一株產(chǎn)黑色素黑蒜發(fā)酵菌的分離與鑒定

姬妍茹， 劉 玉， 楊慶麗， 劉宇峰, 石 杰， 董 艷， 張正海,2

(1.黑龍江省科學(xué)院 大慶分院， 黑龍江 大慶 163319；2.黑龍江八一農(nóng)墾大學(xué) 生命科學(xué)技術(shù)學(xué)院， 黑龍江 大慶 163319)

一株產(chǎn)黑色素黑蒜發(fā)酵菌的分離與鑒定

姬妍茹1， 劉 玉1， 楊慶麗1， 劉宇峰1, 石 杰1， 董 艷1， 張正海1,2

(1.黑龍江省科學(xué)院 大慶分院， 黑龍江 大慶 163319；2.黑龍江八一農(nóng)墾大學(xué) 生命科學(xué)技術(shù)學(xué)院， 黑龍江 大慶 163319)

黑色素是一類由植物或者微生物產(chǎn)生的色素，在食品、化妝品和醫(yī)藥領(lǐng)域具有廣闊的應(yīng)用前景。從黑蒜發(fā)酵96 h樣品中篩選出1株產(chǎn)黑色素的細(xì)菌S8nyzx-1，對菌株進(jìn)行形態(tài)學(xué)和分子生物學(xué)鑒定，采用紫外可見分光光譜和紅外光譜掃描測定其所產(chǎn)黑色素特性，并進(jìn)行短時耐高溫能力測試。結(jié)果表明，在LB培養(yǎng)基上，菌落邊緣較整齊，表面干燥，有褶皺，白色不透明，周圍有少量棕色色素產(chǎn)生，16S rDNA測定核苷酸序列為1 419 bp，與枯草芽孢桿菌(Bacillussubtilis)同源性達(dá)99.8%。具有短時耐高溫能力，可耐受93 ℃水浴10 min。由紫外分光光度法測得S8nyzx-1所產(chǎn)黑色素在370～390 nm左右有一個較強(qiáng)吸收峰；紅外光譜分析黑色素具有吲哚結(jié)構(gòu)的吸收峰，結(jié)合該菌可利用L-酪氨酸的特性，推測其為真黑色素。

枯草芽孢桿菌； 黑色素； 黑蒜； 鑒定； 紅外光譜

黑色素是一類由微生物或者動植物產(chǎn)生的棕色或者黑色色素，是一種非均質(zhì)的類多酚聚合體，結(jié)構(gòu)復(fù)雜。黑色素具有抗紫外線、抗氧化、防衰老、清除自由基的特性。產(chǎn)黑色素的細(xì)菌種類較多，來源廣泛。一是來源于土壤的菌種，Aghajanyan等[1]從土壤中分離到的蘇云金芽孢桿菌可產(chǎn)生水溶性黑色素，Tarangini等[2]分離并鑒定的土壤微生物沙福桿菌。二是來源于海水的菌種，Ganesh等[3]從紅色海藻中分離出一株施氏假單胞菌，朱琳等[4]從山東近岸海水中分離得到一株產(chǎn)黑色素細(xì)菌S1初步鑒定為明亮發(fā)光桿菌 (Photobacteriumphosphoreum)。三是來源于毛發(fā)的菌種，張麗香等[5]從人的頭發(fā)樣品中篩選出1株產(chǎn)黑色素枯草芽孢桿菌ZH168，并對其產(chǎn)的胞外黑色素進(jìn)行了紅外光譜分析，確定所產(chǎn)黑色素為真黑色素。目前沒有關(guān)于來源于植物大蒜的產(chǎn)黑色素細(xì)菌的報道。

黑蒜是由生蒜在控制環(huán)境溫、濕度條件下自然發(fā)酵而成的食品。加工過程主要包括低溫和高溫兩個熟化階段。高溫熟化階段主要包括Maillard反應(yīng)，焦糖化反應(yīng)等，卜利偉等[6]建立了加工時間與5-HMF含量關(guān)系的一級反應(yīng)動力學(xué)方程，初步揭示了Maillard反應(yīng)對白蒜變?yōu)楹谒獾呢暙I(xiàn)，并說明利用該動力學(xué)模型可以對黑蒜成熟與否和黑蒜品質(zhì)做出評判；低溫熟化階段主要發(fā)生的是酶促反應(yīng)，也是生蒜褐變的主要因素[6]。此階段溫度適合大蒜內(nèi)部微生物的生長，產(chǎn)生的次生代謝產(chǎn)物可能會對大蒜的熟化和褐變有一定促進(jìn)作用，因此對黑蒜加工過程中微生物的活動情況進(jìn)行研究非常必要。

