人參皂苷Rg1對(duì)局灶性腦缺血再灌注后大鼠海馬微管相關(guān)蛋白表達(dá)的影響

黃 俊，呂立華，楊特清，鄧 敏，陸曲折

(邵陽(yáng)學(xué)院，湖南 邵陽(yáng)，422000)

2017-09-03

湖南省教育廳一般課題(15C1258)

黃俊(1982-)，男，湖南新邵人，醫(yī)學(xué)碩士，副教授，主要從事中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病的發(fā)病機(jī)制的研究

1672-7010(2017)05-0109-05

人參皂苷Rg1對(duì)局灶性腦缺血再灌注后大鼠海馬微管相關(guān)蛋白表達(dá)的影響

黃 俊，呂立華，楊特清，鄧 敏，陸曲折

(邵陽(yáng)學(xué)院，湖南 邵陽(yáng)，422000)

目的探討人參皂苷Rg1是否可通過(guò)促進(jìn)局灶性腦缺血再灌注大鼠海馬微管相關(guān)蛋白(Doublecortin，DCX)而改善神經(jīng)功能缺損體征。方法采用大腦中動(dòng)脈栓塞法(MACO)制作局灶性腦缺血再灌注模型。雄性SD大鼠隨機(jī)被分成假手術(shù)組(n=10)、模型組(n=10)和人參皂苷Rg1組(n=10)。模型組腦缺血再灌注后30min腹腔注射等體積的0.9%生理鹽水，1次/d，人參皂苷Rg1組ip人參皂苷Rg1(50mg/kg，濃度為8g/L)，1次/d。14d后對(duì)3組大鼠進(jìn)行神經(jīng)功能評(píng)分；采用免疫組織化學(xué)染色和Western-blot觀察3組大鼠DCX在海馬的表達(dá)。結(jié)果與模型組相比，人參皂苷Rg1組神經(jīng)功能缺損程度評(píng)分下降(P<0.05)；給予人參皂苷Rg1干預(yù)后，局灶性腦缺血再灌注大鼠海馬SGZ(齒狀回顆粒細(xì)胞下層)區(qū)DCX陽(yáng)性細(xì)胞、海馬區(qū)DCX蛋白水平顯著增加(P<0.05)。結(jié)論人參皂苷Rg1可通過(guò)上調(diào)海馬微管相關(guān)蛋白的表達(dá)而改善局灶腦缺血大鼠的神經(jīng)功能缺損體征。

人參皂苷Rg1；局灶腦缺血再灌注；海馬；微管相關(guān)蛋白

腦卒中作為一種急性腦血管疾病，嚴(yán)重危害人們身體健康。腦缺血損害是腦卒中最主要的形式，約占60%～80%。腦卒中存活患者?？沙霈F(xiàn)不同程度的神經(jīng)功能缺損體征，如神經(jīng)元的丟失和伴有認(rèn)知及運(yùn)動(dòng)功能的損害。中醫(yī)藥具有全方位、多靶點(diǎn)的作用，在治療腦中風(fēng)積累了豐富的臨床經(jīng)驗(yàn)。人參是我國(guó)珍貴的中藥材，有“大補(bǔ)元?dú)?，?fù)脈固脫，生津安神”等功效。人參皂苷Rg1是五加科植物人參Panax ginseng C.A.Mey.的干燥根。人參皂苷Rg1可以增強(qiáng)神經(jīng)前體細(xì)胞增殖能力，促進(jìn)神經(jīng)發(fā)生[1]，可通過(guò)下調(diào)大鼠缺血大腦皮層腫瘤壞死因子受體1和多聚二磷酸腺苷核糖聚合酶-1的表達(dá)而發(fā)揮神經(jīng)保護(hù)作用[2]。除此之外,人參皂苷Rg1可以促進(jìn)培養(yǎng)的胎鼠大腦皮質(zhì)神經(jīng)干細(xì)胞的增殖[3]。Doublecortin(DCX)作為一種微管相關(guān)蛋白，是神經(jīng)元前體細(xì)胞的標(biāo)志物，表達(dá)在遷移的神經(jīng)祖細(xì)胞和未成熟神經(jīng)元中[4]。腦缺血后可刺激大腦相關(guān)腦區(qū)神經(jīng)前體細(xì)胞的增殖和遷移，改善大腦的突觸可塑性和促進(jìn)腦的自身修復(fù)。但關(guān)于人參皂苷RG1是否可增強(qiáng)腦缺血后大腦海馬區(qū)微管相關(guān)蛋白的表達(dá)而發(fā)揮神經(jīng)保護(hù)作用報(bào)道較少，因此本次研究通過(guò)大腦中動(dòng)脈栓塞法(MACO)建立局灶性腦缺血再灌注模型，觀察人參皂苷Rg1是否通過(guò)促進(jìn)海馬SGZ區(qū)微管相關(guān)蛋白的表達(dá)而發(fā)揮改善神經(jīng)功能缺損體征的作用。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

