外周血與腫瘤組織膜聯(lián)蛋白A3表達對卵巢上皮癌鉑類耐藥的預測價值

謝祥紅，劉 芳

（武警四川總隊醫(yī)院：1.檢驗科；2.婦產科,四川樂山 614000）

論著·臨床研究doi:10.3969/j.issn.1671-8348.2017.30.012

外周血與腫瘤組織膜聯(lián)蛋白A3表達對卵巢上皮癌鉑類耐藥的預測價值

謝祥紅1，劉 芳2

（武警四川總隊醫(yī)院：1.檢驗科；2.婦產科,四川樂山 614000）

目的比較外周血與腫瘤組織膜聯(lián)蛋白A3（Annexin A3）表達對卵巢上皮癌鉑類耐藥的預測價值。方法選擇2010年2月至2012年2月該院術后行以鉑類為基礎化療，且完成隨訪的72例初治卵巢上皮癌患者，按照鉑類耐藥評價標準分為鉑類化療敏感組54例和鉑類化療耐藥組18例，采用化學發(fā)光免疫分析法檢測外周血Annexin A3水平；采用免疫組織化學染色檢測腫瘤組織Annexin A3水平；通過繪制受試者工作特征（ROC）曲線分析外周血與腫瘤組織Annexin A3對鉑類耐藥的預測價值。結果鉑類敏感組外周血Annexin A3水平顯著低于鉑類耐藥組，差異有統(tǒng)計學意義（P<0.05），鉑類敏感組腫瘤組織Annexin A3表達陽性率顯著低于鉑類耐藥組（P<0.05）。外周血Annexin A3低濃度組中位生存期（31.2個月）顯著高于高濃度組（23.1個月），差異有統(tǒng)計學意義（P<0.05）；組織Annexin A3低表達組中位生存期（35.2 個月）顯著高于高表達組（20.4個月），差異有統(tǒng)計學意義（P<0.05）。多因素分析顯示，血清與腫瘤組織Annexin A3表達水平是影響鉑類耐藥的獨立危險因素（均P<0.05）。外周血Annexin A3預測鉑類耐藥的ROC曲線下面積（AUC）為0.821；組織Annexin A3預測鉑類耐藥的AUC為0.763；外周血Annexin A3預測鉑類耐藥的AUC顯著高于組織Annexin A3。結論鉑類耐藥的卵巢上皮癌患者外周血與腫瘤組織Annexin A3表達水平均顯著升高，外周血Annexin A3對鉑類耐藥的預測價值優(yōu)于組織Annexin A3。

膜聯(lián)蛋白A3；卵巢腫瘤；藥物療法,聯(lián)合；化療敏感；化療耐藥；卵巢上皮癌；生存預后

腫瘤化療耐藥分為原發(fā)性耐藥和獲得性耐藥，其中80%以上對鉑類耐藥屬于獲得性耐藥[1-2]。若能在化療前或化療初期預測腫瘤的耐藥性，對調整化療方案、提高腫瘤緩解率具有重要意義。人膜聯(lián)蛋白A3（Annexin A3）蛋白屬于Annexin家族成員之一，主要參與細胞骨架的形成、調節(jié)磷酸化、細胞信號轉導等生物學功能。Yin等[3]報道稱卵巢癌組織Annexin A3表達上調，且高表達Annexin A3患者無病生存期顯著縮短；該研究進一步發(fā)現(xiàn)高表達Annexin A3對鉑類耐藥明顯，對紫杉醇、阿霉素等化療藥物無明顯耐藥性，提示Annexin A3可能是鉑類耐藥的特異性蛋白。然而組織取樣操作繁瑣，對患者傷害大，甚至存在感染的風險。有報道稱Annexin A3在細胞外也有表達，且隨著Annexin A3表達增加，外周血Annexin A3水平也逐漸升高，這為外周血Annexin A3檢測提供了可能[4]。鑒于此，本研究分別對卵巢上皮癌患者外周血和組織Annexin A3表達進行檢測，評估外周血和組織Annexin A3檢測對鉑類耐藥的預測價值，現(xiàn)將研究結果報道如下。

