩欧美一区二区三区在线观看| 免费电影在线观看免费观看| 久久久国产成人免费| 亚洲av中文字字幕乱码综合| 日韩一本色道免费dvd| 国产一区二区三区在线臀色熟女| 成人亚洲精品av一区二区| 九九在线视频观看精品| 国产国拍精品亚洲av在线观看| 欧美xxxx性猛交bbbb| 国产亚洲精品av在线| 欧美bdsm另类| 性插视频无遮挡在线免费观看| 国产精品电影一区二区三区| 精品人妻视频免费看| 一区二区三区免费毛片| 亚洲在线观看片| 日韩精品青青久久久久久| 成人特级av手机在线观看| 男人狂女人下面高潮的视频| 欧美激情久久久久久爽电影| 精品一区二区免费观看| 国产淫片久久久久久久久| 日本成人三级电影网站| 久久6这里有精品| 色5月婷婷丁香| 精品久久国产蜜桃| 欧美潮喷喷水| 少妇的逼好多水| 真实男女啪啪啪动态图| 99久久中文字幕三级久久日本| 校园春色视频在线观看| 精品久久久久久久久亚洲| 性欧美人与动物交配| 亚洲av中文av极速乱| 99久国产av精品国产电影| 成年版毛片免费区| 免费搜索国产男女视频| 日韩精品中文字幕看吧| 日韩av在线大香蕉| 久久久久国产精品人妻aⅴ院| or卡值多少钱| 日韩在线高清观看一区二区三区| 乱人视频在线观看| 欧美人与善性xxx| av在线天堂中文字幕| 97超碰精品成人国产| 欧美性猛交黑人性爽| 亚洲三级黄色毛片| 国产av不卡久久| 老师上课跳d突然被开到最大视频| 99久久精品热视频| 免费黄网站久久成人精品| 国产一区二区三区av在线 | 淫妇啪啪啪对白视频| 香蕉av资源在线| 亚洲第一电影网av| 99热网站在线观看| 一本精品99久久精品77| 深夜精品福利| 人妻丰满熟妇av一区二区三区| 99久久中文字幕三级久久日本| 黄片wwwwww| 久久久久九九精品影院| 99久久精品一区二区三区| 一级a爱片免费观看的视频| 午夜福利视频1000在线观看| 看黄色毛片网站| 国产男靠女视频免费网站| 俄罗斯特黄特色一大片| 成熟少妇高潮喷水视频| 国产亚洲精品久久久久久毛片| 免费电影在线观看免费观看| 好男人在线观看高清免费视频| 久久亚洲国产成人精品v| 91麻豆精品激情在线观看国产| 少妇熟女欧美另类| 波野结衣二区三区在线| 精品午夜福利在线看| 国产精品一二三区在线看| 又黄又爽又免费观看的视频| 精品乱码久久久久久99久播| 麻豆av噜噜一区二区三区| 夜夜看夜夜爽夜夜摸| 欧美一区二区亚洲| 国产在线精品亚洲第一网站| 自拍偷自拍亚洲精品老妇| 久久久久国内视频| 午夜日韩欧美国产| 午夜a级毛片| 国产中年淑女户外野战色| 人人妻人人澡人人爽人人夜夜 | 久久中文看片网| 国产精品伦人一区二区| 我的老师免费观看完整版| 舔av片在线| 久久久久久久久久久丰满| 寂寞人妻少妇视频99o| 亚洲av一区综合| 成人美女网站在线观看视频| 亚洲成人中文字幕在线播放| 日本一二三区视频观看| 搞女人的毛片| 久久人人爽人人爽人人片va| 午夜精品国产一区二区电影 | 免费人成视频x8x8入口观看| 美女被艹到高潮喷水动态| www.色视频.com| 国产精品伦人一区二区| 午夜福利高清视频| 男插女下体视频免费在线播放| 亚洲精品一卡2卡三卡4卡5卡| 99九九线精品视频在线观看视频| 少妇熟女aⅴ在线视频| 99久久无色码亚洲精品果冻| 夜夜看夜夜爽夜夜摸| 99在线视频只有这里精品首页| 久久热精品热| 成人二区视频| 久久久成人免费电影| 男女那种视频在线观看| 色综合站精品国产| 欧美人与善性xxx| 欧美在线一区亚洲| 日本黄色视频三级网站网址| 国产成人aa在线观看| 午夜影院日韩av| 欧美成人免费av一区二区三区| 男女做爰动态图高潮gif福利片| 精品久久久久久久久久久久久| 亚洲自偷自拍三级| 18+在线观看网站| 少妇裸体淫交视频免费看高清| 婷婷亚洲欧美| 国内精品宾馆在线| 波多野结衣高清无吗| 男人狂女人下面高潮的视频| www.