褶牡蠣氨肽酶B的分離純化和性質(zhì)研究

唐 逸， 顏龍杰， 鐘 嬋， 張凌晶,2， 翁 凌,2， 曹敏杰,2,*

(1.集美大學(xué) 食品與生物工程學(xué)院， 福建 廈門 361021；2.水產(chǎn)品深加工技術(shù)國家地方聯(lián)合工程研究中心， 福建 廈門 361021)

褶牡蠣氨肽酶B的分離純化和性質(zhì)研究

唐 逸1， 顏龍杰1， 鐘 嬋1， 張凌晶1,2， 翁 凌1,2， 曹敏杰1,2,*

(1.集美大學(xué) 食品與生物工程學(xué)院， 福建 廈門 361021；2.水產(chǎn)品深加工技術(shù)國家地方聯(lián)合工程研究中心， 福建 廈門 361021)

氨肽酶是一類能特異水解蛋白質(zhì)N端氨基酸殘基的外切酶，在食品行業(yè)有著廣闊的應(yīng)用前景。以褶牡蠣(Alectryonellaplicatula)為原料，通過硫酸銨鹽析，DEAE-sepharose，phenyl-sepharose及羥基磷灰石柱層析，分離純化得到了一種高效水解堿性氨基酸的氨肽酶，其活性能被氨肽酶特異性抑制劑bestatin有效抑制。雙向電泳結(jié)果顯示該酶的分子質(zhì)量約為100 ku，pI約為5.8。通過肽質(zhì)量指紋圖譜對其進行鑒定得到12個肽段，共含138個氨基酸殘基，這些氨基酸序列與太平洋牡蠣中嘌呤霉素敏感性氨肽酶一致，表明純化的酶為氨肽酶B。褶牡蠣氨肽酶B的二級結(jié)構(gòu)以無規(guī)卷曲與反向平行為主，其中無規(guī)卷曲占42.6%，反向平行占32.0%。動力學(xué)研究獲得其Km和kcat值分別為1.5 μmol/L和117.5 s-1，kcat/Km為78.3 L/(μmol·s)-1。在35 ℃，pH值 7.0的條件下，該酶具有最大催化活性，能高效水解氨肽酶底物L(fēng)ys-MCA和Arg-MCA，釋放出游離態(tài)的Lys和Arg，推測與牡蠣呈味相關(guān)。

牡蠣； 氨肽酶； 純化； MALDI-TOF/TOF質(zhì)譜

我國是牡蠣生產(chǎn)大國，2014年產(chǎn)量達435萬t，其中，福建省的產(chǎn)量達160多萬t，位居全國首位[1]。牡蠣富含糖原、鋅、維生素及各種游離態(tài)氨基酸，營養(yǎng)價值高。牡蠣中的游離氨基酸作為營養(yǎng)物質(zhì)的同時，還影響牡蠣風(fēng)味，賦予其特有的鮮味。由于游離氨基酸的釋放與調(diào)控需要酶的催化水解作用，因而這些酶的研究受到廣泛關(guān)注。

氨肽酶(aminopeptidase, AP)是一類從多肽鏈N端由外向內(nèi)選擇性切割氨基酸殘基的蛋白酶的統(tǒng)稱。目前對氨肽酶的研究涉及廣泛，在機體免疫代謝方面，植物花粉中的氨肽酶能夠降解神經(jīng)肽，從而參與花粉過敏反應(yīng)[2]。脂肪細胞中的氨肽酶種類繁多，其中的3種氨肽酶(AspAP、PSA、MetAP)與機體的能量代謝密切相關(guān)[3]。氨肽酶B(aminopepti-dase B, APB，EC 3.4.11.6)參與血壓調(diào)節(jié)，還直接參與腦啡肽、緩激肽等神經(jīng)肽的分泌與合成[4]。由于氨肽酶的酶解產(chǎn)物為游離氨基酸及小肽，氨肽酶被廣泛應(yīng)用于食品工業(yè)中。在食品加工煮制過程中，氨肽酶的降解產(chǎn)物能與糖原共同作用，通過美拉德反應(yīng)使食物表現(xiàn)出強烈的香味及鮮味[5]。在蛋白肽的制備過程中，氨肽酶對N端疏水性氨基酸的切除可以降低小肽的苦味[6]。