1 資料與方法

1.1一般資料 本研究經(jīng)本院倫理委員會批準，前瞻性地選擇2010年2月至2012年2月醫(yī)院收治的81例初治卵巢上皮癌患者作為研究對象，年齡22～75歲，平均（58.1±7.4）歲；按照美國癌癥聯(lián)合委員會[5]（American Joint Committee on Cancer,AJCC）乳腺癌TNM分級標準分為Ⅰ期5例，Ⅱ期14例，Ⅲ期56例，Ⅳ期6例；組織學類型：漿液性腺癌68例，黏液性腺癌4例，透明細胞癌6例，子宮內膜樣癌3例；組織學分級：高分化11例，中分化26例，低分化44例。納入標準：（1）所有患者均擬行手術治療，包括腫瘤細胞減滅術和全面分期手術；（2）術后接受以鉑類為基礎的化療；（3）術中取組織標本，病理診斷經(jīng)病理科證實；（4）患者出院后規(guī)律隨訪；（5）治療方案取得患者及家屬同意，并簽署知情同意書。排除標準：（1）自愿放棄手術或無手術指征者；（2）既往接受過抗癌治療者；（3）患者入組前已經(jīng)接受化療；（4）對鉑類等藥物過敏者。

1.2方法

1.2.1治療方案 患者行腫瘤細胞減滅術或全面分期手術，術前抽取患者外周肘靜脈血3 mL，靜置10～20 min，12 000 r/min離心15 min，吸取上清液置于-80 ℃冰箱保存待檢。術中收集癌組織標本，常規(guī)石蠟包埋，制成厚度約為4 μm的切片，置于-20 ℃冰箱保存待檢。術后行紫杉醇+卡鉑的化療方案：靜脈滴注紫杉醇：80 mg/m2，持續(xù)輸注1 h，第1、8、15天；靜脈滴注卡鉑5.0～6.0 mg·mL-1·min-1，持續(xù)輸注1 h，第1天；化療3周為1個周期，共計化療6個周期。每個周期結束后2周行盆腹腔超聲檢查。

1.2.2外周血、組織Annexin A3檢測 采用化學發(fā)光免疫分析法檢測外周血Annexin A3水平：取出血清標本，室溫溶解，向包被孔中加入50 μL標準品和樣品，均設復孔，再向每孔中加入50 μL酶標檢測抗體，室溫孵育2 h。采用化學發(fā)光儀檢測每孔的發(fā)光值，根據(jù)擬合方程計算樣品Annexin A3水平。參考文獻[4]，以Annexin A3≥2.05 mg/L為高濃度，<2.05 mg/L為低濃度。采用免疫組織化學染色檢測腫瘤組織Annexin A3水平：二甲苯脫蠟、乙醇梯度洗脫，磷酸鹽緩沖液（PBS）沖洗3次；加入0.01 mol/L枸櫞酸緩沖液，煮沸進行抗原修復，再加入3%H2O2孵育3 min消除內源性過氧化酶。加入3%山羊血清封閉液體，37 ℃孵育10 min棄去封閉液；分別滴加1∶500的鼠抗人Annexin A3單克隆抗體（購自北京同立海源生物科技有限公司），4 ℃孵育過夜。PBS沖洗3次，再加入辣根過氧化物酶標記的羊抗兔IgG二抗，37 ℃孵育30 min，PBS沖洗3次，加入新配置的二氨基聯(lián)苯胺（DAB）顯色液顯色，自來水充分沖洗，復染，封片。結果判定：由兩位病理科醫(yī)師采用盲法閱片，顯微鏡下隨機選擇10個視野，采用半定量法對細胞染色程度進行評分[6]；染色強度：無染色為0分，淺棕色后淡紅色為1分，棕黃色為2分，棕褐色為3分。著色細胞所占百分比：染色細胞小于5%為0分，染色細胞5%～25%為1分，染色細胞>26%～50%為2分，染色細胞>51%～75%為3分，染色細胞大于75%為4分；以染色強度×染色細胞百分比作為總分，其中總分0分代表陰性（-），1～4分為弱陽性（+），5～8分為陽性（++），9～12分為強陽性（+++）。以染色程度為依據(jù)，分為弱陽性組即低表達組，++以上為強陽性組即高表達組。

