揉髕手法對兔膝骨關(guān)節(jié)炎模型軟骨組織的影響

田林++戴七一++戴子一++羅榮宇

【摘 要】目的：觀察揉髕手法對兔膝骨關(guān)節(jié)炎模型軟骨組織的影響，為膝骨關(guān)節(jié)炎的防治提供實驗依據(jù)。方法：將48只新西蘭兔隨機分為手法組、對照組、假模組、正常組，每組12只。手法組和對照組通過結(jié)扎下肢部分靜脈造成骨內(nèi)高壓型膝骨關(guān)節(jié)炎模型；假模組行手術(shù)顯露但不結(jié)扎切斷相應(yīng)血管；正常組則不做任何處理。自造模1周后手法組予揉髕手法，連續(xù)治療5周，共17次，其余3組不予任何治療措施。在造模后第12周末取右膝關(guān)節(jié)脛骨平臺內(nèi)側(cè)軟骨組織進行肉眼觀察和切片光鏡觀察，并按照關(guān)節(jié)軟骨改良Mankin分級評分標(biāo)準(zhǔn)進行病理學(xué)評分。結(jié)果：經(jīng)軟骨組織病理學(xué)Mankin評分，對照組評分與手法組、假模組及正常組比較明顯較高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P < 0.05）；手法組與假模組比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P = 0.99 > 0.05）。對照組呈現(xiàn)中度退變，手法組及假模組為輕度退變，正常組未見明顯退變。結(jié)論：揉髕手法能延緩軟骨組織退變。

【關(guān)鍵詞】 骨關(guān)節(jié)炎，膝；揉髕手法；軟骨組織；動物模型

Effect of Kneading Manipulation on Cartilage Tissue in Rabbit Models with Knee Osteoarthritis

TIAN Lin，DAI Qi-yi，DAI Zi-yi，LUO Rong-yu

【ABSTRACT】Objective：To observe the effect of kneading manipulation on the morphology of cartilage in rabbits with knee osteoarthritis，and to provide experimental basis for the prevention and treatment of knee osteoarthritis.Methods：Forty eight New Zealand rabbits were randomly divided into a manipulation group，a control group，a sham group and a normal group，with 12 rabbits in each group.In the manipulation group and the control group，the intraosseous hypertensive knee osteoarthritis models were induced by ligation of the lower part of the vein.The sham group underwent operation without ligation and cut-off of the corresponding blood vessels；and the normal group did not receive any treatment.One week after the models were made，rabbits in the manipulation group were treated with kneading manipulation for five consecutive weeks，a total of 17 times，and the remaining three groups were not given any treatment.At the end of the twelfth week after the establishment of the models，the medial articular cartilage of the right knee joint tibial plateau was taken out and observed with naked eyes and slice light microscope，and the pathological scores were evaluated according to the improved Mankin grading standard of the articular cartilage.Results：According to Mankin scores，the scores of the control group was significantly higher than those in the manipulation group，the sham group and the normal group，and the difference was statistically significant（P < 0.05）.The difference between the manipulation group and the sham group was not statistically significant（P = 0.99 > 0.05）.The control group showed a metaphase degeneration，while the control group and the sham group showed a mild degeneration，and there was no obvious degeneration in the normal group.Conclusion：The kneading manipulation can delay the degeneration of cartilage tissue.

【Keywords】 osteoarthritis，knee；

kneading manipulation；cartilage tissue；endprint

animal model

膝骨關(guān)節(jié)炎（knee osteoarthritis，KOA）是一種以關(guān)節(jié)軟骨退變損壞、關(guān)節(jié)周圍軟組織炎性反應(yīng)、關(guān)節(jié)邊緣和軟骨下骨骨質(zhì)增生及半月板退變等為主要病理表現(xiàn)，以膝關(guān)節(jié)疼痛、活動障礙等為主要臨床表現(xiàn)的退行性、炎癥性關(guān)節(jié)疾病[1]，其中關(guān)節(jié)軟骨退變是KOA主要病理表現(xiàn)。關(guān)節(jié)軟骨是一種無神經(jīng)、無血管的透明軟骨組織，主要由軟骨細胞和細胞外基質(zhì)組成，具有抗磨損、潤滑關(guān)節(jié)、傳導(dǎo)關(guān)節(jié)負荷和緩沖震蕩等功能[2-4]。作為KOA的早期病變部位，軟骨的主要病理表現(xiàn)為軟骨細胞的凋亡和細胞外基質(zhì)的降解，進一步發(fā)展為軟骨的進行性破壞和消耗。由此可見，保證關(guān)節(jié)軟骨的結(jié)構(gòu)及功能的完整性是維持膝關(guān)節(jié)正常生理功能的重要