相比哺乳動物、植物及微生物，對水生動物中氨肽酶的研究還較少。在前期的研究中，對來源于牙鲆[7]、真鯛[8]及青魚肌肉[9]中的氨肽酶已有了報道，對氨肽酶參與這些水產(chǎn)品的風(fēng)味形成機制也進行了討論。在此基礎(chǔ)之上，本研究對貝類褶牡蠣中的氨肽酶進行研究，探討其與風(fēng)味氨基酸形成的關(guān)系，以期對牡蠣制品的生產(chǎn)加工提供理論參考。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

1.1.1 樣品

新鮮牡蠣(Alectryonellaplicatula)，購于廈門市集美菜市場。

1.1.2 試劑

DEAE-sepharose瓊脂糖凝膠陰離子交換層析樹脂、phenyl-sepharose 6-fast flow苯基瓊脂糖凝膠疏水層析樹脂，美國GE Healthcare公司；羥基磷灰石層析預(yù)裝柱、Protein Marker、SDS、DTT，美國Bio-Rad公司；PMSF、EDTA、EGTA、bestatin，美國Sigma公司；Lys-MCA、Arg-MCA和其他熒光合成底物，日本Peptide Institute公司；pepstatin A，德國Roche公司；E-64，美國Amresco公司。其他試劑為分析純。

1.2 實驗方法

1.2.1 酶活力測定

酶活力測定參照Umetsu等[10]并作適當修改。先將50 μL酶液與900 μL 25 mmol/L磷酸緩沖液(緩沖液 A，pH值7.0，含質(zhì)量分數(shù)0.02 % NaN3和10 mmol/L β-巰基乙醇)混勻，再加入50 μL 10 μmol/L Lys-MCA熒光底物，在35 ℃反應(yīng)15 min后立即加入1.5 mL終止液(V(甲醇)∶V(異丙醇)∶V(水)=35∶30∶35)終止反應(yīng)。用熒光分光光度計測定反應(yīng)釋放產(chǎn)物7-氨基-4-甲基香豆素(AMC)的熒光強度。測定的激發(fā)光波長為380 nm，發(fā)射光波長為450 nm。活力單位(U)定義為每min釋放1 nmol AMC時需要的酶量。以同樣的反應(yīng)體系但不加酶液的樣品為空白對照組。

1.2.2 蛋白質(zhì)濃度測定

酶純化過程中，用紫外分光光度計測定280 nm處的吸光值，推測蛋白質(zhì)含量。

1.2.3 酶的純化

新鮮牡蠣去內(nèi)臟，洗凈、切碎。取350 g，與3倍體積含10 mmol/L β-巰基乙醇的冰冷緩沖液A混勻，用組織搗碎機搗碎。將搗碎后的粗酶液以12 000 r/min離心15 min，取上清液進行硫酸銨分級沉淀，質(zhì)量分數(shù)60%～80%，離心得沉淀，對緩沖液A進行充分透析。將透析過的酶液上樣于以緩沖液A平衡好的DEAE-sepharose陰離子交換層析柱(2.5 cm×10 cm)。上樣結(jié)束后，先用緩沖液A流洗除去未吸附的雜蛋白質(zhì)，再用0～0.3 mol/L NaCl作線性洗脫。測定A280，檢測并收集酶活性較高的組分。

將活性部分邊攪拌邊加入硫酸銨至終濃度為1.5 mol/L，上樣于以1.5 mol/L(NH4)2SO4和含10 mmol/L β-巰基乙醇的緩沖液A平衡的phenyl sepharose 6-fast flow疏水層析柱(2.5 cm×7 cm)。待流洗去除雜蛋白質(zhì)后，用(NH4)2SO4(1.5至0 mol/L)進行線形梯度洗脫。將樣品進行A280檢測和酶活測定后，收集活性部分并以緩沖液A為外液進行透析。

將透析充分的樣品上樣于以緩沖液A平衡好的羥基磷灰石預(yù)裝柱(5 mL)，流洗除去雜蛋白質(zhì)。用 20～200 mmol/L 緩沖液A作線性梯度洗脫。測定A280和酶活力，得到的活性部分進行電泳檢測。

1.2.4 分子質(zhì)量的確定和肽質(zhì)量指紋圖譜測定

結(jié)合Superdex G-200凝膠過濾和SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)對純化的蛋白質(zhì)進行分子質(zhì)量測定。對SDS-PAGE上呈現(xiàn)的純化蛋白質(zhì)條帶切膠回收，進行質(zhì)譜分析并在NCBI蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫中進行氨基酸序列比對。