1.2.3鉑類耐藥評價標準 參考文獻[7]，鉑類化療敏感：化療結束后患者達到完全緩解，后期復發(fā)時間距最后一次化療間隔6個月及以上；鉑類化療耐藥：化療結束后患者達到完全緩解，后期復發(fā)時間距最后一次化療間隔小于6個月；鉑類化療難治：化療結束后患者癥狀未緩解；其中鉑類化療耐藥、鉑類化療難治均歸于鉑類耐藥。

1.2.4隨訪 化療結束后對患者進行隨訪，隨訪從化療結束第2天開始，化療結束后第1年每月隨訪1次，第1～2年每3個月隨訪1次，2年以上每半年隨訪1次，隨訪時檢查血常規(guī)、尿常規(guī)、肝腎功能及盆腹腔超聲；截止日期為隨訪結束或患者死亡或失訪之日。由于本研究隨訪時間較短，因此以無進展生存期（PFS）作為主要觀察終點，隨訪截止日期為2015年3月1日。

2 結 果

2.1隨訪情況與治療結局 本研究納入的81例初治卵巢上皮癌患者，最終完成隨訪72例，失訪9例，隨訪時間7～43個月，中位隨訪時間24.5個月。失訪原因：患者搬遷至外地無法隨訪4例，中途轉院3例，其他未知原因放棄隨訪2例。72例患者中，按照鉑類耐藥評價標準，鉑類化療敏感54例，鉑類化療耐藥13例，鉑類化療難治5例。

2.2鉑類敏感與鉑類耐藥患者Annexin A3表達比較 鉑類敏感組外周血Annexin A3水平顯著低于鉑類耐藥組（P<0.05）；免疫組織化學染色顯示，腫瘤組織Annexin A3主要定位于細胞質和細胞核，鉑類敏感組腫瘤組織Annexin A3表達陽性率顯著低于鉑類耐藥組（P<0.05），見表1、圖1。

2.3外周血Annexin A3對患者PFS的影響 高濃度患者23例，低濃度患者49例。高濃度患者中位PFS為20.4個月，低濃度患者中位PFS為31.2個月，高濃度患者中位PFS顯著低于低濃度患者（P<0.05），見圖2。

2.4組織Annexin A3對患者PFS的影響 高表達患者中位PFS為23.1個月，低表達患者中位PFS為35.2個月，高表達患者中位PFS顯著低于低表達患者（P<0.05），見圖3。

表1 鉑類敏感與鉑類耐藥患者Annexin A3表達比較

A：陰性；B：弱陽性；C：陽性；D：強陽性
圖1腫瘤組織Annexin A3染色結果（免疫組織化學，×200）

2.5鉑類耐藥影響因素單因素分析 單因素分析顯示，血清Annexin A3高濃度患者鉑類耐藥發(fā)生率顯著高于血清Annexin A3低濃度患者，組織Annexin A3高表達患者鉑類耐藥發(fā)生率顯著高于組織Annexin A3低表達患者（P<0.05），見表2。

