長非編碼RNA MT1JP調(diào)控p53抑制類風濕關(guān)節(jié)炎炎癥反應作用及機制研究

洪宏海++王征++夏勇

【摘 要】目的：探討長非編碼RNA MT1JP調(diào)控p53抑制類風濕關(guān)節(jié)炎炎癥反應的作用及機制。

方法：qRT-PCR法檢測類風濕關(guān)節(jié)炎患者和骨關(guān)節(jié)置換患者滑膜組織中長非編碼RNA MT1JP相對表達；小分子干擾RNA干擾MT1JP研究其作用；ELISA檢測炎癥因子白細胞介素（IL）-1β、IL-6、IL-8水平；Western blot檢測p53蛋白水平。結(jié)果：類風濕關(guān)節(jié)炎患者滑膜組織MT1JP水平明顯低于骨關(guān)節(jié)置換患者，且類風濕關(guān)節(jié)炎患者滑膜組織MT1JP水平與血清中炎癥因子IL-1β、IL-6、IL-8水平呈負相關(guān)；干擾MT1JP后明顯促進MH7A滑膜細胞的IL-1β、IL-6、IL-8分泌和抑制p53表達。結(jié)論：類風濕關(guān)節(jié)炎患者滑膜組織MT1JP水平下調(diào)，通過調(diào)控p53進而促進炎癥因子的分泌和炎癥反應。

【關(guān)鍵詞】 關(guān)節(jié)炎，類風濕；MT1JP；炎癥因子；p53

The Role and Mechanism of Long Noncoding RNA MT1JP Regulating p53 to Inhibit Inflammatory Reaction of Rheumatoid Arthritis

HONG Hong-hai，WANG Zheng，XIA Yong

【ABSTRACT】Objective：To study the role and mechanism of long noncoding RNA MT1JP regulating p53 to inhibit inflammatory reaction of rheumatoid arthritis.Methods：The qRT-PCR method was used to detect the relative expression of long noncoding RNA MT1JP in patients with rheumatoid arthritis or having undergone bone joint replacement.Small molecules interfered RNA to interfere MT1JP to study the effects.ELISA was used to detect the levels of（IL）-1β，IL-6 and IL-8.Western blot was used to detect the protein level of p53.Results：The levels of MT1JP in synovial tissue of patients with rheumatoid arthritis was significantly lower than that in patients with bone and joint replacement surgery，and the levels of MT1JP in patients with synovial tissue were negatively correlated with inflammatory factor IL-1β，IL-6 and IL-8.after interference，the secretion of IL-1β，IL-6 and IL-8 in MH7A synovial cells were enhanced，and expression of p53 was inhibited.Conclusion：The level of MT1JP in synovial tissue of rheumatoid arthritis is down regulated，which can promote the secretion of inflammatory factors and inflammatory response by regulating p53.

【Keywords】 arthritis，rheumatoid；MT1JP；inflammatory factors；p53

類風濕關(guān)節(jié)炎（rheumatoid arthritis，RA）是一種自身免疫性疾病，其病理特征為炎癥反應和炎癥因子分泌增多。RA臨床表現(xiàn)為長期慢性炎癥浸潤、關(guān)節(jié)疼痛、關(guān)節(jié)腫大和畸形[1]。女性RA發(fā)病率約為1.16%，明顯高于男性的0.44%[1]。RA的具體發(fā)病機制目前還不清楚。炎癥反應過度激活是RA最重要的致病機制[2]。文獻報道，腫瘤壞死因子-α（TNF-α）、LPS等促炎因子刺激關(guān)節(jié)滑膜細胞后激活核轉(zhuǎn)錄因子-κB（NF-κB）信號通路，隨后誘導白細胞介素（IL）-6、IL-8、IL-1β和基質(zhì)金屬蛋白酶（MMPs）表達，最終導致關(guān)節(jié)炎癥反應和骨關(guān)節(jié)破壞[3]。敲除IL-1或阻斷IL-6明顯改善RA動物模型中炎癥浸潤和軟骨破壞[4]。因此，尋找新的靶點來抑制炎癥因子分泌和炎癥反應對治療RA尤為重要。