出生2月左右體重為230～280g的雄性Sprague-Dawley大鼠，由湖南斯萊克景達(dá)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司提供。動(dòng)物飼養(yǎng)于聚丙烯籠中，房室溫保持(22±1)℃，相對(duì)濕度50%～55%，光照與黑暗各為12h的環(huán)境，自由飲水和攝給予標(biāo)準(zhǔn)飲食。

1.2 實(shí)驗(yàn)儀器和試劑

珊頓冰凍切片機(jī)(Shandon公司)，人參皂苷Rg1(南京澤朗生物科技有限公司，HPLC≥98%)，羊抗DCX抗體(Santa Cruz Biotechnology公司)，生物素化山羊抗大鼠(武漢博士德公司)，抗生物素蛋白-生物素復(fù)合物(ABC Kit)，二氨基聯(lián)苯胺(武漢博士德公司)。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 局灶性腦缺血模型的建立

參考Longa EZ等[5]制作MCAO(大腦中動(dòng)脈栓塞)模型。所有大鼠經(jīng)腹腔注射10%水合氯醛(0.35ml/100g)麻醉，仰臥固定于手術(shù)臺(tái)。去毛，碘伏消毒，從頸部右側(cè)做手術(shù)切口，分離頸總動(dòng)脈、頸外動(dòng)脈、頸內(nèi)動(dòng)脈及迷走神經(jīng)。其中頸內(nèi)動(dòng)脈分離至翼腭動(dòng)脈，頸外動(dòng)脈分離出來(lái)3～5mm。動(dòng)脈夾夾閉頸總動(dòng)脈和頸內(nèi)動(dòng)脈。在頸外動(dòng)脈距頸總動(dòng)脈叉3～5mm處結(jié)扎剪斷頸外動(dòng)脈，提起頸外動(dòng)脈游離端使其與頸內(nèi)動(dòng)脈成一直線，于頸外動(dòng)脈結(jié)扎處近心端用眼科手術(shù)剪約剪一小切口，將拴線(用直徑為0.26mm 漁線，頭端用石蠟制備成膨大且光滑的球形)插入到頸內(nèi)動(dòng)脈，插入深度為(18±4)mm。阻閉2h后抽出栓塞線制備成再灌注模型。模型制作過(guò)程中盡量減少大鼠的痛疼和動(dòng)物的使用數(shù)量。

1.3.2 實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)

將所有大鼠隨機(jī)分成假手術(shù)組、模型組、人參皂苷Rg1組。假手術(shù)組只分離頸總動(dòng)脈，不栓塞，不給于任何藥物干預(yù)；模型組右側(cè)缺血再灌注后30min給予等體積0.9%NaCl，1次/d；人參皂苷Rg1組再灌注后30min給予人參皂苷Rg1(50mg/kg，濃度為8g/L)，1次/d。造模成功14d后免疫組化觀察三組大鼠神經(jīng)功能缺損程度及DCX在海馬的表達(dá)。

1.3.3 神經(jīng)功能缺失體征評(píng)分

參考Longa等[5]制定的 5分法在造模成功14d后對(duì)大鼠進(jìn)行神經(jīng)功能缺失體征評(píng)分。0分：無(wú)神經(jīng)損傷癥狀；1分：不能完全伸展對(duì)側(cè)前爪；2分：行走是向?qū)?cè)轉(zhuǎn)圈；3分：不能站立，向?qū)?cè)傾斜；4分：不能自發(fā)行走，意識(shí)喪失。其中1～3分為模型成功。模型制備成功后，假手術(shù)組死掉1只，模型組死掉4只，人參皂苷Rg1組死掉2只。

1.3.4 腦組織標(biāo)本的制備

10%水合氯醛麻醉成功后，從大鼠心尖部位插入灌注針頭直到主動(dòng)脈，0.9%生理鹽水快速灌注，然后改用4%多聚甲醛磷酸鹽緩沖液灌注；取出腦組織，多聚甲醛磷酸鹽緩沖液后固定過(guò)夜；梯度沉糖(15%和30%各一遍)；包埋。采用冠狀位切片，切片厚度為30μm。

1.3.5 免疫組織化學(xué)染色(ABC法)