目前，針對生大蒜內(nèi)生菌的研究有少量文獻(xiàn)報道，都是涉及拮抗菌篩選方面的內(nèi)容。鄧振山等[7]從大蒜鱗莖中分離出63株內(nèi)生菌并篩選出4株對番茄灰霉病具有離體防效的菌株；崔北米等[8]利用常規(guī)方法對大蒜鱗莖進(jìn)行內(nèi)生菌分離，獲得19株內(nèi)生細(xì)菌，菌株DSP6對供試的9種病原菌有較強(qiáng)的抑菌作用，經(jīng)16S rDNA鑒定為芽孢桿菌屬的Bacillusaxarquiensi。國內(nèi)外有關(guān)黑蒜工藝及功效方面的文獻(xiàn)較多，但是還沒有涉及發(fā)酵過程中微生物分離篩選方面的報道。本實驗擬從加工過程的黑蒜樣品中進(jìn)行微生物的分離和篩選，以期獲得能夠產(chǎn)黑色素的菌株。一方面豐富產(chǎn)黑色素菌種資源，另一方面為進(jìn)一步揭示黑蒜的形成機(jī)理提供數(shù)據(jù)佐證，為開發(fā)黑蒜發(fā)酵菌劑奠定實驗基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

大蒜為市售白皮分瓣蒜，購于黑龍江省阿城市，清選剝皮后裝入厚塑料袋內(nèi)，然后置于單位自主研制的發(fā)酵設(shè)備中進(jìn)行黑蒜加工，按不同時間點取出樣品用于實驗。

培養(yǎng)基：PDA培養(yǎng)基[9]，LB培養(yǎng)基[9]，添加L-酪氨酸的LB培養(yǎng)基(簡稱L-Tyr)。

細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒、PCR試劑盒，上海生工生物公司；DNA Marker 564bp/21226bp、柱式DNA膠回收試劑盒，上海生工生物公司；合成多巴黑色素(dihydroxypheny-lalanine，DOPA)標(biāo)準(zhǔn)品購自Sigma公司，其他試劑均采用國產(chǎn)分析純。

BSC- 1360ⅡA2型生物安全柜，北京東聯(lián)哈爾儀器制造有限公司；DYY- 5型電泳儀，北京六一儀器廠；FR980型凝膠像系統(tǒng)，上海復(fù)日科技儀器有限公司；PCR儀，東勝創(chuàng)新科技有限公司；BK- 5000型電子顯微鏡，重慶奧特光學(xué)儀器有限公司；LDZX- 40SCI型高壓蒸汽滅菌鍋，上海申安醫(yī)療儀器廠；HPX- 9082MBE型數(shù)顯電熱培養(yǎng)箱，上海博迅實業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠；HZQ- X100型振蕩培養(yǎng)箱，哈爾濱市東聯(lián)電子技術(shù)開發(fā)有限公司；UV- 759型紫外可見分光光度計；IR- 960型傅立葉變換紅外光譜儀，天津瑞岸科技有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 產(chǎn)黑色素細(xì)菌的分離和純化

取不同加工階段的黑蒜樣品，表面滅菌后，在無菌條件下磨碎后稱量5 g，加入45 mL無菌水中充分搖勻，吸取1 mL梯度稀釋后涂布到上述3種培養(yǎng)基上，置于30 ℃恒溫培養(yǎng)，選擇周圍顏色變黑的菌落劃線純化，置于4 ℃冰箱保存。

1.2.2 菌株的分子生物學(xué)鑒定

PCR擴(kuò)增方法參照文獻(xiàn)[10]進(jìn)行，擴(kuò)增產(chǎn)物委托上海生工生物工程技術(shù)有限公司進(jìn)行基因測序。

1.2.3 黑色素特性分析

黑色素的制備參照文獻(xiàn)[11]進(jìn)行。將發(fā)酵液離心后取上清液適當(dāng)稀釋，在200～900 nm范圍內(nèi)進(jìn)行紫外可見光譜掃描分析；黑色素粉末經(jīng)KBr處理壓片后進(jìn)行紅外光譜掃描分析，紅外光譜范圍為500～4 000 cm-1。

1.2.4 產(chǎn)黑色素菌株耐高溫測試

將產(chǎn)黑色素菌株活化后，以1%體積分?jǐn)?shù)接入PDA液體培養(yǎng)基中，30 ℃振蕩培養(yǎng)24 h，93 ℃水浴處理10 min,水浴處理前后均涂板計數(shù)，比較前后菌種數(shù)量變化情況。