條件。

揉髕手法是由捏拿股四頭肌、旋轉(zhuǎn)揉按髕骨和屈伸牽張患膝關(guān)節(jié)等手法組成，其療效已經(jīng)得到臨床證實[5]。本實驗通過觀察揉髕手法對兔KOA模型軟骨組織形態(tài)的影響，為KOA的防治提供實驗依據(jù)。

1 實驗材料

1.1 實驗動物 普通級6月齡新西蘭兔48只，雌雄各半，體質(zhì)量（2.75±0.25）kg，由廣西中醫(yī)藥大學(xué)實驗動物中心提供，動物使用許可證號：SYXK（桂）2003-0001。

1.2 主要儀器 脫水機（ASP3005型，德國LEICA公司）；包埋機（EG1160型，德國LEICA公司）；切片機（RM2235型，德國LEICA公司）；生物組織攤片烤片機（CS-Ⅲ型，孝感亞鵬公司）；光學(xué)顯微鏡（CX31型，日本OLYMPUS公司）。

2 方 法

2.1 動物分組 整個實驗操作過程依照我國科學(xué)實驗技術(shù)部門頒發(fā)的《關(guān)于善待實驗動物的指導(dǎo)性意見》對動物實施處置[6]。實驗動物飼養(yǎng)于廣西中醫(yī)藥大學(xué)實驗動物中心特定的兔房內(nèi)，在單籠室溫條件下，可于籠內(nèi)自由活動，自主飲水及進食。于相同環(huán)境條件下適應(yīng)性飼養(yǎng)1周后，將48只新西蘭兔采用隨機數(shù)字表法分為手法組、對照組、假模組、正常組，每組12只。

2.2 模型制備方法 本研究采用手術(shù)結(jié)扎兔右側(cè)臀下靜脈、股靜脈及大隱靜脈造成骨內(nèi)高壓型KOA模型[7-9]。手法組、對照組和假模組均應(yīng)用1%戊巴比妥鈉3 mL·kg-1行耳靜脈麻醉，待麻醉效果良好后，手法組和對照組24只兔取左側(cè)臥位固定于動物實驗解剖臺上，右側(cè)臀部手術(shù)區(qū)去毛備皮、碘伏消毒。在髖關(guān)節(jié)大轉(zhuǎn)子后1 cm處標(biāo)記定位，以此為中點，縱行切開皮膚，切口長約3 cm，用彎鉗對皮下組織、筋膜及肌肉進行逐層分離，徹底止血使術(shù)野清晰，充分顯露髂內(nèi)靜脈分支臀下靜脈并剝離，絲線雙重結(jié)扎，結(jié)扎線間切斷。取仰臥位，充分暴露右側(cè)腹股溝，去毛備皮、消毒，在右側(cè)腹股溝動脈搏動處定位并縱行切開皮膚，切口長約

4 cm，彎鉗分離皮下組織，止血使術(shù)野暴露清晰，于股動脈搏動旁找到伴行的股靜脈及大隱靜脈并分離，分別雙重結(jié)扎后從線間切斷。依次逐層縫合皮下組織、皮膚后，敷蓋酒精紗布、棉墊，并用膠帶牢固固定。

假模組采用相同的體位及消毒方法，取同樣的切口清晰地顯露出臀下靜脈、股靜脈和大隱靜脈，但不予結(jié)扎和切斷，暴露完成后由內(nèi)到外直接進行手術(shù)口縫合，酒精紗布、棉墊敷料包扎固定。

手術(shù)后手法組、對照組、假模組連續(xù)3 d給予左側(cè)臀肌注射青霉素（5×104 U·kg-1·d-1）、鏈霉素（1×105 U·kg-1·d-1）預(yù)防感染，同時密切注意術(shù)口敷料覆蓋情況，必要時進行術(shù)口換藥包扎固定，直至術(shù)口愈合。正常組12只不做任何處理。

2.3 實驗干預(yù) 手法組造模1周后使用揉髕手法進行治療，具體操作如下：將動物置于操作臺，待動物情緒穩(wěn)定后由上而下捏拿兔右下肢股四頭肌

3 min，然后先順時針后逆時針旋轉(zhuǎn)揉按患膝髕骨3 min，再屈伸牽張膝關(guān)節(jié)4 min。每只兔每次施術(shù)10 min，隔日1次，因手法施術(shù)的時長與力度等具有主觀差異，為盡可能減小實驗數(shù)據(jù)的偏倚，由專人定時施術(shù)，連續(xù)治療5周，共17次。對照組造模后不再做其他干預(yù)處理，同時期常規(guī)飼養(yǎng)。假模組術(shù)后不做任何干預(yù)處理，同時期常規(guī)飼養(yǎng)。正常組不做任何干預(yù)處理，同時期常規(guī)飼養(yǎng)。