1.2.5 最適底物測定

1.2.6 動力學(xué)參數(shù)測定

將酶稀釋成合適的濃度，以Lys-MCA為底物，在不同底物終濃度的條件下測定酶活性，計算不同濃度下酶催化底物反應(yīng)的平均速率。按照Lineweaver-Burk雙倒數(shù)法，求得酶催化底物水解的米氏常數(shù)Km及相應(yīng)的動力學(xué)參數(shù)kcat和kcat/Km。

1.2.7 最適溫度及熱穩(wěn)定性測定

在20～60 ℃，不改變上述酶活測定方法的其他條件，測定酶的最適作用溫度。熱穩(wěn)定性分析是將酶液分別于上述溫度下孵育30 min后，立即冰浴冷卻到對應(yīng)溫度，再參照酶活測定方法在35 ℃測定其剩余活力。

1.2.8 最適pH值及pH穩(wěn)定性

實驗在以下緩沖液(濃度均為50 mmol/L)中進行：乙酸鈉(pH值5.0～5.5)、磷酸鈉(pH值6.0～7.0)、Tris-HCl(pH值7.5～8.5)和Na2CO3-NaHCO3(pH值9.0)，其他測定條件不變。pH穩(wěn)定性分析是將酶液分別于上述不同pH值條件下，4 ℃孵育4 h后，再參照酶活測定方法在pH值7.0時，測定其剩余活力。

1.2.9 抑制劑對酶活性影響的測定

將酶液置于緩沖液A中，分別加入各種蛋白酶抑制劑至相應(yīng)的終濃度，在室溫下放置30 min后，立即加入50 μL熒光底物，于35 ℃反應(yīng)10 min，加入1.5 mL終止液后測定。以不添加抑制劑的樣品為對照。

1.2.10 圓二色譜分析

制度是學(xué)校管理必不可少的利器，正所謂“沒有規(guī)矩，不成方圓”。為此，農(nóng)村學(xué)校必須要完善寄宿制的管理制度，制定詳細的可執(zhí)行的制度，比如《宿舍管理制度》《文明宿舍評比制度》等，這些制度能夠一定程度上保證住宿生行為有章可循。

在室溫條件下，利用Chirascan圓二色譜儀對純化的牡蠣氨肽酶B進行二級結(jié)構(gòu)的測定，所使用的比色皿厚度為0.1 cm，測定參數(shù)為：掃描波長180～260 nm，掃描速度1 nm/s，光譜間隔1 nm，反應(yīng)時間2 s。利用CDNN軟件對樣品的二級結(jié)構(gòu)進行分析。

1.2.11 雙向電泳

1.2.11.1 等電聚焦

濃縮后的氨肽酶樣品與水合液(7 mol/L尿素，2 mol/L硫脲和質(zhì)量濃度2 g/mL CHAPS)、1 mol/L

DTT、兩性電解質(zhì)和溴酚藍以合適的比例混合，配置成150 μL的樣品溶液，混合均勻。將125 μL的樣品溶液連續(xù)加樣于干燥的電泳槽兩級間并用甘油覆蓋，設(shè)定程序，進行等電聚焦。

1.2.11.2 SDS-PAGE

聚焦結(jié)束后，將膠條洗凈，吸去多余水分，依次在含有質(zhì)量濃度2 g/mL DTT和質(zhì)量濃度2.5 g/mL IAA的緩沖液中平衡。平衡完畢后，推入SDS-PAGE凝膠電泳膠板縫隙中，封膠凝固后進行電泳。電泳完畢后進行銀染色，觀察結(jié)果并完成凝膠成像分析。