2 結(jié)果與分析

2.1 S8nyzx-1菌株的分離及其產(chǎn)黑色素條件

從黑蒜加工過程中第96 h的樣本中分離到1株細(xì)菌S8nyzx-1。S8nyzx-1在不同培養(yǎng)基上菌落和細(xì)胞形態(tài)見圖1。

圖1 S8nyzx-1菌落、細(xì)胞形態(tài)及發(fā)酵液Fig.1 Melanin, clony morphology and microscopy morphology of S8nyzx-1

在LB平板上培養(yǎng)48 h后，觀察到的菌落特征為邊緣較整齊，表面干燥，有褶皺，白色不透明，周圍有少量棕色色素產(chǎn)生(圖1a)。在添加L-Tyr的固體培養(yǎng)基上產(chǎn)生的棕色色素顏色加深(圖1b)，這一點與張麗香等[5]報道的從毛發(fā)中分離的枯草芽孢桿菌表現(xiàn)一致。在PDA培養(yǎng)基上菌落生長旺盛，可產(chǎn)生較多胞外黑色素(圖1c)。菌株革蘭氏染色呈陽性，細(xì)胞桿狀，有芽孢(圖1d)。在參試的3種液體培養(yǎng)基中，只在PDA培養(yǎng)基中產(chǎn)黑色素(圖1e)說明葡萄糖或者馬鈴薯中的某種成分對黑色素的產(chǎn)生起重要的作用。

2.2 S8nyzx-1菌株的16S rDNA鑒定

對S8nyzx-1菌株進(jìn)行16S rDNA基因擴(kuò)增，結(jié)果見圖2。

M為分子質(zhì)量標(biāo)記；1，2列為S8nyzx-1的菌株DNA

由圖2可知，片段長度在1 375～1 584 bp，經(jīng)測序為1 419 bp，輸入NCBI進(jìn)行BLAST 比對，與Bacillussubtilissubsp. Subtilis的多個菌株相似度達(dá)99.8%，可確定S8nyzx-1菌株屬枯草芽孢桿菌菌群。

2.3 S8nyzx-1菌株短時耐高溫能力

黑蒜生產(chǎn)工藝為齒變式加熱，加工初期溫度緩慢上升，然后在75～93 ℃反復(fù)波動[12]，如果想利用該菌株作為發(fā)酵輔助劑，則要求其有一定的短時耐高溫能力，以保證在黑蒜生產(chǎn)初期起到促進(jìn)發(fā)酵和變黑的作用。

應(yīng)用Excel 2003軟件對S8nyzx-1菌株高溫水浴處理前后活菌數(shù)的對數(shù)值做出柱形圖，結(jié)果見圖3。

圖3 S8nyzx-1菌株93 ℃ 水浴10 min前后活菌數(shù)變化Fig.3 Changes of viable count in 93 ℃ water bath 10 min of strain S8nyzx-1

由圖3可知93 ℃高溫雖然在一定程度上抑制S8nyzx-1菌株的生長，但活菌數(shù)量仍可達(dá)到(1×106～1×107)CFU/mL,尤其在PDA液體培養(yǎng)中生長狀態(tài)更好。

2.4 S8nyzx-1菌株產(chǎn)黑色素特性分析

圖4 S8nyzx-1菌株黑色素紫外吸收圖譜Fig.4 Ultraviolet absorb curve of melanin from strain S8nyzx-1

對S8nyzx-1菌株所產(chǎn)黑色素進(jìn)行紫外可見光譜掃描，并應(yīng)用Excel 2003軟件將數(shù)據(jù)制成曲線圖，結(jié)果見圖4。由圖4可見，黑色素在可見光波長范圍內(nèi)無特征峰，呈現(xiàn)出吸光度隨波長增大逐漸減小的趨勢，這一點與合成黑色素極為相似，所不同的是S8nyzx-1菌株所產(chǎn)黑色素在紫外光區(qū)的強(qiáng)吸收峰出現(xiàn)在370～390 nm處，而合成黑色素在210 nm左右，這可能是因為兩種黑色素中所含有的生色團(tuán)和助色團(tuán)有所不同[13]，這一點從文獻(xiàn)資料中可以得到印證。例如李建波等[14]分離的奇異變形桿菌T4菌株所產(chǎn)黑色素在300～800 nm波長范圍內(nèi)無極值，閻春蘭等[15]從土壤中分離的鏈霉菌屬D-1菌株所產(chǎn)黑色素在可見光區(qū)域沒有特征吸收峰，但在240～250 nm處有一個強(qiáng)吸收峰。