長非編碼RNA是一類普遍存在于哺乳動物，長度 > 200 bp的非編碼RNA。長非編碼RNA有著廣泛的生物學功能，如調(diào)控基因轉(zhuǎn)錄和翻譯，蛋白質(zhì)定位，細胞結(jié)構(gòu)完整性，細胞周期和炎癥反應

等[5]。目前，長非編碼RNA與RA的關(guān)系研究尚少。長非編碼RNA MT1JP在肺癌、肝癌、結(jié)直腸癌和胃癌中表達低，而在正常組織中表達豐富，隨后發(fā)現(xiàn)其可調(diào)控p53促進腫瘤凋亡[6]。研究表明，p53亦可抑制NF-κB活性進而抑制炎癥反應[7]。但是，MT1JP在RA患者中表達及其是否調(diào)控RA患者p53和炎癥反應尚未清楚。筆者將研究MT1JP在RA患者滑膜組織中表達及其在RA患者診斷中的意義，以及其調(diào)控p53和炎癥因子作用及機制。

1 實驗材料endprint

1.1 標本收集 選取本院的RA患者35例和骨關(guān)節(jié)置換患者（選取車禍等各種原因?qū)е路鄞庑怨钦鄣幕颊撸?5例。收集患者的臨床資料、滑膜組織、血清?；そM織采用無菌收集，手術(shù)后取關(guān)節(jié)滑膜組織于干凈無菌的50 mL離心管中，置于冰上。然后于無菌操作臺剝除脂肪組織、骨頭、血管等。收集到的滑膜組織用生理鹽水洗3遍，無菌管凍存于液氮罐中，用于后續(xù)實驗研究。所有患者資料和標本收集均嚴格按照廣州醫(yī)科大學倫理委員會相關(guān)規(guī)定。

1.2 試劑和儀器 IL-6、IL-8、IL-1β ELISA檢測試劑盒（BD公司）；SYBER Green試劑盒（Takara公司）；MT1JP小分子干擾片段（銳博公司）；轉(zhuǎn)染試劑Lipo2000（Invtrogen公司）；細胞培養(yǎng)液（Hyclone公司）；細胞培養(yǎng)皿（康寧公司）；p53抗體（CST公司）；電泳電轉(zhuǎn)儀、凝膠成像系統(tǒng)（伯樂公司）；離心機（eppendorf）；pH計（上海佑儀公司）；熒光PCR儀（ABI公司）。

2 方 法

2.1 細胞培養(yǎng) MH7A細胞為RA滑膜細胞，購自廣州吉妮歐公司。用高糖DMEM + 10%FBS于5% CO2，37 ℃的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。購買時為第3代，擴增3代后用于后續(xù)實驗研究。

2.2 長非編碼RNA MT1JP干擾實驗 具體方法如下：MH7A細胞種植于六孔板中，待其融合度為50%～60%，換上無雙抗的培養(yǎng)液，按照轉(zhuǎn)染試劑Lipo2000說明書，每孔轉(zhuǎn)染MT1JP干擾小分子片段100 pmol，轉(zhuǎn)染6 h后，撤掉舊培養(yǎng)液，換上含有雙抗、10%胎牛血清培養(yǎng)液，繼續(xù)培養(yǎng)

48 h后收集細胞培養(yǎng)上清和蛋白，檢測炎癥因子IL-1β、IL-6、IL-8和p53水平。

2.3 qRT-PCR實驗 qRT-PCR用來檢測MT1JP和炎癥因子IL-1β、IL-6、IL-8相對表達水平。具體實驗如下：收集處理好的滑膜組織或MH7A細胞RNA，逆轉(zhuǎn)錄為cDNA，用SYBER Green試劑盒進行實時熒光PCR實驗。PCR條件為：9 ℃ 30 s，