0.01M PBS(PH=7.3)溶液漂洗腦片3次，每次10min；3% H2O2處理腦組織30min；漂洗3次，每次10min；5%馬血清孵育2h；加入羊抗- DCX(1∶1000)4℃孵育過(guò)夜；漂洗3次，每次10min；加入生物素化馬抗山羊IgG(1∶400)，室溫孵育2h；抗生物素蛋白-生物素復(fù)合物(ABC Kit)(1∶400)，室溫孵育2h；DAB顯色；酒精脫水、二甲苯脫脂、中性樹(shù)脂封片。

1.3.6 免疫印跡技術(shù)

麻醉大鼠，冰上操作，分離海馬。使用總蛋白提取試劑盒提取蛋白，4℃，12,000r/min條件下離心20min。收集上清液，測(cè)定蛋白濃度并配平。用SDS-PAGE凝膠電泳，每個(gè)泳道加入30μg總蛋白。電泳蛋白分離轉(zhuǎn)移至硝酸纖維膜上，轉(zhuǎn)膜30min。將含有羊抗-DCX(1∶1000)孵育2h，4℃過(guò)夜。1×TBST 溶液漂洗，和偶聯(lián)HRP 標(biāo)記的兔抗山羊IgG(1∶1000)反應(yīng)。室溫孵育2h，1×TBST 溶液漂洗，15min×3 次，采用ECL化學(xué)發(fā)光法進(jìn)行顯影。以GAPDH作為內(nèi)參，采用NIH Image J分析DCX條帶，蛋白相對(duì)量表示DCX條帶的平均吸光度值與內(nèi)參的平均吸光度的比值。

1.4 統(tǒng)計(jì)結(jié)果處理

2 實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.1 各組大鼠神經(jīng)功能評(píng)分比較

各組大鼠蘇醒后，假手術(shù)組未出現(xiàn)神經(jīng)功能缺損癥狀，模型組人參皂苷Rg1組均出現(xiàn)相應(yīng)的神經(jīng)功能缺損體征：左前肢肌張力下降，爬行時(shí)可發(fā)現(xiàn)大鼠向右側(cè)轉(zhuǎn)圈。局灶性腦缺血再灌注后14d，模型組神經(jīng)功能評(píng)分為(2.83±0.37)分，人參皂苷Rg1組評(píng)分為(1.67±0.75)分，兩組大鼠的神經(jīng)功能評(píng)分有顯著性差異(P<0.05)。

2.2 人參皂苷Rg1促進(jìn)海馬區(qū)DCX細(xì)胞和蛋白水平的表達(dá)DCX

陽(yáng)性細(xì)胞主要表達(dá)在海馬的齒狀回顆粒細(xì)胞下層(SGZ)，假手術(shù)組SGZ區(qū)DCX陽(yáng)性細(xì)胞為(14.83±8.30)個(gè)/mm2，腦缺血再灌注14d后，DCX陽(yáng)性細(xì)胞密度顯著增加(P<0.05)，給予人參皂苷Rg1干預(yù)后，DCX陽(yáng)性細(xì)胞密度進(jìn)一步顯著上升(P<0.05)。見(jiàn)表1。Western-blot結(jié)果顯示模型組海馬DCX蛋白水平較假手術(shù)組顯著升高(P<0.05)，人參皂苷Rg1組DCX蛋白水平與模型組及假手術(shù)組相比，均有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.05)。見(jiàn)表1。

表1 各組大鼠神經(jīng)功能評(píng)分及海馬區(qū)DCX陽(yáng)性細(xì)胞、蛋白水平比較

注：與模型組相比，△P<0.05；與假手術(shù)組相比，*P<0.05，##P<0.05。

3 討論

筆者之前研究表明人參皂苷Rg1可以通過(guò)上調(diào)局灶性腦缺血再灌注大鼠海馬CA1區(qū)腦源性神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子(BDNF)的表達(dá)而改善學(xué)習(xí)記憶能力[6]。本次研究在前期的工作基礎(chǔ)上進(jìn)一步探討人參皂苷Rg1是否通過(guò)促進(jìn)局灶性腦缺血再灌注大鼠大腦的神經(jīng)再生能力而改善神經(jīng)功能缺損體征。

