cry1Ac基因啟動(dòng)子表達(dá)Vip3Aa蛋白特性分析

劉 明，孫海燕，高繼國(guó)

（1.東北農(nóng)業(yè)大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，哈爾濱 150030；2.黑龍江八一農(nóng)墾大學(xué)測(cè)試中心，黑龍江 大慶 163319）

cry1Ac基因啟動(dòng)子表達(dá)Vip3Aa蛋白特性分析

劉 明1,2，孫海燕2，高繼國(guó)1*

（1.東北農(nóng)業(yè)大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，哈爾濱 150030；2.黑龍江八一農(nóng)墾大學(xué)測(cè)試中心，黑龍江 大慶 163319）

蘇云金芽胞桿菌cry基因啟動(dòng)子常用于構(gòu)建蛋白表達(dá)載體。為探討蘇云金芽胞桿菌cry基因啟動(dòng)子指導(dǎo)Vip3Aa蛋白表達(dá)情況及殺蟲(chóng)活性，以pUC19載體為基礎(chǔ)，運(yùn)用重疊引物PCR方法構(gòu)建Vip3Aa11表達(dá)載體，并與由T7啟動(dòng)子指導(dǎo)的Vip3Aa11表達(dá)蛋白殺蟲(chóng)活性、抗胰蛋白酶穩(wěn)定性比較，初步探索發(fā)酵條件。結(jié)果表明，cry1Ac啟動(dòng)子與T7啟動(dòng)子均在上清液中表達(dá)大小為88 ku Vip3Aa11蛋白，對(duì)甜菜夜蛾、棉鈴蟲(chóng)殺蟲(chóng)活性差異不顯著，cry1Ac基因啟動(dòng)子在37℃、48 h更適合Vip3Aa11蛋白的表達(dá)，為vip基因表達(dá)、功能驗(yàn)證及殺蟲(chóng)機(jī)理等研究提供新思路。

蘇云金芽胞桿菌；cry1Ac啟動(dòng)子；Vip3Aa；蛋白表達(dá)

蘇云金芽胞桿菌（Bacillus thuringiensis，Bt）為一種革蘭氏陽(yáng)性細(xì)菌，可產(chǎn)生多種具有殺蟲(chóng)活性蛋白質(zhì)，如殺蟲(chóng)晶體蛋白（Insecticidal crystal proteins,ICPs）和營(yíng)養(yǎng)期殺蟲(chóng)蛋白（Vegetative insecticidal proteins,VIPs）[1]。作為目前應(yīng)用最廣泛的微生物殺蟲(chóng)劑和轉(zhuǎn)基因抗蟲(chóng)育種資源[2]，Bt對(duì)多種昆蟲(chóng)、線蟲(chóng)、原生動(dòng)物等有特異殺蟲(chóng)活性。蘇云金芽胞桿菌可大量表達(dá)殺蟲(chóng)蛋白，主要驅(qū)動(dòng)表達(dá)啟動(dòng)子具有較高活性，目前已有cry基因啟動(dòng)子成功應(yīng)用于構(gòu)建表達(dá)cry基因載體，主要有cry1A[3]、cry3A[4-5]、cry4A[6]、cry8E[7-8]啟動(dòng)子。cry1Ac啟動(dòng)子為重疊雙啟動(dòng)子BtⅠ和 BtⅡ，二者分別由σE和σK調(diào)控[9]。pBMB1A以低拷貝載體pHT304為基礎(chǔ)，cry1Ac啟動(dòng)子指導(dǎo)的穿梭表達(dá)載體，可快速克隆表達(dá)不同類(lèi)別Cry蛋白;pBlueAc以克隆載體pBlue為基礎(chǔ)，cry1Ac啟動(dòng)子指導(dǎo)的克隆表達(dá)載體，可在大腸桿菌中表達(dá)Cry蛋白，表達(dá)產(chǎn)物與Bt蛋白具有相似性質(zhì)，目前已應(yīng)用于快速克隆表達(dá)Cry1Ac及Cry1Ie蛋白[10-11]。