1個循環(huán)；PCR反應，95 ℃ 5 s，60 ℃ 15 s，45個循環(huán)；溶解，95 ℃ 15 s，65 ℃20 s，95 ℃ 15 s，

1個循環(huán)。PCR結(jié)束后，根據(jù)反應得到的Cp值，使用相對定量的分析方法，以標準曲線進行校正，最后計算出樣品中各mRNA的相對濃度。

2.4 Western blot實驗 Western blot實驗用來檢測p53蛋白水平，具體實驗方案如下：收集處理好的MH7A細胞蛋白，進行蛋白定量，然后以每孔上樣量為60 μg上樣，然后跑電泳。蛋白電泳完畢后，用7%的脫脂牛奶封閉PVDF膜1 h，然后加入p53（1∶1000）一抗，4 ℃過夜，收集一抗，加入二抗（1∶2000），TBST洗3遍后，暗房中加入ECL顯色，X線片顯影定影，拍照。

2.5 統(tǒng)計學方法 采用SPSS 17.0軟件進行統(tǒng)計分析。計量資料以表示；RA患者滑膜組織MT1JP相對表達水平和血清中炎癥因子和相關(guān)

指標采用t檢驗；ROC曲線分析用來判斷MT1JP對RA診斷價值。以P < 0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

3 結(jié) 果

3.1 2組滑膜組織中長非編碼RNA MT1JP水平比較 骨關(guān)節(jié)置換患者滑膜組織和RA患者相關(guān)臨床資料見表1。分別檢測35例RA患者和35例骨關(guān)節(jié)置換患者滑膜組織中MT1JP水平，結(jié)果顯示，與骨關(guān)節(jié)置換患者相比，RA患者滑膜中MT1JP水平明顯低于骨關(guān)節(jié)置換患者，見圖1。此外，為了驗證MT1JP水平對RA患者的診斷價值，筆者進行了ROC曲線分析，結(jié)果顯示，AUC面積為0.984，表明MT1JP對RA的診斷具有較好價值，見圖2；同時，ROC曲線分析表明，MT1JP對RA診斷敏感性和特異性分別為97.1%和91.4%；95%置信區(qū)間為[0.963，1.006]。

3.2 RA患者滑膜組織MT1JP水平和血清中炎癥因子水平呈負相關(guān) 收集RA患者血清，檢測RA患者血清中RF、ACPA、IL-1β、IL-6、IL-8水平。RA相關(guān)指標臨床資料和檢測結(jié)果見表1。相關(guān)性分析發(fā)現(xiàn)，MT1JP與RA患者血清中炎癥因子

IL-1β、IL-6和IL-8呈負相關(guān)；但是，MT1JP與RA患者血清RF和ACPA并沒有相關(guān)性，見圖3。長非編碼RNA MT1JP與RA炎癥反應密切聯(lián)系，可能在RA的炎癥反應中起著關(guān)鍵

作用。

3.3 MH7A關(guān)節(jié)滑膜細胞干擾MT1JP后炎癥因子的表達和分泌增多 干擾MT1JP后，關(guān)節(jié)滑膜細胞MH7A的炎癥因子IL-1β、IL-6和IL-8表達水平明顯上調(diào)，見圖4（1）；與此對應的是，關(guān)節(jié)滑膜細胞MH7A培養(yǎng)上清中IL-1β、IL-6和IL-8含量也明顯升高，見圖4（2）。

3.4 MT1JP通過調(diào)控p53進而調(diào)控RA患者的炎癥因子表達和分泌 Western blot實驗結(jié)果表明，干擾MT1JP后，p53蛋白水平明顯下調(diào)，MT1JP可能通過調(diào)控p53蛋白水平進而調(diào)控炎癥因子