表2 鉑類耐藥影響因素單因素分析（%）

圖2 高濃度與低濃度Annexin A3患者生存曲線

圖3 高表達與低表達Annexin A3患者生存曲線

2.6鉑類耐藥影響因素多因素分析 多因素分析顯示，血清與腫瘤組織Annexin A3蛋白表達水平是影響鉑類耐藥的獨立危險因素（P<0.05），見表3。

表3 鉑類耐藥影響因素多因素分析

2.7外周血、組織Annexin A3對鉑類耐藥的預測價值 外周血Annexin A3預測鉑類耐藥的AUC為0.821（95%CI：0.692～0.951，P<0.05），最佳臨界值為2.05 mg/L，此臨界值的特異度為85.37%，敏感度為53.27%，陽性預測值為45.82%，陰性預測值為88.74%；組織Annexin A3預測鉑類耐藥的AUC為0.763（95%CI：0.614～0.911，P<0.05），最佳臨界值為陽性（++），此臨界值的特異度為82.45%，敏感度為43.91%，陽性預測值為49.73%，陰性預測值為86.59%；外周血Annexin A3預測鉑類耐藥的AUC高于組織Annexin A3，見圖4。

A：外周血Annexin A3；B：組織Annexin A3
圖4外周血、組織Annexin A3預測鉑類耐藥的ROC曲線

3 討 論

卵巢上皮癌病死率居女性生殖惡性腫瘤的首位，是威脅女性健康安全的重大疾病之一。隨著醫(yī)療水平的發(fā)展，腫瘤細胞減滅術聯(lián)合鉑類為主的化療方案成為卵巢癌治療的主要手段，并成功挽救無數(shù)女性患者的生命。然而晚期卵巢癌患者遠期生存期低于30%，其中對化療藥物耐藥是造成晚期卵巢癌生存率偏低的主要原因[8]。目前對鉑類耐藥的臨床評價主要包括化療期間腫瘤進展、化療結束后6個月內復發(fā)、對標準化療方案的最佳反應僅為腫瘤無變化等，然而這些評價標準存在缺陷，只能等到化療到一定階段，才能判斷出化療藥物是否敏感，可能延誤部分患者的最佳治療時機。因此，尋找到預測鉑類耐藥的敏感指標，并及時調整化療方案，對改善患者的治療結局具有重要意義。

Annexin A3是一種Ca2+依賴磷脂結合蛋白，與細胞內多種生物功能密切相關。國外有研究顯示，膀胱癌、肺癌等組織中Annexin A3表達顯著升高，提示Annexin A3可能參與了腫瘤的發(fā)病[9]。Watanabe等[10]采用Annexin A3基因RNA干擾表達載體轉染膽囊癌細胞株，結果顯示膽囊癌細胞生長受限，并隨著時間延長膽囊癌細胞逐漸發(fā)生凋亡，提示Annexin A3可能是治療膽囊癌的一個潛在的分子靶點。傅燕萍等[11]證實Annexin A3能夠顯著降低腫瘤細胞內鉑與DNA結合的水平，導致細胞對鉑類耐藥。動物成瘤實驗也證實，順鉑作用后的腫瘤細胞，Annexin A3高表達的細胞成瘤率顯著高于Annexin A3低表達的細胞[12]；但是對于紫杉醇、表阿霉素等藥物作用的細胞成瘤率無明顯差異，提示Annexin A3可能是特異性鉑類耐藥的分子標記蛋白。

本研究對外周血和組織Annexin A3水平進行檢測，結果顯示鉑類敏感組腫瘤組織Annexin A3水平顯著低于鉑類耐藥組，提示Annexin A3水平與鉑類耐藥密切相關。免疫組織化學染色證實，Annexin A3主要定位于細胞質和細胞核；而根據(jù)吳志明等[13]的報道，Annexin A3沒有跨膜區(qū)域和信號肽，因此Annexin A3能否成為鉑類耐藥的標志蛋白取決于其能否被分泌至細胞外。Hamelin-Peyron等[14]采用免疫印跡法檢測鉑類耐藥的細胞培養(yǎng)上清液，結果證實細胞外依然可以檢測出Annexin A3表達，且細胞外Annexin A3表達與細胞內Annexin A3分泌量呈正相關。本研究同樣證實，鉑類敏感組外周血Annexin A3水平顯著低于鉑類耐藥組，這亦為Annexin A3作為鉑類耐藥的分子標記物提供了理論基礎。本研究還證實外周血Annexin A3低濃度患者中位PFS顯著高于高濃度患者，組織Annexin A3高表達患者中位PFS顯著高于低表達患者，說明Annexin A3與卵巢上皮癌患者生存預后有關。