Vip蛋白在Bt菌株?duì)I養(yǎng)生長(zhǎng)期分泌到胞外，對(duì)多種Cry蛋白不敏感的鱗翅目昆蟲(chóng)具有較好殺蟲(chóng)活性，與Cry蛋白進(jìn)化上無(wú)同源性，殺蟲(chóng)機(jī)理不同。Vip蛋白被認(rèn)為是Bt第二代殺蟲(chóng)蛋白，可擴(kuò)大Bt基因應(yīng)用范圍，延緩害蟲(chóng)抗性，應(yīng)用前景廣闊[12]。截止目前，已發(fā)現(xiàn)并命名的vip基因有142個(gè)，其中vip3類(lèi)106個(gè)，包含64個(gè)vip3Aa、2個(gè)vip3Ab、1個(gè)vip3Ac、6個(gè)vip3Ad、1個(gè)vip3Ae、4個(gè)vip3Af、15個(gè)vip3Ag、1個(gè)vip3Ah、1個(gè)vip3Ai、2個(gè)vip3Aj、2個(gè)vip3Ba、3個(gè)vip3Bb、4個(gè)vip3Ca。有關(guān)vip3Aa殺蟲(chóng)機(jī)制、活性區(qū)、蛋白表達(dá)及蛋白結(jié)構(gòu)等成為研究熱點(diǎn)[13]。

目前關(guān)于cry基因啟動(dòng)子用于構(gòu)建Bt Cry蛋白表達(dá)載體研究較多，但用cry基因啟動(dòng)子在大腸桿菌中表達(dá)Vip蛋白研究鮮有報(bào)道。本研究以cry1Ac基因啟動(dòng)子和vip3Aa11基因?yàn)樵囼?yàn)材料，分析vip3Aa11在大腸桿菌中表達(dá)情況，并與利用T7啟動(dòng)子pET28a表達(dá)載體表達(dá)的Vip3Aa11蛋白作功能及特性比較，旨在為vip基因表達(dá)及功能驗(yàn)證、殺蟲(chóng)機(jī)理等研究提供新思路。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株和質(zhì)粒

東北農(nóng)業(yè)大學(xué)生物化學(xué)與分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)室

表1 菌株與質(zhì)粒Table 1 Strains and plasmids

1.1.2 培養(yǎng)基

LB液體培養(yǎng)基：1%胰蛋白胨，1%氯化鈉，0.5%酵母提取物。

LB固體培養(yǎng)基：液體培養(yǎng)基基礎(chǔ)上加1.5%瓊脂粉。

2×LB液體培養(yǎng)基：2%胰蛋白胨，2%氯化鈉，1%酵母提取物。121℃，濕熱滅菌15 min。

1.1.3 試劑

限制性?xún)?nèi)切酶及DNA連接試劑盒購(gòu)自TaKaRa公司，凝膠回收及質(zhì)粒提取試劑盒購(gòu)于Axygen公司，KOD-Plus DNA polymerase購(gòu)自TOYOBO公司，其他試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純和生化試劑。

1.1.4 供試?yán)ハx(chóng)

甜菜夜蛾（Spodoptera exigua）、棉鈴蟲(chóng)（Heliothis提供試驗(yàn)菌株和質(zhì)粒，特征見(jiàn)表1。armigera）及飼料購(gòu)自河南省濟(jì)源白云實(shí)業(yè)有限公司。

1.2 方法

1.2.1 引物設(shè)計(jì)及PCR反應(yīng)

根據(jù)cry1Ac序列設(shè)計(jì)用于擴(kuò)增cry1Ac啟動(dòng)子序列的引物c1AcPF/c1AcPV3AaR，根據(jù)vip3Aa11基因序列設(shè)計(jì)用于擴(kuò)增vip3Aa11全長(zhǎng)基因序列的引物V3Aac1AcPF/V3AaR，引物序列如表2所示，下劃線部分為酶切位點(diǎn)，在引物c1AcPF 5'端上引入BamHⅠ酶切位點(diǎn)，引物V3AaR 5'端上引入SalⅠ酶切位點(diǎn)。

