晚期肺癌外周血調(diào)節(jié)T細(xì)胞及CD8+T細(xì)胞表面PD—1表達(dá)的關(guān)系

鄭玉軍+王明吉+王雷+代璐璐+李顏君

【摘要】 目的 探討晚期肺癌患者外周血中淋巴細(xì)胞亞型表面程序性死亡受體1（PD-1）的表達(dá)水平。方法 30例晚期肺癌患者， 采用流式細(xì)胞儀檢測(cè)外周血中CD4+、CD8+、CD4+/CD8+、CD4+CD25+T細(xì)胞（調(diào)節(jié)性T細(xì)胞， Tregs）及CD8+T細(xì)胞表面PD-1（CD8+CD279+T）百分比， 并與30例健康人的血液標(biāo)本進(jìn)行對(duì)比。結(jié)果 與健康人比較， 晚期肺癌患者CD4+及CD4+/CD8+T細(xì)胞水平有所降低， 但差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）；晚期肺癌患者CD8+T細(xì)胞水平為（27.70±12.87）%， CD8+CD279+T細(xì)胞水平為（2.03±1.35）%較健康人的（22.67±5.88）%、（1.26±0.83）%顯著升高， 差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）；晚期肺癌患者CD4+CD25+T細(xì)胞數(shù)量（2.01±1.26）%顯著高于健康人（0.98±0.55）%， 差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。結(jié)論 晚期肺癌外周血CD4+CD25+T細(xì)胞數(shù)量顯著高于健康人。

【關(guān)鍵詞】 晚期肺癌；外周血；淋巴細(xì)胞亞型百分比

DOI：10.14163/j.cnki.11-5547/r.2017.26.008

【Abstract】 Objective To investigate the expression level of programmed peripheral death receptor-1 （PD-1） in peripheral blood lymphocyte subtype of patients with advanced lung cancer. Methods The percentage of CD4+， CD8+， CD4+/CD8+， CD4+CD25 + T cells （regulatory T cells， Tregs） and percentage of PD-1 （CD8+CD279+T） on CD8+T cells surface in peripheral blood of 30 patients with advanced lung cancer were detected by flow cytometry， and they were compared with 30 cases of healthy blood samples. Results Compared with healthy people， patients with advanced lung cancer had lower CD4+， CD4+/CD8+T cell level， but the difference was not statistical significant （P>0.05）. Patients with advanced lung cancer had higher CD8+T cell level as （27.70±12.87）% and CD8+CD279+T cell level as （2.03±1.35）% than （22.67±5.88）% and （1.26±0.83）% in healthy people， and the different was statistically significant （P<0.05）. Patients with advanced lung cancer had obviously higher number of CD4+CD25+T cell as （2.01±1.26）% than （0.98±0.55）% in healthy people ， and the different was statistically significant （P<0.05）. Conclusion The number of CD4+CD25+T cells in peripheral blood of patients with advanced lung cancer is significantly higher than that of healthy people.

【Key words】 Advanced lung cancer； Peripheral blood； Percentage of lymphocyte subtype

肺癌已成為發(fā)病率和病死率增長(zhǎng)最快、對(duì)人類健康和生命威脅最大的惡性腫瘤， 晚期肺癌5年生存率僅有10%～15%。惡性腫瘤的發(fā)生、發(fā)展與機(jī)體免疫系統(tǒng)密切相關(guān)， 尤其是與免疫調(diào)節(jié)功能紊亂有關(guān)。盡管最近臨床發(fā)現(xiàn)應(yīng)用阻斷細(xì)胞毒T淋巴細(xì)胞抗原4（CTLA4）[1]及PD-1[2]的抗體對(duì)轉(zhuǎn)移性腫瘤進(jìn)行免疫治療， 可以獲得持久的緩解， 但針對(duì)免疫抑制狀態(tài)的治療有效率最高也只有20%左右。另外， 也有研究顯示， 肺癌基因突變負(fù)荷或聯(lián)合免疫標(biāo)志物的檢測(cè)可能預(yù)測(cè)患者可能從PD-1的抑制中獲益[3， 4]， 本文根據(jù)白細(xì)胞表面抗原分化簇（clusters of differentiation， CD）， 以健康成年人作對(duì)照， 以期為肺癌提供進(jìn)一步的預(yù)后及療效預(yù)測(cè)標(biāo)志?，F(xiàn)報(bào)告如下。

1 資料與方法

1. 1 一般資料 因本院肺癌病例尚不充足， 故僅收集30例2014年8月～2016年8月在大連市友誼醫(yī)院住院治療的局部晚期或轉(zhuǎn)移性肺癌， 其中男16例， 女14例；年齡46～86歲， 中位年齡70歲；排除嚴(yán)重感染性疾病或自身免疫性疾病患者。另選取同期來本院體檢的30例健康成年人作為對(duì)照， 年齡、性別均與肺癌患者匹配。對(duì)全部肺癌患者進(jìn)行電話隨訪， 隨訪截止日期為2016年8月10日， 19例尚未出現(xiàn)事件， 無失訪者。

1. 2 腫瘤分期及分類 所有研究病例均經(jīng)纖維支氣管鏡、腫塊穿刺活檢及手術(shù)明確診斷為肺癌， 排除嚴(yán)重感染性疾病或自身免疫性疾病患者。腫瘤分期根據(jù)纖維支氣管鏡、胸部CT、B超等檢查結(jié)果， 采用國(guó)際抗癌聯(lián)盟（international union against cancer， UICC）2010年肺癌第7版的TNM分期標(biāo)準(zhǔn)；病理類型采用2004年WHO肺癌病理分類。30例局部晚期不可手術(shù)及轉(zhuǎn)移性肺癌， 包括ⅢC期8例、Ⅳ期22例；鱗癌4例， 腺癌13例， 小細(xì)胞肺癌4例， 大細(xì)胞癌1例， 未知8例。對(duì)化療患者2 周期后再評(píng)估外周血細(xì)胞亞群（1例）。endprint