人參皂苷Rg1是從我國(guó)名貴中藥人參中提取而來(lái)，具有抗氧化、延緩智力下降和改善由神經(jīng)退行性疾病導(dǎo)致的行為學(xué)障礙，被廣泛運(yùn)用于心腦血管疾病的基礎(chǔ)實(shí)驗(yàn)研究。神經(jīng)功能缺損程度評(píng)分是評(píng)價(jià)腦缺血再灌注后大鼠的運(yùn)動(dòng)功能、感覺(jué)功能及反射和平衡能力，作為反應(yīng)腦缺血后藥物治療的療效評(píng)價(jià)指標(biāo)之一。本次神經(jīng)功能評(píng)級(jí)采用傳統(tǒng)的Longa及Bederson制定的5分法。行為學(xué)結(jié)果顯示局灶性腦缺血再灌注后，大鼠出現(xiàn)顯著的神經(jīng)功能缺損體征。而給予人參皂苷Rg1干預(yù)后，局灶性腦缺血再灌注大鼠的神經(jīng)功能缺損體征得到顯著改善。這再次證明人參皂苷Rg1具有神經(jīng)功能保護(hù)的作用。那么人參皂苷Rg1是通過(guò)什么機(jī)制而發(fā)揮神經(jīng)保護(hù)的作用呢？

Doublecortin(DCX)是分子量為40KDa的一種磷酸化蛋白，其基因位點(diǎn)為Xq22.3-23，由DCX基因編碼。DCX是神經(jīng)系統(tǒng)特異性相關(guān)蛋白，表達(dá)在胚胎期和出生后中樞和外周神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育階段的遷移神經(jīng)元[7]。DCX能特異性的表達(dá)于未成熟和遷移神經(jīng)元，是未成熟神經(jīng)元的特異性標(biāo)記物[8]，代表神經(jīng)再生的水平[9]。DCX主要表達(dá)在海馬的SGZ區(qū)、腦室的室管膜下區(qū)[10]、吻側(cè)遷移流[11]、嗅球及梨狀皮質(zhì)[12]等部位，而腦缺血后常能刺激這些部位加速神經(jīng)元前體細(xì)胞的增殖和遷移。本次實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示假手術(shù)組海馬SGZ區(qū)DCX陽(yáng)性細(xì)胞為(14.83±8.30)個(gè)/mm2，局灶性腦缺血再灌注14d后， DCX陽(yáng)性細(xì)胞密度為(20.67±5.09)個(gè)/mm2，這說(shuō)明腦缺血刺激了大鼠海馬神經(jīng)元前體細(xì)胞的增殖和遷移。而給予人參皂苷 Rg1治療后，DCX陽(yáng)性細(xì)胞密度進(jìn)一步增加，這說(shuō)明人參皂苷 Rg1有益于腦缺血再灌注大鼠大腦的神經(jīng)再生。為了進(jìn)一步證明筆者的結(jié)論，筆者采用免疫印跡技術(shù)測(cè)量3組大鼠海馬DCX 的蛋白水平。3組大鼠海馬DCX 蛋白水平的表達(dá)趨勢(shì)與形態(tài)學(xué)實(shí)驗(yàn)結(jié)果保持一致。

綜上所述，人參皂苷 Rg1可以通過(guò)促進(jìn)局灶性腦缺血再灌注大鼠海馬神經(jīng)元前體細(xì)胞的增殖和遷移而發(fā)揮神經(jīng)保護(hù)作用。

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TheEffectoftheGinsenosideRg1ontheExpressionoftheMicrotubule-associatedProteininRatHippocampusFollowingFocalCerebralIschemiaandReperfusion

HUANG Jun,LV Lihua,YANG Teqing,DENG min,LU Quzhe

(Shaoyang University,Shaoyang 422000,China)

ObjectiveTo explore the effect of Ginsenoside Rg1 on the neurological function deficit and expression of Doublecortin (DCX) in rat hippocampus following focal cerebral ischemia reperfusion.MethodsFocal cerebral ischemia reperfusion model was made by the MACO method and all male rats were randomly divided into sham operation group (n=10), model group (n=10) and Ginsenoside Rg1 group (n=10). The model group was administered with the equal volume of normal saline once a day 30 minutes after cerebral ischemia reperfusion. The Ginsenoside Rg1 group was treated with Ginsenoside Rg1 once a day. The does of Ginsenoside Rg1 was 50mg/kg and the concentration was 8g/L．Fourteen days later, the neurological function deficit score was assessed and the expression of DCX in rat hippocampus of 3 groups was observed via immunohistochemistry and Western-blot.ResultsIn comparison with the model group，the neurological function deficit score of the Ginsenoside Rg1 group decreased (P<0.05). After the intervention of Ginsenoside Rg1, the DCX positive cells in the hippocampal SGZ zone and the DCX protein level expressed in rat hippocampus significantly increased (P<0.05).ConclusionGinsenoside Rg1 could improve the neurological function deficit signs of rats with focal cerebral ischemia through upregulating the DCX expression in hippocampus.

Ginsenoside Rg1;focal cerebral ischemia reperfusion;hippocampus;microtubule-associated protein

R285.5

A