PCR反應(yīng)體系為50μL，包含1μL模板，10 μmol· L-1引物各1 μL，5 μL dNTPs，5 μL 10×KOD Buffer、2 μL MgSO4、1 μL KODPlus DNA polymerase，最后去離子水補(bǔ)至50μL體積。PCR程序：94℃ 2 min；94℃ 20 s，55℃20 s，68 ℃ N min（擴(kuò)增效率為1 kb · min-1），30 cycles；68℃ 10 min?；厥誔CR產(chǎn)物，選用SalⅠ、BamHⅠ限制性?xún)?nèi)切酶同時(shí)酶切PCR回收產(chǎn)物及pUC19載體，凝膠電泳回收后，按照載體與目的片段物質(zhì)的量比為1：3連接，轉(zhuǎn)化大腸桿菌JM109感受態(tài)細(xì)胞，37℃培養(yǎng)12 h。用引物M13F和M13R鑒定陽(yáng)性克隆。由吉林省庫(kù)美生物科技有限公司測(cè)序，DNAMAN軟件分析DNA序列。

表2 引物名稱(chēng)及序列Table 2 Primers and sequences

1.2.2 蛋白表達(dá)分析

pAc19vip3Aa11-JM109菌株培養(yǎng)：在固體LB培養(yǎng)基劃線培養(yǎng)，挑單菌落接種含氨芐青霉素的LB液體培養(yǎng)基試管中，37℃，220 r·min-1培養(yǎng)8 h，按照1%接種量至含100 mL 2×LB液體培養(yǎng)基三角瓶中，37℃，220 r·min-1培養(yǎng)48 h。

pET28a-vip3Aa11-BL21菌株培養(yǎng)：在固體LB培養(yǎng)基劃線培養(yǎng)，挑單菌落接種于含卡納霉素的LB液體培養(yǎng)基試管中，37℃，220 r·min-1培養(yǎng)8 h，按照1%接種至含100 mL LB液體培養(yǎng)基三角瓶中，37℃，220 r·min-1培養(yǎng)至OD600為0.5左右，加入終濃度為1 mM的IPTG，16℃誘導(dǎo)12 h。

8 000 r·min-1離心收集菌體，用20 mM的Tris·HCl（pH 8.0）將菌體混合均勻，超聲波破碎（70%，3 s，3 s），12 000 r·min-1，4 ℃離心10 min，收集上清。pAc19-vip3Aa11-JM109沉淀用2%的Triton-X100清洗，12 000 r·min-1，4 ℃離心10 min，清水沖洗沉淀，用20 mmol·L-1的Tris-HCl（pH 8.0）懸浮。pET28a-vip3Aa11-BL21沉淀直接用 20 mmol· L-1的 Tris· HCl（pH 8.0）懸浮。SDS-PAGE檢測(cè)蛋白表達(dá)情況。

1.2.3 生物活性測(cè)定

甜菜夜蛾：將粗提蛋白用20 mmol·L-1的Tris·HCl（pH 8.0）稀釋成不同濃度，取1 mL待測(cè)樣品溶液加入10 g人工飼料中混勻，均勻分裝于24孔板中，選用未經(jīng)取食的初孵健康幼蟲(chóng)（孵化后12 h內(nèi)）作為試蟲(chóng)，在26～30℃室溫下，每孔接1頭，3次重復(fù)，同時(shí)設(shè)置空白對(duì)照，放入25℃光照培養(yǎng)箱中，72 h后調(diào)查死、活蟲(chóng)數(shù)，計(jì)算致死中濃度（LC50）。

棉鈴蟲(chóng)：將粗提蛋白用20 m mmol·L-1的Tris·HCl（pH 8.0）稀釋成不同濃度，取1 mL待測(cè)樣品溶液加到10 g人工飼料中混勻，均勻分裝于24孔板中，選用未經(jīng)取食的初孵健康幼蟲(chóng)（孵化后12 h內(nèi)）作為試蟲(chóng)，在26～30℃室溫下，每孔接1頭，3次重復(fù)，同時(shí)設(shè)置空白對(duì)照，放入30℃光照培養(yǎng)箱中，72 h后調(diào)查死、活蟲(chóng)數(shù)，計(jì)算致死中濃度（LC50）。