圖5 S8nyzx-1菌株黑色素紅外吸收圖譜Fig.5 Infrared absorb curve of melanin from strain S8nyzx-1

圖6 黑色素標(biāo)準(zhǔn)品紅外吸收圖譜Fig.6 Infrared absorb curve of melanin from standard for melanin

3 結(jié)論與討論

從黑蒜發(fā)酵96 h大蒜瓣樣品中篩選出1株產(chǎn)黑色素的細(xì)菌S8nyzx-1，經(jīng)形態(tài)學(xué)鑒定和16S rDNA序列測定結(jié)果表明該菌屬于枯草芽孢桿菌菌群。S8nyzx-1菌株在相同的培養(yǎng)條件下，在L-Tyr固體培養(yǎng)基上產(chǎn)生黑色素的情況明顯好于LB固體培養(yǎng)基，說明該菌發(fā)酵所產(chǎn)黑色素以酪氨酸為底物，加之紅外光譜掃描顯示該菌具有典型的吲哚結(jié)構(gòu)吸收峰，因此初步推測為真黑色素。S8nyzx-1菌株無論是在固體和液體的PDA培養(yǎng)基均能良好生長，產(chǎn)生較多的胞外黑色素。將該菌株回接到生蒜上，在低溫熟化階段可加速黑色素的產(chǎn)生(已有實驗研究，數(shù)據(jù)在此沒有體現(xiàn))，說明馬鈴薯和大蒜中的營養(yǎng)成分對黑色素的產(chǎn)生起著重要的作用。S8nyzx-1菌株具有短時耐高溫能力，經(jīng)93 ℃高溫水浴處理10 min仍能較好地生長，可以考慮作為黑蒜發(fā)酵菌開發(fā)使用。

隨著人們健康理念的增強(qiáng)，對食品添加劑的來源及安全性要求越來越高。天然色素以其健康安全、富含營養(yǎng)、多功能的特點逐漸取代了合成色素的位置。黑色素具有清除自由基、抗氧化和預(yù)防衰老等功能，在黑色食品倍受推崇的今天尤其受到重視。本實驗中篩選到的S8nyzx-1菌株來源于大蒜內(nèi)部，健康安全，又能利用馬鈴薯和葡萄糖等低成本原料產(chǎn)黑色素，值得對其發(fā)酵條件進(jìn)行深入研究和優(yōu)化，為食用黑色素的開發(fā)提供新的資源。

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(責(zé)任編輯：李 寧)

Solation and Identification of Melanin Producing Bacteria from Fermented Black Garlic

JI Yanru1, LIU Yu1, YANG Qingli1, LIU Yufeng1, SHI Jie1, DONG Yan1, ZHANG Zhenghai1,2

(1.DaqingBranchofHeilongjiangAcademyofSciences,Daqing163319,China；2.CollegeofLifeScienceTechnology,HeilongjiangBayiAgriculturalUniversity,Daqing163319,China)

Melanin is produced by plants or micro-organisms, and has broad application prospects in the food, cosmetics and medicine. Bacteria S8nyzx-1 that can produce melanin was isolated from black garlic of 96h fermented. The strain was identified according to colony morphology and molecular biology. The structure characteristic of this melanin was identified using the techniques of UV and IR spectroscopy，and high temperature ability for a short time was determined. The results showed the colony was neat edges, white opaque, dry surface, wrinkled, and surrounded by a small amount of brown pigment on LB. 16S rDNA fragment (1 419 bp of size) was 99.8% of similarity withBacillussubtilis. The strain had a high ability of survive 10 min at 93 ℃ water bath. The melanin had strong absorption peak at 370-390 nm through UV and with the indole structure through IR, which was considered for eumelanin according the characteristics of the bacteria can use L-tyrosine.

Bacillussubtilis; melanin ; black garlic; identification; FT-IR

2015-11-11

黑龍江省科學(xué)院大慶分院促進(jìn)“三年行動計劃”功能食品平臺項目(PB15F004)。

姬妍茹，女，副研究員，主要從事食品生物技術(shù)方面的研究。

10.3969/j.issn.2095-6002.2017.01.009

2095-6002(2017)01-0059-05

姬妍茹，劉玉，楊慶麗，等. 一株產(chǎn)黑色素黑蒜發(fā)酵菌的分離與鑒定[J]. 食品科學(xué)技術(shù)學(xué)報，2017,35(1):59-63. JI Yanru, LIU Yu, YANG Qingli, et al. Solation and identification of melanin producing bacteria from fermented black garlic[J]. Journal of Food Science and Technology, 2017,35(1):59-63.

TS201.3

A