色视频.com| 久久久精品大字幕| 中国国产av一级| 人妻制服诱惑在线中文字幕| 露出奶头的视频| 天堂av国产一区二区熟女人妻| 国产一区亚洲一区在线观看| 欧美高清性xxxxhd video| 91av网一区二区| 韩国av在线不卡| 国产精品综合久久久久久久免费| 99久久精品国产国产毛片| 在线观看66精品国产| 亚洲av第一区精品v没综合| 在线国产一区二区在线| 国产男人的电影天堂91| 中文字幕免费在线视频6| av天堂在线播放| 熟女人妻精品中文字幕| 亚洲成av人片在线播放无| 一进一出好大好爽视频| 国模一区二区三区四区视频| 久久精品国产鲁丝片午夜精品| 高清午夜精品一区二区三区 | 久久久久免费精品人妻一区二区| 床上黄色一级片| 亚洲第一电影网av| 久久精品夜夜夜夜夜久久蜜豆| 在线免费十八禁| 亚洲中文字幕日韩| 久久久成人免费电影| 欧美最新免费一区二区三区| 亚洲七黄色美女视频| 国产精品亚洲美女久久久| 乱人视频在线观看| 亚洲av中文字字幕乱码综合| 亚洲av成人av| av在线老鸭窝| www日本黄色视频网| 春色校园在线视频观看| 成年版毛片免费区| 精品久久久久久久久av| 亚洲第一电影网av| 亚洲成人中文字幕在线播放| 久久99热6这里只有精品| 两个人的视频大全免费| 午夜免费激情av| 99久久九九国产精品国产免费| 俄罗斯特黄特色一大片| 尾随美女入室| 中文字幕熟女人妻在线| 日韩成人伦理影院| 观看美女的网站| 看免费成人av毛片| 69av精品久久久久久| 黄色日韩在线| 六月丁香七月| 亚洲成人av在线免费| 午夜福利在线观看吧| 免费看光身美女| 一夜夜www| 99热精品在线国产| 搡女人真爽免费视频火全软件 | 精品一区二区免费观看| 国产精品嫩草影院av在线观看| av天堂中文字幕网| 欧美精品国产亚洲| 国产v大片淫在线免费观看| 男女那种视频在线观看| 国产爱豆传媒在线观看| 丝袜美腿在线中文| 久久精品国产亚洲av涩爱 | 久久精品国产亚洲av天美| 亚洲美女黄片视频| 亚洲欧美清纯卡通| 天天一区二区日本电影三级| 日本欧美国产在线视频| av.在线天堂| 性色avwww在线观看| 大香蕉久久网| 午夜爱爱视频在线播放| 亚洲美女黄片视频| 国产v大片淫在线免费观看| 五月玫瑰六月丁香| 国产精品电影一区二区三区| 日韩av在线大香蕉| 三级经典国产精品| 精品无人区乱码1区二区| 亚洲成人精品中文字幕电影| 国产综合懂色| av免费在线看不卡| 国产精品亚洲美女久久久| 欧美成人一区二区免费高清观看| 色哟哟哟哟哟哟| 国产精品伦人一区二区| 国产蜜桃级精品一区二区三区| 午夜免费男女啪啪视频观看 | 免费人成视频x8x8入口观看| 老熟妇仑乱视频hdxx| 亚洲欧美日韩卡通动漫| 亚洲中文字幕一区二区三区有码在线看| 日本撒尿小便嘘嘘汇集6| 天天躁夜夜躁狠狠久久av| 亚洲欧美日韩卡通动漫| 网址你懂的国产日韩在线| 床上黄色一级片| 亚洲精品乱码久久久v下载方式| 日本与韩国留学比较| 久久人人爽人人片av| 亚洲乱码一区二区免费版| 国产麻豆成人av免费视频| 国产乱人视频| 午夜免费激情av| 国产精品乱码一区二三区的特点| 中国国产av一级| 在线播放国产精品三级| 色在线成人网| 国产69精品久久久久777片| 久久热精品热| 亚洲国产色片| 久久欧美精品欧美久久欧美| 亚洲国产色片| 日本与韩国留学比较| 日韩 亚洲 欧美在线| 黄色日韩在线| 日日摸夜夜添夜夜爱| 午夜免费男女啪啪视频观看 | 如何舔出高潮| 日韩精品青青久久久久久| 国产中年淑女户外野战色| 午夜福利18| 我要搜黄色片| 婷婷亚洲欧美| 中国美女看黄片| 亚洲第一区二区三区不卡| 精品人妻熟女av久视频| 亚洲美女黄片视频| 高清毛片免费观看视频网站| 身体一侧抽搐| 午夜老司机福利剧场| 午夜福利在线观看免费完整高清在 | 国产精品三级大全| 国产av麻豆久久久久久久| 国模一区二区三区四区视频| 国产精品综合久久久久久久免费| 在线播放国产精品三级| 欧美性猛交╳xxx乱大交人| 少妇熟女aⅴ在线视频| 一本久久中文字幕| 久久鲁丝午夜福利片| 美女内射精品一级片tv| 国产成人精品久久久久久| 欧美成人一区二区免费高清观看| 国内少妇人妻偷人精品xxx网站| 久久久国产成人精品二区| 婷婷六月久久综合丁香| 成人美女网站在线观看视频| 成人三级黄色视频| 直男gayav资源| 国产国拍精品亚洲av在线观看| 特级一级黄色大片| 男人的好看免费观看在线视频| 久久精品人妻少妇| 蜜桃久久精品国产亚洲av| 九色成人免费人妻av| 国产视频一区二区在线看| 精品午夜福利视频在线观看一区| 99热只有精品国产| 国产又黄又爽又无遮挡在线| 在线观看一区二区三区| 又爽又黄a免费视频|