1.2.4 胰蛋白酶消化分析

將可溶組份蛋白與1 mg·mL-1胰蛋白酶以10：1（體積比）比例混合，37℃水浴， 分別在30、120 min后取樣，SDS-PAGE檢測(cè)分析。

1.2.5 表達(dá)條件分析

在不同培養(yǎng)溫度及培養(yǎng)時(shí)間條件下，按照1.2.2中步驟提取蛋白，通過(guò)SDS-PAGE分析目的蛋白表達(dá)情況。

2 結(jié)果與分析

2.1 pAc19-vip3Aa11構(gòu)建

以LBH97基因組DNA為模板，c1AcPF和c1AcPV3AaR為引物對(duì)，利用KOD-Plus DNA polymerase（TOYOBO），擴(kuò)增出368 bpcry1Ac啟動(dòng)子序列。以質(zhì)粒pET28a-vip3Aa11為模板，V3Aac1AcPF和V3AaR為引物對(duì)， KOD-Plus DNA polymerase擴(kuò)增出2 370 bpvip3Aa11全長(zhǎng)序列。以?xún)烧逷CR回收產(chǎn)物為模板，c1AcPF和V3AaR為引物對(duì)， KOD-Plus DNA polymerase作PCR擴(kuò)增2 738 bp的帶cry1Ac啟動(dòng)子vip3Aa11序列（見(jiàn)圖1）?；厥誔CR產(chǎn)物，經(jīng)SalⅠ、BamH Ⅰ雙酶切后，連接SalⅠ、BamHⅠ消化后pUC19載體,將其轉(zhuǎn)化大腸桿菌JM109。經(jīng)PCR鑒定、測(cè)序驗(yàn)證轉(zhuǎn)化子。經(jīng)鑒定的重組子命名為pAc19vip3Aa11。

圖1 重疊PCR產(chǎn)物的瓊脂糖凝膠電泳Fig.1 Agarose gel electrophoresis of overlap extension PCRamplified products

2.2 SDS-PAGE分析cry1Ac基因啟動(dòng)子與T7啟動(dòng)子表達(dá)Vip3Aa11

cry1Ac啟動(dòng)子表達(dá)Vip3Aa11蛋白上樣量為10μL，T7啟動(dòng)子表達(dá)的Vip3Aa11蛋白上樣量為3μL（見(jiàn)圖2）。SDS-PAGE分析結(jié)果表明，cry1Ac啟動(dòng)子可以指導(dǎo)Vip3Aa11在大腸桿菌JM109中可溶性表達(dá),其蛋白條帶大小與T7啟動(dòng)子在大腸桿菌中表達(dá)Vip3Aa11蛋白大小一致，為88 ku，但是在蛋白表達(dá)量上，經(jīng)Quantity One軟件分析，T7啟動(dòng)子表達(dá)量明顯高于cry1Ac啟動(dòng)子。

圖2 cry1Ac基因啟動(dòng)子與T7啟動(dòng)子表達(dá)Vip3Aa11的SDS-PAGE分析Fig.2 SDS-PAGE analysis of the Vip3Aa11 produced by promoter of cry1Ac and T7 in E.coli

2.3 殺蟲(chóng)活性測(cè)定

通過(guò)Quantity One軟件及標(biāo)準(zhǔn)BSA對(duì)兩種不同啟動(dòng)子表達(dá)粗蛋白定量后，將pAc19vip3Aa11和pET28avip3Aa11粗蛋白設(shè)定為80、40、20、2、1和0.2μg·mL-16個(gè)濃度梯度作甜菜夜蛾殺蟲(chóng)活性測(cè)定，設(shè)定320、160、80、40、20、10和1 μg·mL-17個(gè)濃度梯度作棉鈴蟲(chóng)殺蟲(chóng)活性測(cè)定。72 h后統(tǒng)計(jì)死、活蟲(chóng)數(shù)，計(jì)算致死中濃度LC50。