2 結(jié)果與討論

2.1 純化結(jié)果

DEAE-sepharose陰離子交換層析及羥基磷灰石柱層析圖譜見圖1。純化結(jié)果見表1，最終產(chǎn)物的比活力為416.0 U/mg。

圖1 氨肽酶純化柱層析圖Fig.1 Column chromatography purification of AP

表1 褶牡蠣氨肽酶分離純化結(jié)果

2.2 分子質(zhì)量和肽質(zhì)量指紋圖譜分析

2D-PAGE由等電聚焦和SDS-PAGE凝膠電泳兩個過程組成，可以從等電點和分子質(zhì)量上對蛋白質(zhì)進行分析。純化的氨肽酶在雙向電泳上呈現(xiàn)單一的點，其等電點約為5.8，分子質(zhì)量約為100 ku(見圖2)，與牙鲆肌肉中的賴氨酸氨肽酶(100 ku)[7]、青魚肌肉中的嘌呤霉素敏感性氨肽酶(100 ku)[9]的分子質(zhì)量相當，比阿拉斯加鱈魚中提取的丙氨酸氨肽酶(125 ku)[11]的分子質(zhì)量小，而比菜豆葉中的5種氨肽酶(37～80 ku)[12]的分子質(zhì)量大。這些結(jié)果表明，不同生物來源的氨肽酶分子質(zhì)量不同。

圖2 氨肽酶分子質(zhì)量與等電點鑒定Fig.2 Identification of molecular weight and pI of purified AP

圖3 褶牡蠣氨肽酶B肽質(zhì)量指紋圖譜Fig.3 Peptide mass fingerprinting of APB

褶牡蠣氨肽酶肽質(zhì)量指紋圖譜見圖3。將純化的單一目的蛋白質(zhì)切膠用于質(zhì)譜分析，在質(zhì)荷比800～4 000 u獲得12個肽段共計138個氨基酸殘基(見圖3(a))。將獲得的片段與NCBI軟體動物數(shù)據(jù)庫比對，發(fā)現(xiàn)與太平洋牡蠣的嘌呤敏感性氨肽酶(gi|405977525)序列相似性為100%(138/138)，結(jié)果如圖3(b)。該結(jié)果充分說明純化的酶為氨肽酶。Ogawa等[13]通過模擬催化口袋及定點突變的方式確定了Gln169是決定人APB切割堿性氨基酸偏好性的關(guān)鍵位點，同時M1家族中ERAP1的Gln181賦予酶對堿性氨基酸的偏好性。但是，目前還沒有關(guān)于水產(chǎn)貝類氨肽酶氨基酸偏好性關(guān)鍵位點的研究。通過已有序列比對，預(yù)測褶牡蠣氨肽酶的Gln135為影響其底物特異性的關(guān)鍵位點(見圖3(c))。因此，后期可通過定點突變實驗進行驗證。

2.3 最適溫度和熱穩(wěn)定性、最適pH值和 pH穩(wěn)定性分析

氨肽酶催化Lys-MCA水解反應(yīng)的最適溫度為35 ℃，見圖4(a)。當溫度高于50 ℃時，酶活力迅速降低；而低溫下，酶仍具有較高的活性，如在20 ℃下，APB有 50%左右的酶活力。熱穩(wěn)定性表現(xiàn)為，該酶在40 ℃下放置30 min，活力基本保持不變；而酶在55 ℃下放置10 min，酶活幾乎全部喪失，說明其熱穩(wěn)定性較差。褶牡蠣氨肽酶的熱穩(wěn)定性與從其他魚中得到的氨肽酶的特性相似，但與哺乳動物相比有明顯不同，如從牛骨骼肌肉中得到的一種氨肽酶，在 60 ℃溫度下放置 20 min，酶活力仍較穩(wěn)定[14]。該氨肽酶熱穩(wěn)定性較差與牡蠣正常棲息水溫為10～25 ℃相關(guān)。酶催化Lys-MCA水解反應(yīng)最適pH值為 7.0(見圖4(b))。在pH值6.0～8.0，酶活性能保持良好，而當pH值低于6.0或高于8.0時，酶活力迅速下降直至完全喪失，表明該氨肽酶是中性或弱堿性酶。褶牡蠣氨肽酶在中性條件下活性較強，且在pH值6.0～8.0穩(wěn)定，這種特性與魚類及牛[14]肌肉中純化的氨肽酶相似。

圖4 褶牡蠣氨肽酶的最適條件Fig.4 Optimum condition of AP

2.4 底物特異性

褶牡蠣氨肽酶對不同底物作用的相對活性見表2，該酶最易分解堿性氨基酸底物L(fēng)ys-MCA和Arg-MCA，對Leu-MCA也有一定的分解作用，但對Pro-MCA、Gly-MCA幾乎不分解。根據(jù)其對堿性氨基酸的偏好，將其命名為氨肽酶B。同時，該APB對Boc-Phe-Ser-Arg-MCA和Boc-Leu-Gly-Arg-MCA等內(nèi)切酶底物沒有分解作用，表明該酶屬于外肽酶。在前期研究中發(fā)現(xiàn)，海洋貝類的呈味物質(zhì)濃度與季節(jié)變化關(guān)系密切[15]。另有研究表明，精氨酸等對貝類的特有風(fēng)味有貢獻，含量越高，醇厚感越濃厚[16]，同時可增強鮮味和口感的復(fù)雜性[17]。所以，推測 APB在牡蠣風(fēng)味的形成中有重要的作用。