2.4 實驗動物軟骨組織形態(tài)觀察 在第12周末采血后，全部沿耳緣靜脈空氣栓塞處死動物，于兔右膝關(guān)節(jié)處備皮，常規(guī)消毒，解剖右膝關(guān)節(jié)后，使用咬骨鉗、手術(shù)刀取內(nèi)側(cè)脛骨平臺軟骨組織，固定染色，切片光鏡觀察，具體步驟如下：①取實驗動物右膝關(guān)節(jié)內(nèi)側(cè)脛骨平臺軟骨約0.3 cm×0.3 cm，肉眼大體觀察軟骨組織的顏色、光澤及形態(tài)后，放入4%多聚甲醛溶液中固定備檢。②將備檢的軟骨組織樣本取出，經(jīng)過脫鈣、脫水，石蠟包埋，連續(xù)切片，厚度約為3 μm，然后HE染色、封片，光學(xué)顯微鏡下觀察并拍攝，記錄各組軟骨組織形態(tài)學(xué)的變化。③甲苯胺藍染色組織樣本切片脫蠟后，蒸餾水反復(fù)浸洗3次，0.1%甲苯胺藍液浸染10 min，染色5～8 min，用蒸餾水將多余染液洗凈，95%的乙醇進行Ⅰ、Ⅱ級脫水處理，然后用二甲苯由低到高的三級別透明處理，中性樹膠封固，光學(xué)顯微鏡下觀察并拍攝記錄各組軟骨組織形態(tài)學(xué)的變化，按照關(guān)節(jié)軟骨改良Mankin分級評分準(zhǔn)則進行病理學(xué)評分。見表1。

2.5 統(tǒng)計學(xué)方法 采用SPSS 20.0軟件進行統(tǒng)計分析。計量資料以表示，2組間比較采用獨立樣本t檢驗；多組間比較采用單因素方差分析。以P < 0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

3 結(jié) 果

3.1 關(guān)節(jié)軟骨組織形態(tài)的大體觀察 兔膝關(guān)節(jié)軟骨肉眼觀察結(jié)果見表2。

3.2 關(guān)節(jié)軟骨組織形態(tài)的光鏡下觀察 手法組：軟骨表面可見大部分深達移行層的裂隙，見圖

1（1）；四層結(jié)構(gòu)基本清晰。部分動物軟骨層增厚，表層及中層細胞增多，并排列稍紊亂；潮線清晰完整，個別標(biāo)本潮線稍模糊或出現(xiàn)雙潮線；甲苯胺藍染色出現(xiàn)輕度減退，見圖2（1）。endprint

對照組：軟骨表面不光滑，可見糜爛和缺損，且大部分動物可見深達輻射層，周圍軟骨見簇狀增生明顯，局灶骨贅；軟骨層變薄顯著，軟骨厚薄不均勻，軟骨細胞顯著減少，見圖1（2）；軟骨中可見潮線扭曲紊亂，并有軟骨下血管入侵潮線現(xiàn)象；甲苯胺藍染色以中度減退為主，個別動物軟骨呈重度減退，見圖2（2）。

假模組：軟骨表面裂隙不規(guī)則，部分動物軟骨裂隙深達移行層，見圖1（3）；軟骨四層結(jié)構(gòu)清晰，層次排列規(guī)則，軟骨細胞數(shù)量正常；有一只兔的軟骨層變薄明顯，軟骨細胞明顯減少；大部分標(biāo)本潮線清晰完整，個別標(biāo)本稍模糊或出現(xiàn)雙潮線，或軟骨下血管入侵潮線現(xiàn)象；甲苯胺藍染色輕度減退為主，見圖2（3）。

正常組：軟骨表面光滑平整，見圖1（4），個別標(biāo)本軟骨表面見小裂隙；軟骨四層結(jié)構(gòu)清晰，層次排列規(guī)則，軟骨細胞數(shù)量正常；大部分標(biāo)本潮線清晰完整，個別標(biāo)本稍模糊或出現(xiàn)雙潮線，個別動物甲苯胺藍染色輕度減退，見圖2（4）。

3.3 關(guān)節(jié)軟骨組織病理學(xué)Mankin分級評分 按照關(guān)節(jié)軟骨改良Mankin分級評分準(zhǔn)則進行病理學(xué)評分，對照組評分顯著高于其他3組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P < 0.05）；手法組與假模組比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P > 0.05）。見表3。