1. 3 測(cè)定方法

1. 3. 1 樣品收集 抗凝全血2 ml搖勻；取兩個(gè)1.5 ml EP管中分別加入100 μl全血， 其中一管作為NC對(duì)照不加抗體， 其余操作步驟一致；實(shí)驗(yàn)管中加入細(xì)胞表面抗原抗體CD4、CD8、CD25、CD279后混勻， 室溫避光孵育20 min；加入1 ml 1×BD PharmLyse紅細(xì)胞裂解液， 稍微渦旋， 37℃溫箱避光孵育10 min裂解紅細(xì)胞；500×g離心6 min；棄去上清， 加入1 ml 磷酸緩沖鹽溶液（PBS）重懸細(xì)胞， 500×g離心5 min；棄去上清， 加入400 μl PBS重懸細(xì)胞。

1. 3. 2 T 細(xì)胞亞群檢測(cè) 按照流式細(xì)胞儀C6（BD）操作手冊(cè)開機(jī)， 調(diào)試儀器， NC對(duì)照圈取淋巴細(xì)胞群， 畫門P1收集至少6000個(gè)細(xì)胞；實(shí)驗(yàn)管對(duì)比NC管圈取CD4（APC）陽(yáng)性， SSC-APC CD4陽(yáng)性門內(nèi)15000個(gè)細(xì)胞。

1. 4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS22.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。計(jì)量資料以均數(shù)± 標(biāo)準(zhǔn)差（ x-±s）表示， 采用t檢驗(yàn)。P<0.05表示差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

與健康人比較， 晚期肺癌患者CD4+及CD4+/CD8+T細(xì)胞水平有所降低， 但差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）；晚期肺癌患者CD8+T細(xì)胞水平為（27.70±12.87）%， CD8+CD279+T細(xì)胞水平為（2.03±1.35）%較健康人的（22.67±5.88）%、（1.26±0.83）%顯著升高， 差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）；晚期肺癌患者CD4+CD25+T細(xì)胞數(shù)量（2.01±1.26）%顯著高于健康人（0.98±0.55）%， 差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。見表1。

3 討論

免疫系統(tǒng)利用復(fù)雜的正性及負(fù)性信號(hào)間的平衡保護(hù)機(jī)體免受外界干擾而預(yù)防自身免疫。這種平衡可被各種病理狀態(tài)打破， 導(dǎo)致免疫系統(tǒng)抑制而發(fā)生腫瘤[5]。眾所周知， 細(xì)胞免疫在機(jī)體抗腫瘤免疫中起著主導(dǎo)作用， T淋巴細(xì)胞亞群是人體內(nèi)主要的細(xì)胞免疫系統(tǒng)， T淋巴細(xì)胞的數(shù)量與功能變化與腫瘤的發(fā)生、進(jìn)展、擴(kuò)散有一定的相關(guān)性[6]。本課題研究Tregs細(xì)胞與效應(yīng)T細(xì)胞表面抑制性受體PD-1表達(dá)的相關(guān)性， 從而為今后靶向Tregs細(xì)胞的治療奠定基礎(chǔ)。本研究采用流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)了30例晚期肺癌患者的T淋巴細(xì)胞亞群狀態(tài)， 通過表1發(fā)現(xiàn)與健康人比較， 晚期肺癌患者CD4+及CD4+/CD8+水平有所降低， 但差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）， 可能與病例數(shù)較少有關(guān)；同時(shí)， CD8+水平升高， 說明肺癌患者細(xì)胞免疫功能處于抑制狀態(tài)， 為病理形態(tài)的發(fā)生提供了免疫環(huán)境的條件。進(jìn)一步證實(shí)上述基礎(chǔ)研究的結(jié)論， 認(rèn)為效應(yīng)T細(xì)胞衰竭是抑制性Treg細(xì)胞募集到腫瘤原發(fā)部位， 使效應(yīng)T細(xì)胞表面抑制性受體表達(dá)， 導(dǎo)致效應(yīng)T細(xì)胞消耗、細(xì)胞免疫衰竭， 使腫瘤細(xì)胞免疫逃逸。因此， 為臨床上去除Tregs或封閉其抑制功能可使腫瘤免疫恢復(fù)， 提供理論基礎(chǔ)[7-9]。對(duì)腫瘤患者免疫功能狀態(tài)的評(píng)估有助于判斷腫瘤的發(fā)展及預(yù)后， 雖不能直接反映機(jī)體抗腫瘤免疫效應(yīng)， 但對(duì)于動(dòng)態(tài)觀察腫瘤的生長(zhǎng)轉(zhuǎn)移及預(yù)后有一定參考價(jià)值[10]。必須強(qiáng)調(diào)， 轉(zhuǎn)移性肺癌患者的免疫系統(tǒng)并不是一個(gè)惰性系統(tǒng)， 而是活躍的抑制系統(tǒng)。癌癥免疫治療必須克服負(fù)性調(diào)節(jié)機(jī)制， 目前最有效的免疫治療方法是選擇性地靶向限速環(huán)節(jié)。最近許多臨床結(jié)果一致認(rèn)為免疫抑制在腫瘤微環(huán)境中起關(guān)鍵性作用。因此逆轉(zhuǎn)免疫抑制成為腫瘤免疫治療的熱點(diǎn)。

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[收稿日期：2017-07-17]endprint