2.5 酶動力學(xué)分析

分別以Lys-MCA、Arg-MCA、Ala-MCA、Leu-MCA為底物，用雙倒數(shù)法測定褶牡蠣APB的動力學(xué)參數(shù)，結(jié)果如表3。

表2 褶牡蠣氨肽酶的底物特異性分析

表3 褶牡蠣氨肽酶B的動力學(xué)參數(shù)分析

由表3可知，該酶對Arg-MCA的親和能力最強，而對Lys-MCA和Arg-MCA的水解效率最高，再次驗證了該酶對于堿性氨基酸的偏好性。

2.6 蛋白酶抑制劑對酶活性的影響

各種蛋白酶抑制劑對褶牡蠣APB活性的影響如表4。氨肽酶特異性抑制劑bestatin、天冬氨酸蛋白酶抑制劑pepstatin A和金屬蛋白酶抑制劑1,10-phenathroline能有效抑制該酶活性，EGTA、EDTA則部分抑制其活性。因此，推測在該酶的活性基團附近存在天冬氨酸殘基，是一種金屬蛋白酶類的氨肽酶。

表4 蛋白酶抑制劑對褶牡蠣氨肽酶B活性的影響

2.7 金屬離子對酶活性的影響

金屬蛋白酶分為兩大類，一類僅需要一個Zn2+，另一類需要兩個金屬離子共同起催化作用[18]。為探明褶牡蠣APB活性中心的金屬離子，用含有終濃度為1 mmol/L EDTA的緩沖液對APB樣品進行透析，測得透析后樣品的活性比未透析時損失近70%(見圖5)。透析后，樣品中分別添加0.1 mmol/L的二價金屬離子Ca2+、Mn2+、Fe2+，其活性有不同程度的恢復(fù)，分別可恢復(fù)到未透析前的62.8%，54.8%和48.3%。Zn2+對于褶牡蠣APB沒有激活作用反而顯示出輕微抑制作用，該結(jié)果與來源于其他水產(chǎn)動物的氨肽酶不同，但與小鼠APB的結(jié)果相似，即0.01 mmol/L的Zn2+作用于小鼠APB 45 min后也能抑制60%的酶活[19]。不同氨肽酶對金屬離子的需求比較多樣，這可能與氨肽酶的類型有關(guān)。對于褶牡蠣APB，Ca2+、Mn2+可能是維持其活性的2種重要金屬離子。

圖5 金屬離子對EDTA充分透析后APB活性的影響Fig.5 Effect of metal ions on activity of APB after dialysis by EDTA

2.8 酶的二級結(jié)構(gòu)

采用圓二色光譜研究褶牡蠣APB的二級結(jié)構(gòu)特征(見圖6)。結(jié)果顯示：APB在195 nm處有一處正峰，在220 nm處出現(xiàn)一個負峰，綜合分析顯示APB二級結(jié)構(gòu)中以無規(guī)卷曲與反向平行為主，其中無規(guī)卷曲占42.6%，反向平行占32.0%。

圖6 褶牡蠣氨肽酶B的二級結(jié)構(gòu)Fig.6 Secondary structures of APB

2.9 氨基酸調(diào)控

褶牡蠣APB與其產(chǎn)物的相互作用的研究結(jié)果如圖7, 賴氨酸及精氨酸對氨肽酶B具有反饋調(diào)節(jié)作用，抑制效果明顯，且兩者共同作用具有拮抗效果，三者位于機體內(nèi)呈現(xiàn)出動態(tài)平衡，以適應(yīng)各種生理功能的需要。游離氨基酸含量增加的同時氨肽酶仍具有活性[4]，而游離氨基酸含量的增加對氨肽酶活性也有反饋抑制作用，這一結(jié)果與游離氨基酸反饋調(diào)節(jié)人與豬的精氨酸氨肽酶[20]的情況相符。

圖7 賴氨酸和精氨酸對氨肽酶B的反饋調(diào)節(jié)作用Fig.7 Feedback regulation of lysine and arginine on APB