殺蟲(chóng)活性結(jié)果見(jiàn)表3，cry1Ac基因啟動(dòng)子表達(dá)的Vip3Aa11蛋白對(duì)甜菜夜蛾及棉鈴蟲(chóng)LC50分別為2.24和52.11 μg·mL-1，T7 啟動(dòng)子表達(dá)Vip3Aa11蛋白對(duì)甜菜夜蛾及棉鈴蟲(chóng)LC50分別為2.47 和40.24 μg·mL-1。

表3 不同啟動(dòng)子表達(dá)的Vip3Aa11殺蟲(chóng)活性Table3 Insecticidal effect of Vip3Aa11 produced by promoter of cry1Ac and T7

2.4 胰蛋白酶消化分析

兩種不同啟動(dòng)子表達(dá)Vip3Aa蛋白與1 mg·mL-1胰蛋白酶按10：1體積比混合，37℃水浴30 min，120 min后，SDS-PAGE分析出現(xiàn)不同結(jié)果。T7啟動(dòng)子表達(dá)Vip3Aa蛋白在30 min時(shí)已完全消化，而cry1Ac啟動(dòng)子表達(dá)Vip3Aa蛋白120 min時(shí)，才完全消化，產(chǎn)生66 ku核心區(qū)蛋白片段。說(shuō)明在蛋白與胰蛋白酶體積比為10：1，37℃，30 min情況下，二者抗胰蛋白酶穩(wěn)定性上存在顯著差異，而在120 min時(shí)，無(wú)顯著差異。

圖3 胰蛋白酶處理后SDS-PAGE分析Fig.3 SDS-PAGE analysis of Vip3Aa11 by trypsin treatment

2.5 不同培養(yǎng)溫度及時(shí)間對(duì)蛋白表達(dá)量影響

為優(yōu)化cry1Ac啟動(dòng)子指導(dǎo)Vip3Aa11蛋白表達(dá)條件，設(shè)計(jì)不同溫度及培養(yǎng)時(shí)間。接種于2倍LB培養(yǎng)基，分別在30和37℃，220 r·min-1條件下分別培養(yǎng)24、48和72 h后提取粗蛋白，影響結(jié)果見(jiàn)圖4。

圖4 不同溫度及時(shí)間對(duì)cry1Ac啟動(dòng)子指導(dǎo)的Vip3Aa11蛋白表達(dá)影響Fig.4 Effect of temperatureand time on Vip3Aa11 produced by promoter of cry1Ac in E.coli JM109

經(jīng)SDS-PAGE和Quantity One軟件分析發(fā)現(xiàn)，溫度對(duì)Vip3Aa表達(dá)影響較大。37℃對(duì)Vip3Aa表達(dá)有利。另外，同一溫度下，培養(yǎng)時(shí)間對(duì)蛋白表達(dá)量影響不顯著。

3 討論與結(jié)論

cry1Ac啟動(dòng)子由芽胞期轉(zhuǎn)錄起始因子σE、σK等調(diào)控因子調(diào)控，蘇云金芽胞桿菌與大腸桿菌中σ因子具有較高相似性，在大腸桿菌中，cry1Ac啟動(dòng)子指導(dǎo)基因表達(dá)與蘇云金芽胞桿菌在調(diào)控上具有一致性[14]。本研究所用cry1Ac啟動(dòng)子區(qū)包含cry1Ac重疊雙啟動(dòng)子 BtⅠ和BtⅡ，分別受σE和σK控制，但蛋白表達(dá)量上與T7啟動(dòng)子相比有所降低。T7啟動(dòng)子屬于強(qiáng)啟動(dòng)子，商業(yè)化表達(dá)載體運(yùn)用較多，被T7 RNAP識(shí)別后起始轉(zhuǎn)錄活躍，可完整轉(zhuǎn)錄下游DNA序列，蛋白表達(dá)量較高[15]。