IL-1β、IL-6和IL-8表達，從而抑制RA炎癥反應。見圖5。

4 討 論

RA是一種自身免疫性疾病，其基本病理特征為炎癥反應。RA臨床表現(xiàn)為關(guān)節(jié)慢性炎癥浸潤、關(guān)節(jié)疼痛、關(guān)節(jié)腫大和畸形。RA詳細的發(fā)病機制尚未清楚，目前認為炎癥反應是主要的致病機制。研究表明，抑制RA炎癥反應可有效改善RA患者生活水平和疾病狀態(tài)[8]。因此，尋找有效藥物或靶點抑制RA炎癥反應尤為重要。長非編碼RNA與腫瘤增殖、凋亡、轉(zhuǎn)移和抗藥性等生物學行為密切聯(lián)系，如促進肝癌發(fā)生的H19等[9]。在RA中，長非編碼RNA研究甚少。在本研究中，筆者發(fā)現(xiàn)長非編碼RNA MT1JP在RA患者滑膜組織中表達下調(diào)，且對RA診斷具有一定意義；進一步研究其與RA炎癥反應密切相關(guān)，小分子干擾RNA干擾MT1JP后明顯抑制炎癥因子IL-6、IL-8、IL-1β表達和分泌。此外，我們也發(fā)現(xiàn)MT1JP調(diào)控p53蛋白水平，提示MT1JP可能通過調(diào)控p53蛋白水平進而調(diào)控RA的炎癥反應。endprint

RA發(fā)病機制尚未清楚，但是炎癥反應是其最基本的病理狀態(tài)。研究表明，TNF-α、LPS、IL-1β等促炎因子刺激關(guān)節(jié)滑膜細胞后激活NF-κB信號通路，隨后誘導IL-6、IL-8、IL-1β和MMPs表達，最終導致關(guān)節(jié)炎癥反應和骨關(guān)節(jié)破壞[3]，提示炎癥因子和炎癥反應在RA患者中起關(guān)鍵作用。許多研究發(fā)現(xiàn)血漿中IL-1β和IL-6濃度比正常人高

10倍左右[10]，敲除IL-1或阻斷IL-6基因明顯改善RA動物模型中炎癥浸潤和軟骨破壞[4]。此外，臨床上使用IL-1β抗體阿那白滯素（anakinra）和IL-6受體阻斷藥塔西單抗治療RA取得較好的效果[11]。以上研究都提示抑制炎癥因子和炎癥反應可有效改善RA的病理狀態(tài)。目前研究發(fā)現(xiàn)，長非編碼RNA與炎癥因子和炎癥反應密切聯(lián)系[12]。

lnc-IL7R通過結(jié)合IL7R基因3'UTR抑制LPS誘導的炎癥反應[13]。長非編碼RNA Lethe通過結(jié)合轉(zhuǎn)錄因子阻止NF-κB啟動下游炎癥反應[14]。在骨關(guān)節(jié)炎患者中，長非編碼RNA H19水平上調(diào)，促進IGF-2表達，但是其分子機制尚未清楚[15]。RA中長非編碼RNA研究尚少。研究發(fā)現(xiàn)，甲氨蝶呤通過誘導長非編碼RNA p21進而抑制RA的炎癥反應[16]。筆者在RA患者滑膜組織中發(fā)現(xiàn)長非編碼RNA MT1JP表達下調(diào)，且與炎癥因子呈負相

關(guān)；進一步研究表明MT1JP通過p53抑制炎癥因子分泌，與長非編碼RNA p21抑制炎癥反應結(jié)果類似，提示MT1JP可能成為治療RA的新靶點，具有臨床意義。此外，ROC曲線分析表明MT1JP對RA具有較好的診斷價值。

p53是一種重要的抑癌基因，其在細胞生長中起著關(guān)鍵調(diào)控作用，參與細胞生長、凋亡、腫瘤增殖等生理功能[17]。此外，研究表明p53亦可調(diào)控NF-κB活性進而抑制炎癥反應[7]。筆者發(fā)現(xiàn)干擾MT1JP后，p53蛋白水平下調(diào)，表明MT1JP可能調(diào)控p53蛋白進而抑制RA的炎癥反應過程。但是，MT1JP調(diào)控p53和炎癥反應的具體分子機制還有待進一步研究。

總之，本文實驗結(jié)果證明，長非編碼RNA MT1JP在RA患者中表達下調(diào)，且與RA炎癥反應密切相關(guān)；此外，MT1JP通過調(diào)控p53蛋白水平和炎癥因子分泌從而抑制RA的炎癥反應，為RA的治療提供了新的靶點和治療方案，具有一定的臨床意義。

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收稿日期：2017-03-31；修回日期：2017-06-12endprint