3 結(jié) 論

研究從褶牡蠣中分離純化得到一種氨肽酶B，分子質(zhì)量約100 ku，等電點約為5.8。肽質(zhì)量指紋質(zhì)譜結(jié)果顯示，褶牡蠣氨肽酶B與太平洋牡蠣的嘌呤敏感性氨肽酶具有高度的同源性。其催化Lys-MCA水解反應(yīng)的最適溫度為35 ℃，最適pH值為7.0。該酶能高效水解蛋白質(zhì)肽鏈N端賴氨酸和精氨酸殘基。

賴氨酸及精氨酸的形成，使得牡蠣醇厚味感更加濃厚，而后兩者協(xié)同反饋調(diào)節(jié)APB、游離氨基酸和氨肽酶形成動態(tài)平衡，共同賦予牡蠣特有的風(fēng)味。

褶牡蠣APB分離純化方法及生化性質(zhì)分析，為今后研究氨肽酶及在食品加工中的應(yīng)用和新功能的探究提供了依據(jù)。

[1] 農(nóng)業(yè)部漁業(yè)局. 中國漁業(yè)年鑒2015 [M]. 北京: 中國農(nóng)業(yè)出版社，2016：222.

[2] LUISA C, ANA L C, PAULA V, et al. Purification of a novel aminopeptidase from the pollen ofParietariajudaicathat alters epithelial integrity and degrades neuropeptides [J]. Journal of Allergy and Clinical Immunology, 2006, 118(4):878-884.

[3] ALPONTI R F, SILVEIRA D F. Adipocyte aminopeptidases in obesity and fasting [J].Molecular and Cellular Endocrinology, 2015，415:24.

[4] PRIETO I, MARTNEZ J M, RAMREZ M J, et al. Aminopeptidase activities after water deprivation in male and female rats [J]. Regulatory Peptides, 2001, 101(1/3):189-194.

[5] LIU P, HUANG M, SONG S, et al. Sensory characteristics and antioxidant activities of Maillard reaction products from soy protein hydrolysates with different molecular weight distribution [J]. Food Bioprocess Technology, 2012, 5(5):1775-1789.

[6] BADAL C S, KIYOSHI H. Debittering of protein hydrolyzates [J]. Biotechnology Advances, 2001, 5(19):355-370.

[7] 陳曦,蔡秋鳳,曹敏杰.牙鲆肌肉賴氨酸氨肽酶的分離純化與性質(zhì)研究[J].中國食品學(xué)報,2012, 12(6):22-29. CHEN X, CAI Q F, CAO M J.Purification and characterization of an aminopeptidase with highest preference for lysine fromParalichthysolivaceusskeletal muscle[J]. Journal of Chinese Institute of Food Science and Tech-nology,2012,12(6):22-29.

[8] WU G P, CAO M J, CHEN Y, et al. Leucine aminopeptidase from red sea bream (Pagrusmajor) skeletal muscle: purification, characterization, cellular location, and tissue distribution [J]. Journal of Agricultural and Food Chemistry, 2008, 56(20):9653-9660.

[9] LI S W, LIN L P, WU G P, et al. Purification and biochemical characterization of a puromycin-sensitive amino-peptidase from black carp muscle [J].Process Biochemi-stry, 2015, 50(7):1061-1067.

[10] UMETSU H, ARAI M, OTA T, et al. Purification and properties of an aminopeptidase from the mid-gut gland of scallop (Patinopectenyessoensis) [J].Comp Biochem Physiol, 2003, 136(4):935-942.

[11] CHIOU T K，MATSUI T，KONOSU S. Purification and properties of an aminopeptidase from alaska pollack,Theragrachalcogramma，roe [J]. Journal of Biochemi-stry, 1989, 105(4):505-509.

[13] OGAWA Y, OHNISHI A, GOTO Y, et al. Role of glutamine-169 in the substrate recognition of human amino-peptidase B [J]. Biochimica et Biophysica Acta, 2014, 1840(6):1872-1881.

[14] YE X J, NG T B. Purification and characterisation of an alanine aminopeptidase from bovine skeletal muscle [J]. Food Chemistry, 2011, 124(2):634-639.