大腸桿菌中，由cry1Ac啟動(dòng)子指導(dǎo)Cry1Ac蛋白表達(dá)與蘇云金芽胞桿菌來(lái)源的Cry1Ac蛋白在抗胰蛋白酶穩(wěn)定性及小菜蛾殺蟲(chóng)活性方面一致性較好[10]。而由cry1Ac啟動(dòng)子指導(dǎo)Cry1Ie蛋白表達(dá)與T7啟動(dòng)子指導(dǎo)Cry1Ie蛋白表達(dá)相較，小菜蛾殺蟲(chóng)活性提高10.5倍，在胰蛋白酶穩(wěn)定性方面顯著差異[11]。本研究中cry1Ac啟動(dòng)子與T7啟動(dòng)子指導(dǎo)Vip3Aa11表達(dá)蛋白相比，對(duì)甜菜葉蛾及棉鈴蟲(chóng)殺蟲(chóng)活性無(wú)顯著性差異。試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，蛋白與胰蛋白酶10：1比例混合，37℃反應(yīng)30 min時(shí)，二者在抗胰蛋白酶穩(wěn)定性上差異顯著。cry1Ac啟動(dòng)子指導(dǎo)的Vip3Aa11在30 min時(shí)，不生成66 ku核心區(qū)蛋白片段，直到120 min時(shí)，完全生成66 ku核心區(qū)蛋白片段。而T7啟動(dòng)子指導(dǎo)的Vip3Aa11在30 min時(shí)已經(jīng)完全生成66 ku的核心區(qū)蛋白片段。

試驗(yàn)中通過(guò)設(shè)定兩個(gè)不同溫度，3個(gè)不同培養(yǎng)時(shí)間分析pAc19vip3Aa11蛋白表達(dá)條件發(fā)現(xiàn)，37℃較30℃表達(dá)量提高，但殺蟲(chóng)活性測(cè)定需大量表達(dá)蛋白，尚需進(jìn)一步優(yōu)化條件，提高蛋白表達(dá)量。

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Analysis on expressed Vip3Aa protein by cry1Ac promoter/

LIU Ming1,2,SUN

Haiyan2,GAO Jiguo1
(1.School of Life Sciences,Northeast Agricultural University,Harbin 150030,China;2.Testing Center,Heilongjiang Bayi Agricultural University,Daqing Heilongjiang 163319,China)

cry promoter of Bacillus thuringiensis is commonly engineered to construct protein express vectors.In order to explore cry promoter of Bacillus thuringiensis that expresses Vip3Aa and analyzes the insecticidal activity,a vip3Aa11 gene was fused to cry1Ac promoter by overlap extension PCR,and then inserted into pUC19 vector,expressed in E.coli JM109.In this study,compared with Vip3Aa11 protein expressed under the promoter cry1Ac and T7 in insecticidal effect,resistances to trypsin and fermentation condition were analyzed,respectively.The results showed that both were expressed 88 ku protein in the supematant,the insecticidal activity of expressed protein under the promoter of cry1Ac and T7 had no significant difference to Spodoptera exigua and Helicoverpa Armigera,respectively.cry1Ac gene promoter was more suitable for Vip3Aa protein expression in 37and 48 h.The results would provide a convenient way for vip gene expression,function verification and insecticidal mechanism etc.

Bacillus thuringiensis;cry1Ac promoter;Vip3Aa;protein expression

Q786

A

1005-9369（2017）09-0036-07

時(shí)間 2017-10-22 8：33：51 [URL]http：//kns.cnki.net/kcms/detail/23.1391.S.20171022.0833.002.

劉明,孫海燕,高繼國(guó).cry1Ac基因啟動(dòng)子表達(dá)Vip3Aa蛋白特性分析[J].東北農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào),2017,48(9)：36-42.

Liu Ming,Sun Haiyan,Gao Jiguo.Analysis on expressed Vip3Aa protein by cry1Ac promoter[J].Journal of Northeast Agricultural University,2017,48(9)：36-42.(in Chinese with English abstract)

2017-07-20

國(guó)家自然科學(xué)基金（31401812）；黑龍江省自然科學(xué)基金（C2016025）

劉明（1984-），男，助理研究員，博士研究生，研究方向?yàn)樯牢⑸锓肿由飳W(xué)。E-mail：liuming_84@live.cn

*通訊作者：高繼國(guó)，教授，博士生導(dǎo)師，研究方向?yàn)樘K云金芽胞桿菌基因發(fā)掘、抗性機(jī)理及生物安全性。E-mail：gaojiguo1961@hotmail.com