本研究多因素分析顯示，血清與腫瘤組織Annexin A3表達水平是影響鉑類耐藥的獨立危險因素，ROC曲線分析顯示外周血Annexin A3預測鉑類耐藥的AUC為0.821，組織Annexin A3預測鉑類耐藥的AUC為0.763，兩者均可作為鉑類耐藥的預測指標。從生物學取樣、操作便捷性和結果穩(wěn)定性方面，外周血檢測均有無可比擬的優(yōu)勢。組織標本僅在手術時可獲取，而血清標本理論上可在任何時段取樣，因此，血清學標本取樣優(yōu)于組織學標本。本研究進一步對比外周血和組織Annexin A3對鉑類耐藥的預測價值，結果顯示，外周血Annexin A3預測鉑類耐藥的AUC、特異度、敏感度、陰性預測值均高于組織Annexin A3。因此外周血Annexin A3檢測對鉑類耐藥預測的價值優(yōu)于組織Annexin A3檢測。

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PredictivevalueofAnnexinA3proteinexpressioninperipheralbloodandtumortissueforplatinumresistanceinovarianepithelialcancer

XieXianghong1，LiuFang2

（1.DepartmentofClinicalLaboratory;2.DepartmentofObstetricsandGynecology,ArmedPoliceSichuanCorpsHospital,Leshan,Sichuan614000,China）

ObjectiveTo compare the values of peripheral blood and tumor tissue Annexin A3 protein expressions for predictinge platinum resistance in ovarian epithelial cancer.MethodsA total of 72 cases of newly treated ovarian epithelial cancer and undergoing platinum based chemotherapy after surgery,and completely followed up in this hospital from February 2010 to February 2012 were selected and divided into the platinum-sensitive group（54 cases） and platinum-resistant group（18 cases） according to the platinum resistance evaluation criteria.Peripheral blood Annexin A3 level was detected by chemiluminescence immunoassay.Tumor tissue Annexin A3 level was detected by adopting the immunohistochemical staining.The predictive value of peripheral blood and tumor tissue Annexin A3 for predicting platinum resistance was analyzed by drawing the ROC curve.ResultsThe peripheral blood Annexin A3 level in the platinum-sensitive group was significantly lower than that in the platinum-resistant group,the difference was statistically significant（P<0.05）,the positive rate of tumor tissue Annexin A3 expression in the platinum sensitivity group was significantly lower than that of platinum-resistant group（P<0.05）.The median survival time in peripheral blood Annexin A3 low concentration group was significantly higher than that of high concentration group（31.2 monthsvs. 20.4 months,P<0.05）.The median survival time in tissue Annexin A3 low expression group was significantly higher than that in the high expression group （35.2 monthsvs. 23.1 monthsP<0.05）.The multivariate analysis showed that the level of Annexin A3 expression in serum and tumor tissue were the independent risk factor for affecting platinum resistance （allP<0.05）.The area of curve （AUC） of peripheral blood Annexin A3 in predicting platinum resistance was 0.821,which of tissue Annexin A3 in predicting platinum was 0.763,peripheral blood Annexin A3 for predicting platinum resistance was significantly higher than tissue Annexin A3（P<0.05）.ConclusionThe expression levels of Annexin A3 protein in peripheral blood and tumor tissue are significantly increased in the patients with platinum resistant ovarian cancer,the predictive value of Annexin A3 protein in peripheral blood for platinum resistance is better than that of tissue Annexin A3 protein.

Annexin A3;ovarian neoplasms；drug therapy,combination;chemotherapy sensitivity;chemotherapy resistance;ovarian epithelial cancer;survival prognosis

謝祥紅（1966-），副主任技師，本科，主要從事臨床醫(yī)學檢驗專業(yè)研究。

R737.3

A

1671-8348（2017）30-4214-04

2017-01-24

2017-04-12）