[15] 孫莎，鐘嬋，章騫，等.四種海產(chǎn)貝類中主要呈味物質(zhì)含量與季節(jié)變化的關(guān)系[J].集美大學(xué)學(xué)報(自然科學(xué)版),2016,21(6)：420-427. SUN S, ZHONG C, ZHANG Q, et al. Seasonal variation of taste-active component contents in four species of marine shellfish[J]. Journal of Jimei University( Natural Science),2016,21(6):420-427.

[16] CHEN D W, ZHANG M. Non-volatile taste active compounds in the meat of Chinese mitten crab (EriocheirSinensis) [J]. Food Chemistry, 2007, 104(3):1200-1205.

[17] KOHYAMA K. Oral sensing of food properties [J]. Journal of Texture Studies, 2015, 46(3):138-151.

[18] BOTELHO T, TIBISAY G, ANIEBRYS M, et al. Structural and functional analyses reveals thatStaphylococcusaureusantibiotic resistance factor HmrA is a zinc-dependent endopeptidase [J]. Journal of Biological Chemistry, 2011, 286(29):25697-25709.

[19] HWANGA S R, HOOK V. Zinc regulation of aminopeptidase B involved in neuropeptide production [J]. Febs Letters, 2008, 582(17): 2527-2531.

[20] TOLDRA F, FLORES M, MANTLE D. Comparison of aminopeptidase inhibition by amino acids in human and porcine skeletal muscle tissuesinvitro[J]. Comparative Biochemistry and Physiology Part B: Biochemistry and Molecular Biology, 1996, 115(4):445-450.

(責(zé)任編輯：檀彩蓮)

Purification and Characterization of Aminopeptidase B from Oysters (Alectryonellaplicatula)

TANG Yi1, YAN Longjie1, ZHONG Chan1, ZHANG Lingjing1,2, WENG Ling1,2, CAO Minjie1,2,*

(1.CollegeofFoodandBiologicalEngineering,JimeiUniversity,Xiamen361021,China; 2.NationalandLocalJointEngineeringResearchCenterofDeepProcessingforAquaticProducts,Xiamen361021,China)

Aminopeptidase is a kind of exopeptidases that specifically cleaves amino acids from the N-terminal of proteins, and thus has wild applications in food industry. In this study, an aminopeptidase was isolated to homogeneity from oysters (Alectryonellaplicatula) by ammonium sulfate fractionation and a series of chromatographic steps including DEAE-sepharose, phenyl-sepharose and hydroxyapatite. The aminopeptidase was strongly suppressed by bestatin, a specific aminopeptidase inhibitor. The 2D-PAGE results showed that molecular weight andpIvalue was approximately 100 ku and 5.8. By MALDI-TOF/TOF mass spectrometry analysis, 12 peptide fragments with 138 amino acid residues in total were obtained and these peptide fragments were identical to a puromycin-sensitive aminopeptidase fromCrassostreagigas, which confirmed that the purified enzyme was an aminopeptidase B. Circular dichroism spectroscopy analysis indicated that the secondary structure of aminopeptidase B (APB) was mainly random coil (42.6%) and reverse parallel (32.0%). TheKmandkcatwas 1.5 μmol/L and 117.5 s-1and thekcat/Kmwas 78.3 L/(μmol·s)-1. The optimum temperature and pH of APB was 35 ℃ and 7.0. Under these conditions, APB could hydrolyze Lys-MCA and Arg-MCA to release Lys and Arg, which had the oyster’s flavor.

oyster; aminopeptidase; purification; MALDI-TOF/TOF mass spectrometry

2017-01-02

國家自然科學(xué)基金資助項目(31471640)； 廈門南方海洋研究中心項目(14CZP030HJ04)。

唐 逸，女，碩士研究生，研究方向為水產(chǎn)品加工；

10.3969/j.issn.2095-6002.2017.01.006

2095-6002(2017)01-0035-08

唐逸，顏龍杰，鐘嬋，等. 褶牡蠣氨肽酶B的分離純化和性質(zhì)研究[J]. 食品科學(xué)技術(shù)學(xué)報，2017,35(1):35-42. TANG Yi, YAN Longjie, ZHONG Chan, et al. Purification and characterization of aminopeptidase B from oysters (Alectryonellaplicatula)[J]. Journal of Food Science and Technology, 2017,35(1):35-42.

TS254.1

A

*曹敏杰，男，教授，博士，主要從事蛋白質(zhì)化學(xué)、酶學(xué)、水產(chǎn)品深加工方面的研究，通信作者。