4 討 論

4.1 KOA動物模型的建立與選擇 目前，通過實驗成功復(fù)制KOA模型的方法主要有自發(fā)性動物模型、誘發(fā)性模型兩類。為模仿人類下肢的生物力學(xué)特性，造模動物以大鼠、兔、山羊、狗等哺乳動物為主。自發(fā)性動物模型即讓實驗動物自發(fā)關(guān)節(jié)軟骨退變形成自身KOA，其病理過程與人相似，是一種理想的原發(fā)性KOA模型。誘發(fā)性模型制備方法較多，主要有機械方法、關(guān)節(jié)腔注射法及外科手術(shù)法，如Videman法、Hulth及改良法、關(guān)節(jié)刻痕法等[8-10]。

根據(jù)本課題的研究目的和實驗要求，結(jié)合實驗干預(yù)的特點，筆者選擇骨內(nèi)高壓造模法，通過手術(shù)破壞膝關(guān)節(jié)穩(wěn)定裝置、血運系統(tǒng)或直接損傷關(guān)節(jié)軟骨組織，模擬KOA關(guān)節(jié)應(yīng)力改變、微循環(huán)障礙、骨內(nèi)壓增加等病理改變。依據(jù)如下：首先，動物骨內(nèi)高壓造模方法符合人類KOA病理變化。其次，該方法具有模型穩(wěn)定、成功率高等特點，有利于本實驗干預(yù)措施的實施。因關(guān)節(jié)手術(shù)造模對關(guān)節(jié)結(jié)構(gòu)有所破壞，而機械方法則對關(guān)節(jié)活動進行限制，二者均對手法干預(yù)有一定的影響。骨內(nèi)高壓造模方法無需破壞關(guān)節(jié)結(jié)構(gòu)，不影響關(guān)節(jié)正?；顒雍褪址ǖ膶嵤?。

從動物軟骨組織觀察及Mankin分級評分結(jié)果看，對照組軟骨組織破壞嚴重，Mankin分級評分高達（9.17±0.72）分，可認為軟骨組織達到中度退變，手法組及假模組以輕度退變?yōu)橹?，正常組未見明顯退變，該實驗結(jié)果符合KOA軟骨組織基本病理變化特點，可認為本實驗造模成功，證明結(jié)扎動物下肢靜脈制備骨內(nèi)高壓型KOA模型的方法可取。

4.2 揉髕手法對兔KOA動物模型軟骨病理學(xué)的影響 軟骨作為KOA的早期病變組織，主要病理表現(xiàn)為軟骨的退變與消耗，軟骨組織呈現(xiàn)進行性破壞和流失[11]。揉髕手法作為一種力學(xué)干預(yù)措施，在治療KOA的過程中，膝關(guān)節(jié)周圍組織承受屈伸牽張、揉按等產(chǎn)生的應(yīng)力，經(jīng)軟骨基質(zhì)-整合素-細胞骨架信號傳導(dǎo)通路實現(xiàn)力學(xué)因素的干預(yù)，引發(fā)軟骨細胞內(nèi)一系列生化反應(yīng)和基因組學(xué)以及代謝組學(xué)變化，有效延緩軟骨細胞的退變和降解，最終改善KOA癥狀及關(guān)節(jié)功能[12]。

在軟骨組織病理觀察方面，經(jīng)軟骨組織的肉眼觀察及光鏡下觀察軟骨的光滑度、顏色及色澤、厚度及銳度、軟骨細胞的數(shù)量、形態(tài)和層次，發(fā)現(xiàn)手法組和對照組呈輕、中度退變，但手法組相對較輕，二者Mankin分級評分結(jié)果也與該病理觀察結(jié)果相符合。本次實驗中，手法組的Mankin分級評分與對照組比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P < 0.05），可見揉髕手法能有效延緩關(guān)節(jié)軟骨退變。值得一提的是，假模組軟骨也以輕度退變?yōu)橹?，假模組Mankin分級評分與手法組比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P ﹥ 0.05），

而與正常組比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P < 0.05），可見假模組軟骨亦有輕度退變。假模組軟骨的變化可能是假模組在接受手術(shù)干預(yù)后，因創(chuàng)傷因素影響關(guān)節(jié)組織內(nèi)環(huán)境代謝改變及活動量較少等造成的，當(dāng)然，亦有Mankin評分時的人為誤差等客觀因素的存在。

揉髕手法能延緩軟骨組織退變，達到延緩KOA進展，治療KOA的目的。但揉髕手法對軟骨組織的具體作用機制仍未完全明晰，尚需進一步研究。

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收稿日期：2017-04-09；修回日期：2017-06-20endprint